Получение антигена реовируса типа 1 для тест-системы ИФА с целью выявления специфических антител в сыворотке крови крупного рогатого скота Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

ПОЛИСПЕЦИФИЧЕСКАЯ СЫВОРОТКА КАК СРЕДСТВО ЭКСТРЕННОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ РОТА-, КОРОНАВИРУСНОЙ И ЭШЕРИХИОЗНОЙ

ДИАРЕИ ПОРОСЯТ

Махмутов А.Ф.

Рзюме

Получена гипериммунная сыворотка против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи поросят. Изучены ее лечебнопрофилактические свойства на лабораторных животных и новорожденных поросятах. Лечебно-профилактическая эффективность сыворотки подтверждена в условиях хозяйства, стационарно-неблагополучного по инфекционным диареям поросят.

POLY SPECIFIC SERUM AS A MEAN OF URGENT PROPHYLAXIS AND TREATMENT OF PIGLETS ROTA-,CORONAVIRUS AND ESHERICHIAL DIARRHEA

Makhmutov A.F.

Summary

Hyperimmune serum against rota-, ^renav^s gastroenteritis and Escherichia coli diarrheas of pigs is received. Its treatment and prophylactic properties on laboratory animals and newborn piglets are studied. Treatment and prophylactic efficiency of serum is confirmed in the conditions of an economy, permanently-unsuccessful on infectious diarrheas of piglets.

УДК 619:616.98:578.823.2:636.2

ПОЛУЧЕНИЕ АНТИГЕНА РЕОВИРУСА ТИПА 1 ДЛЯ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ИФА С ЦЕЛЬЮ ВЫЯВЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Москвичев О.В., Гафаров Х.З.

ФГУ «Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных», г.Казань

Ключевые слова: антиген, реовирус, ИФА.

Key words: antigen, reovirus, ELISA.

Среди обширной группы вирусов, вызывающих респираторные болезни крупного рогатого скота, реовирусы являются наиболее слабо изученными. Впервые реовирус 1 типа был описан Sabin в 1959 году и отнесен к группе энтеровирусов ECHO-10. В названии реовирусы (reo -

respiratory - enteric - orphans) отражен тропизм к клеткам эпителия слизистой оболочки дыхательных путей и пищеварительного аппарата. (Sabin,1959). В 1965 году Международный комитет по номенклатуре и классификации вирусов принял решение на основании того, что реовирусы отличаются от ЕСНО более крупными размерами, способностью агглютинировать эритроциты 0 группы крови человека, патогенностью для новорожденных мышей с поражением печени, миокарда и нервных клеток, было предложено вынести их в отдельную группу. Реовирусы широко циркулируют среди населения, обуславливая определенную роль в этиологии острых респираторных заболеваний человека (Ритова В.В., Трофимов Н.М. 1977).

Впервые реовирусную инфекцию, у крупного рогатого скота, зарегистрировали в 1959г в США, затем в Бельгии, ФРГ и в других странах. В России исследования по изучению роли реовируса в патологии крупного рогатого скота не проводились, а широта и степень распространения реовирусной инфекции до сегодняшнего дня остаются вне поля зрения ветеринарной службы страны.

Реовирусы способны обуславливать пневмоэнтериты у телят в первые 3 месяца жизни, проявляющиеся клинически диареей, ринитом, лихорадкой и пневмонией. Установлено также, что у взрослых животных реовирусная инфекция протекает латентно и сопровождается снижением удоев у молочных коров (Rosen L.,1962; Wizigmann G., Reinhardt G., 1971 Böckmann J., 1976).

Сложная ассоциация различных вирусов, в том числе РС-, адено-, парво- и реовирусов, разнообразие спектра их поражений осложняет клиническую картину и в такой ситуации своевременная лабораторная диагностика, выбор средств, обеспечивающих профилактику, имеет первостепенное значение при решении проблемы сохранности молодняка.

Известно, что реовирусная инфекция независимо от того, вызывала ли она клинически выраженное заболевание или завершено бессимптомно, она всегда сопровождается появлением в крови вируснейтрализующих и антигемагглютинирующих антител (Rosen L., 1968; Morgolis G. et al., 1973). Проведенный нами серомониторинг популяций животных в отношении реовирусной инфекции в ряде скотоводческих молочных комплексов Республики Татарстан отчетливо демонстрировал, что выявляемые в РТГА антигемагглютинины в сыворотках крови являются показателем циркуляции реовируса типа 1 среди поголовья КРС (Москвичев О.В., Гаффаров Х.З., 2010).

Общепризнанно, что одним из современных направлений качественной ретроспективной диагностики является иммуноферментный анализ.

Целью настоящей работы явилось получение качественного антигена для тест-системы ИФА, определяющего её специфичность.

Материалы и методы. При разработке наборов ИФА, предназначенных для серологической диагностики инфекционных заболеваний, основным звеном является подготовка антигена. Он должен хорошо адсорбироваться на твердой фазе лунок планшета, выявлять антитела и не вызывать ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Для достижения этих целей, антиген должен быть максимально очищенным от клеточного дебриса.

Для получения антигена использовали реовирус типа I штамм «Reo 1 Lang». Вирусную массу наращивали в культуре клеток Vero. Вирус нейтрализовали раствором 1,2-аминоэтилазиридина 5% концентрации. Антиген для ИФА получали двумя различными способами. В первом случае вирус освобождали от клеток путем обработки вируссодержащей массы ультразвуком, используя ультразвуковой дезинтегратор Bandelin Sonoplus HD 3100, при частоте 22КГц, 6 раз по 30 секунд, освобождались от разрушенных частей клеток путем низкоскоростного центрифугирования, надосадок осаждали через градиент сахарозы имеющий концентрации от 10 до 30% с шагом 10%. Полученные фракции испытывали в ИФА с контрольными положительной и отрицательной сыворотками.

Во втором эксперименте освобождение вируса от клеток проводили методом трехкратного замораживания и оттаивания. Суспензию «осветляли» центрифугированием при 3000 об\мин в течение 1 часа. Полученный супернатант центрифугировали на ультрацентрифуге Beckman L2 при 30000 об/мин через 30% слой сахарозы в течении 1 часа. Полученную фракцию отмывали от сахарозы и адсорбировали на 96-луночные плоскодонные планшеты для иммунологических реакций из полистирола производства «Linbro» в дозе 3, 5 и 10 мкг/мл.

Контрольную положительную сыворотку к реовирусу типа 1 получали на крупном рогатом скоте, используя для иммунизации антиген, концентрированный, очищенный в градиенте плотности сахарозы при равновесном центрифугировании. Специфическая активность гипериммунной сыворотки в РТГА составила 1:1280 - 1:2560. В качестве контрольной отрицательной сыворотки использовали сыворотку крупного рогатого скота, несодержащую специфических антител к реовирусу. В реакции использовали конъюгат производства НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. ИФА выполняли по непрямому методу. Читку реакции производили на микропланшетном спектрофотометре «BioRad Model 680» при длине волны 490 нм.

В результате проведенных исследований, наиболее оптимальным оказался второй метод очистки реовируса, который позволил получить антиген в концентрации 0,490 мкг/см3 с гемагглютинирующей активностью 1:1024. Методом «шахматного» титрования определили, что

более специфичной оказалась доза антигена 5 мкг/мл, коэффициент специфичности которой составил 10,7.

Заключение. Проведенные исследования позволили изыскать наиболее эффективный режим очистки антигена реовируса, с оптимальной дозой адсорбции 5 мкг/мл на планшет, и была получена гипериммунная сыворотка КРС с титром в РТГА 1:1280 - 1:2560, используемая в ИФА в качестве контрольной положительной. Полученные результаты являются основой для дальнейших исследований по разработке непрямого варианта тест-системы ИФА, предназначенной для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота.

ЛИТЕРАТУРА: 1. Москвичев, О.В. Серомониторинг реовирусной инфекции крупного рогатого скота в ряде хозяйств Республики Татарстан / О.В. Москвичев, Х.З. Гаффаров // Ветеринарный врач.- 2010.-6.- С. 26-29. 2. Ритова, В.В. Реовирусы и их роль в инфекционной патологии человека и животных / В.В. Ритова, Н.М. Трофимов // Вопросы вирусологии.- 1977.2.- С. 134-141. 3. Сюрин, В.Н. Частная ветеринарная вирусология/ В.Н. Сюрин, Н.В.Фомина.- М., Колос, 1979. - 158-164 с. 4. Böckmann, J. Serologische erhebungen über die Verbreitung von reovirusinfektionen im österreichischen mastkälberstrapel. / J. Böckmann// Wien. tierärztl. mschr.-1976.- 63.- Р. 358-360. 5. Rosen, L. Reoviruses. / L. Rosen // New York, - 1968. - 35. 6. Sabin, A.B. Reoviruses. / A.B. Sabin // Science.- 1959.- 130.- Р. 1387. 7. Wizigmann,G. Untersuchungen über Reovirus-Infektionen beim Rind in der Bundesrepublik Deutschlan / G. Wizigmann, G. Reinhardt // Zbl. vet. med.-1971.- 18 - Р.564.

ПОЛУЧЕНИЕ АНТИГЕНА РЕОВИРУСА ТИПА 1 ДЛЯ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ИФА С ЦЕЛЬЮ ВЫЯВЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Москвичев О.В., Гафаров Х.З.

Резюме

В статье отражены результаты получения антигена реовируса типа 1 в качестве специфического компонента для тест-системы ИФА.

REOVIRUS ANTIGEN OF TYPE 1 RECEIVING FOR IFA TEST SYSTEM IN ORDER TO GET SPECIFIC ANTIBODIES IN THE CATTLE BLOOD SERUM

Moskvichev O.V., Gaffarov Kh.Z.

Summary

The article present the results of getting of an antigen of reovirus type 1, as a specific component for ELISA test-system.