CC BY
73
637.04
ПОЛУЧЕНИЕ БИОАКТИВНЫХ ПЕПТИДОВ МОЛОКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИЗОЛИРОВАННОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА
И.М. ДАНИЛОВ, Л.А. ЗАБОДАЛОВА, H.H. СКВОРЦОВА
Санкт-Петербургский государственный университет низкотемпературных и пищевых технологий,
191002, г. Санкт-Петербург, ул. Ломоносова, 9; факс: (812) 315-28-27, тел.: (812) 764-47-88, электронная почта: [email protected], [email protected]
Исследовано влияние параметров ферментации: продолжительности и температуры термостатирования, фермент-суб-стратного соотношения, значения активной кислотности реакционной смеси - на накопление низкомолекулярных пептидов в молоке. В биологическом эксперименте показана их иммуномодуляторная активность.
Ключевые слова: панкреатин, ферментативный гидролиз,
В настоящее время ведутся интенсивные технологические и медико-биологические исследования с целью получения и выяснения роли многочисленных биологически активных пептидов в поддержании устойчивого гомеостаза организма. В этой связи перспективно исследование физиологического действия пептидных фрагментов, зашифрованных в аминокислотной последовательности белков молока.
Ввиду плейотропного характера влияния, а также в некоторых случаях множественной зависимости каждой физиологической функции от комплекса низкомолекулярных пептидов (НМП) молока большая часть их может быть классифицирована по физиологическому воздействию на системы организма: сердечно-сосудистую, нервную, иммунную и пищеварительную [1, 2]. Один из самых доступных способов получения биоактивных пептидов - использование в качестве гидролитических агентов пищеварительных ферментов [3, 4].
В рамках настоящих исследований было проведено изучение влияния основных параметров протеолиза белков молока изолированным ферментным препаратом «Панкреатин»: температуры и продолжительности ферментации, использования рН-статирования, фер-мент-субстратного соотношения.
Определение молекулярно-массового распределения гидролизатов и очистку фракции НМП проводили последовательно методом эксклюзионной аналитической и препаративной гель-хроматографии с 8ерЬаёех 0-75 и 0-50.
На основании экспериментальных данных установлено, что повышение температуры термостатирования до 43°С приводит к максимальному накоплению фракции НМП (73%) в реакционной смеси, дальнейшее повышение температуры нецелесообразно, так как приводит к постепенному снижению выхода искомой фракции.
При изучении влияния продолжительности ферментации на исследуемые показатели установили, что после 2 ч ферментации степень гидролиза белков начинает заметно увеличиваться (до 8 ч), а после 12 ч выдержки дальнейшего увеличения данного показателя
биоактивные пептиды.
не обнаружено. Максимальный выход НМП достигается при выдержке в течение 8ч- около 80%, при выдержке в течение 4 ч выход НМП составил 76%, что незначительно отличается от значений, полученных при 8-часовой выдержке. Поэтому последующие экспериментальные исследования проводили при продолжительности ферментации 4 ч.
Многокомпонентный препарат «Панкреатин» содержит различные протеолитические ферменты, оптимум действия которых отличается по значению активной кислотности. В связи с этим нами проведены исследования по установлению влияния рН на выход фракции НМП. Результаты показывают, что при pH 7,8-8,0 наблюдается максимум выхода искомой фракции, причем дальнейшее увеличение рН приводит к уменьшению данного показателя.
Ряд авторов указывают на возможность протекания автолитических процессов при использовании протео-литических ферментов. В связи с этим в наших экспериментальных исследованиях с целью исключения автолиза необходимое количество препарата добавляли через каждый час ферментации.
Имеются данные, свидетельствующие об активном высвобождении карбоксильных групп в процессе про-теолиза, которые снижают значение активной кислотности, что в свою очередь может ингибировать панкреатин. Нами проведены исследования по влиянию рН-статирования на выход НМП. Установлено, что данный фактор незначительно влияет на пептидный профиль гидролизатов, тогда как ионы натрия, накапливающиеся в реакционной смеси, в последующем могут отрицательно сказаться на пищевой ценности и органолептических характеристиках.
Максимальная степень расщепления белков способствует наибольшему накоплению низкомолекулярной фракции продуктов гидролиза. Так, при pH 8,0 выход НМП составляет примерно 77%.
При увеличении фермент-субстратного соотношения от 1 : 100 до 1 : 25 исследуемые показатели достигают максимальных значений. Дальнейшее увеличение доли фермента существенно не влияет на выход
НМП, тогда как степень гидролиза белков в целом продолжает незначительно увеличиваться. Поэтому значение фермент-субстратного соотношения принято 1 : 25.
В результате проделанной работы определены рациональные параметры проведения ферментативного гидролиза белков обезжиренного молока с целью получения фракции НМП: температура и продолжительность ферментации (43 ± 1)°С и 4 ч, рН 8,0, фермент-субстратное соотношение 1 : 25.
На основе изучения основных методических подходов определения биоактивности парафармацевтиков к оценке эффективности низкомолекулярной фракции пептидов молока была принята наиболее рациональная схема установления ее функциональной активности - это изучение влияние НМП на изменение фагоцитарного звена иммунной системы. В качестве лабораторных животных использовались линейные белые крысы 21-дневного возраста. Для каждой кратности эксперимента использовались животные одного помета. Препарат НМП вводили перорально в виде 1%-го раствора из расчета 2,5 мг фракции на животное. В течение всего эксперимента у особей контрольных и опытных групп не отмечалось каких-либо клинических признаков отклонений в состоянии здоровья. Не выявлено случаев изменения поведенческих реакций, шерсть животных сохраняла блеск и плотное прилегание, слизистые оболочки сохраняли естественный бледно-розовый цвет; признаков воспаления, патологических истечений и наложений не обнаружено. Сохранность всех подопытных животных в обеих группах была полной в течение всего срока эксперимента.
Одними из основных показателей, характеризующими структурно-функциональное состояние иммунной системы, являются бактерицидная и лизоцимная активность сыворотки крови (БАСК и ЛАСК соответственно). Учет величины антимикробных свойств сыворотки крови проводили фотоэлектронефелометри-ческим способом по методу [5]. Показатель лизоцим-ной активности сыворотки крови определяли фото-электроколориметрическим методом по [6]. Определение фагоцитарной активности лейкоцитов in vitro проводили по методу Е.А. Коста и М.И. Стенко (1947) [7]. Полученные результаты представлены в таблице.
Лизоцимная и бактерицидная активность сыворотки крови крыс увеличивается на 15,4 и 18,7% соответственно, что свидетельствует о модулирующем воздействии на иммунную систему.
Фагоцитарный индекс увеличился в 1,3 раза, фагоцитарная активность повыслась на 14,9%, фагоцитар-
|23456789 £ Продолжительность сквашивания, ч
Контроль * 2% паст. НМП 2% НМП
ное число - в 1,4 раза, что свидетельствует о повышении функциональной активности фагоцитирующей клетки.
Изучение основных показателей фагоцитоза установило, что пероральное введение препарата НМП оказывает иммуностимулирующее воздействие: увеличивается количество фагоцитов, их способность к захвату микроорганизмов и переваривающая способность.
Таким образом, пептидные фракции гидролизатов молока способны повысить иммунный статус организма посредством положительного влияния на неспецифическое звено иммунитета.
На заключительном этапе экспериментов была проведена выработка кефира с добавлением 2-2,5% НМП на стадии заквашивания молока, внесение большего количества НМП вызывает образование горьковатого привкуса.
Динамика кислотонакопления свидетельствует (рисунок), что в образцах с добавлением НМП титруемая кислотность повышается более интенсивно по сравнению с контрольным. Это, вероятно, обусловлено наличием дополнительных низкомолекулярных азотсодержащих ростовых веществ, содержащихся в добавке, которые стимулируют процессы метаболизма в первую очередь молочнокислых бактерий. Следует отметить, что непастеризованный препарат НМП вызывает более энергичное кислотонакопление по сравнению с препаратом прошедшим тепловую обработку ((87 ± 2)°С, 12-13 мин; пептидный профиль данных образцов не претерпевает значительных изменений), что может быть связано с накоплением гидролизатов белков молока вследствие ферментативной активности остатков препарата «Панкреатин». Органолептические показатели опытных и контрольных образцов отличались незначительно.
Таблица
Группа животных ЛАСК, % лизиса БАСК, % лизиса Е. coli Фагоцитарная активность %
Фагоцитарный индекс Фагоцитарная активность Фагоцитарное число
13 ± 0,82 66,4 ± 1,78 8,9 ± 1,74 74 ± 2,25 11,3 ± 1,56
(т* = 0,365; t** = 35,6) (т = 0,8; t = 83,48) (т = 0,78; t = 11,47) (т = 1,01; t = 73,18) (т = 0,7; t = 16,22)
15 ± 0,55 78,8 ± 1,12 11,96 ± 0,85 85 ± 4,55 15,29 ± 0,99
(т = 0,245; t = 61,24) (т = 0,5; t = 157,04) (т = 0,38; t = 31,44) (т = 2,03; t = 41,81) (т = 0,45; t = 34,36)
*т - ошибка средней арифметической, **t - критерий достоверности.
Таким образом, добавление НМП позволяет сократить продолжительность сквашивания молока, обогатить продукт биоактивными пептидами.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ашмарин И.П., Обухова М.Ф. Регуляторные пептиды, функционально непрерывная совокупность// Биохимия. - 1986.-51.
- № 4. - С. 531-545.
2. Bioactive components in milk and dairy products / Ed. by Young W. Park, Ph. D. 62 p. - 439 p.
3. Latent bioactive peptides in milk proteins: Proteolytic
activation and signi?cance in diary processing / M. Gobetti, L. Stepaniak,
M. DeAngelis et al. // Critical Reviews in Food Science and Nutrition. -2002. - 42. - P. 223-239.
4. Kilara A., Panyam D. Peptides from milk proteins and their properties // Critical Reviews in Food Science and Nutrition. - 2003. - 43.
- P.607-633.
5. Смирнова О.В., Кузьмина Т.А. Определение бактерицидной активности сыворотки крови методом фотонефелометрии // ЖМЭИ. - 1966. - № 4. - С. 8-11.
6. Баранов А.А., Дорофейчук В.Г. Лизоцим: теория и практика. - М.; Н. Новгород, 1999.
7. Аллергология и иммунология: национальное руково-
дство / Под ред. Р.М. Хаитова, Н.И. Ильиной. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. - С. 656.
Поступила 12.05.11 г.
OBTAINING OF BIOACTIVE PEPTIDES FROM MILK USING AN ISOLATED
ENZYME PREPARATION
I.M. DANILOV, L.A. ZABODALOVA, N.N. SKVORTSOVA
Saint-Petersburg State University of Refrigeration and Food Engineering,
9, Lomonosov st., Saint-Petersburg, 191002; fax: (812) 315-28-27, ph.: (812) 764-47-88, e-mail: [email protected], [email protected]
The influence of fermentation parameters such as duration and temperature of incubation, the enzyme-substrate ratio, the active acidity value of the of the reaction mixture on the accumulation of low-molecular weight peptides in milk by the pancreatin digestion. In the biological experiment shows their immune modulating activity.
Key words: pancreatin, enzymatic hydrolysis, bioactive peptides.
613.291:637.52
ВЛИЯНИЕ КОНЖАКА НА ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА СИСТЕМ НА ОСНОВЕ НАТИВНОГО КРАХМАЛА
А.И. ЖАРИНОВ, О.Н. АНТОНОВА
Московский государственный университет прикладной биотехнологии,
109316, г. Москва, ул. Талалихина, 33; тел./факс: (495) 677-03-32, электронная почта: [email protected]
Представлены результаты исследования бинарных систем конжака и крахмала, позволяющие повысить эффективность технологического использования данных систем, прогнозировать результативность применения композиции крахмал-конжак в зависимости от соотношения гидроколлоидов, вида среды гидратации.
Ключевые слова: конжак, крахмал, функционально-технологические свойства, гелеобразование, синерезис.
В современной технологии пищевых продуктов широко распространено использование гидроколлоидов - пищевых добавок, улучшающих консистенцию [1, 2]. Наиболее востребованным структурообра-зователем является крахмал. В отличие от крахмала гидроколлоид конжак (коньячная камедь) относительно недавно появился на рынке, но привлек внимание производственников благодаря своим уникальным вязкостным характеристикам [2, 3].
Информация о совместном использовании данных гидроколлоидов отсутствует. Целью работы было изучение влияния конжака на функционально-технологические свойства (ФТС) систем на основе нативного картофельного крахмала при проведении гидратации ВМС в различных средах.
В результате первичных исследований крахмалов установлено, что регулировку рН в моно- и бинарных системах целесообразно осуществлять с помощью
кислых или щелочных фосфатов до достижения рН среды 6,2-6,4.
Изучение индивидуальных ФТС крахмалов проводили при варьировании среды гидратации (Н2О, 2%-й раствор №01) на образцах, которые подвергали термообработке при температуре (72 ± 2)°С в течение 15 мин и последующему охлаждению. Выявлено, что введение 2%-й соли в систему ухудшает гелеобразующую способность крахмала, что показывает рост величины критической концентрации гелеобразования препарата крахмала с 6 до 7%.
Оценка структурно-механических свойств (СМС) крахмальных гелей по показателю предельного напряжения сдвига (ПНС) свидетельствует:
прочностные характеристики гелей возрастают с увеличением концентрации крахмала в системе;
введение 2%-й соли при равных концентрациях крахмала в системе повышает прочность гелей, исклю-
