CC BY
70
Новое в пищевых технологиях
Л.Н. ФЕДЯНИНА,
Т.К. КАЛЕНИК,
Н.Г. ПЛЕХОВА
Положительное действие ДНК из морских гидробионтов на врожденный иммунитет человека
Приводятся результаты изучения влияния биологически-актив-ных добавок к пище, ДНК из молок лососевых рыб, на некоторые показатели врожденного иммунитета человека. Показано положительное действие изучаемой ДНК из молок лососевых рыб, что является обоснованием целесообразности создания на ее основе функциональных продуктов питания.
Как известно, позиционирование биологически активных добавок (БАД) к пище и продуктов на их основе как лечебно-профилактических должно подтверждаться соответствующими научными исследованиями, основанными на принципах доказательной медицины [8, 10]. Одной из точек приложения действия БАД к пище и продуктов на их основе может быть система врожденного иммунитета человека, экспериментальное изучение некоторых факторов которой на модельной системе клеток периферической крови человека является весьма актуальным в настоящее время [7].
Важным компонентом системы врожденного иммунитета являются фагоцитирующие клетки крови (фагоциты), представленные в основном нейтрофилами. В силу специфической предназначенности фагоцитов к быстрой реакции на внедрение бактерий исследование их морфофункциональной активности под влиянием различных БАВ является важным показателем их активности [1, 2, 4, 5, 6, 11].
Целью настоящего исследования является определение степени воздействия БАД к пище, ДНК из молок лососевых рыб, на функциональную активность фагоцитов крови. В качестве показателей функциональной активности фагоцитов изучали их адгезивную способность и внутриклеточное содержание эктоферментов плазматической мембраны - 5'-нуклеотидазы и АТФ-азы.
Адгезивность, т. е. свойство клеток прикрепляться к определенным субстратам и задерживаться на них, является одним из факторов их активации, необходимым для осуществления последующих собы-
тий фагоцитоза, начиная от распластывания фагоцита на поверхности клетки-мишени и кончая перевариванием убитой клетки-мишени [4,
5, 7, 11].
Указанные эктоферменты плазматической мембраны фагоцитирующих клеток - 5'-нуклеотидаза и АТФ-аза - являются маркерами их функциональной активности. Снижение концентрации 5'-нуклеоти-дазы и повышение концентрации АТФ-азы характеризуют стимуляцию фагоцитирующих клеток и их преобразование из нестимулиро-ванного состояния в стимулированное [2, 5, 6].
В работе использовали БАД к пище, ДНК из молок лососевых рыб, разработанную учеными ТИНРО-Центра г. Владивостока по оригинальной технологии [3, 9]. Она содержит 79,02 % ДНК, 7,8 % белка, 2,1 % липидов и 10,68 % воды, представляет собой аморфный порошок светло-кремового цвета, растворимый в воде при нагревании и не растворимый в органических растворителях [3, 9].
Фракцию адгезирующих клеток получали из венозной крови практически здоровых людей - доноров. В ней подсчитывали количество нейтрофилов. К взвеси клеток добавляли ДНК в концентрациях от 0,0001 до 1 мг/мл. Контакт вещества с клетками составил 180, 150, 120, 90, 60 и 45 мин. По истечении времени клетки высушивали на воздухе, фиксировали в парах формалина, а затем окрашивали по методу Романовского-Гимзе в течение 30 мин. Окрашенный клеточный монослой отмывали от невключившегося красителя, высушивали, растворяли в изопропаноле. Затем измеряли оптическую плотность раствора на спектрофотометре «Multiscan Titertek Plus» («Flow lab.», Финляндия). В качестве контроля использовались образцы с раствором подкисленного изопропилового спирта, без клеток [1, 5].
Активность АТФ-азы и 5'-нуклеотидазы определяли по методу Г.Б. Кириличевой с соавторами [4]. После контакта с ДНК в монослой адгезированных клеток вносили субстрат для АТФ-азы (adenosine-5'-triphosphate (ICN) на основе трис-НО-буфера) и 5'-нуклеотидазы (adenosine-5'-monophosphate (ICN). Образцы оставляли в термостате при 37 °С с субстратом на АТФ-азу на 30 мин и на 5'-нуклеотидазу -на 60 мин. Реакцию останавливали добавлением смеси аскорбиновой и молибденовой кислот в соотношении 1:1. Через 20 мин результаты учитывали с помощью спектрофотометра «Multiscan Titertek Plus». В качестве контроля использовались образцы с растворами субстратов и смеси кислот без клеток.
Результаты исследований показали возрастание адгезивной способности фагоцитирующих клеток крови под влиянием ДНК (рис. 1).
Так, максимальные показатели адгезивной активности отмечались через 3 ч контакта клеток с ДНК почти при всех внесенных ее концентрациях (кроме концентрации 1 мг/мл, когда этот показатель был достигнут через 2,5 ч) и составили от 18,6 ± 0,7 % при
0,0001 мг/мл до 35,04 ± 2,5 % при 1 мг/мл. При воздействии ДНК в меньших концентрациях (0,0001 и 0,001 мг/мл) адгезивная активность
клеток возрастала в более короткий период, чем при остальных. Через 45 мин контакта показатели адгезии клеток при добавлении ДНК в вышеуказанных концентрациях составили 4,38 ± 0,3 и 4,01 ± 0,25 % соответственно.
т, %
□ 0,75 ч □! ч Н1,5 ч 0 2 ч Н2,5 ч В3 ч
Рис. 1. Показатели адгезивной активности фагоцитов крови после их контакта с ДНК из молок лососевых рыб
Нами установлено, что добавление ДНК к монослою фагоцитирующих клеток сопровождается отчетливым снижением активности 5'-нуклеотидазы их плазматической мембраны. На рис. 2 представлены данные, отражающие снижение внутриклеточного содержания этого фермента. Статистически значимо показатели отличались от контроля через 2 ч после внесения вещества в концентрации 0,001; 0,1 и 1 мг/мл (-10,4 ± 1,8; -14,7± 1,3 и -12,6 ± 0,9 % соответственно). Минимальные показатели активности этого фермента наблюдались через 3 ч после контакта с ДНК (соответственно -20,3 ± 1,7; -20,4 ± 1,3 и -18,4 ± 1,1 %) и оставались на данном уровне до конца срока наблюдения. Таким образом, нами выявлена стимуляция фагоцитирующих клеток в ответ на введение ДНК в концентрациях 0,001; 0,1 и 1 мг/мл.
Изменение активности АТФ-азы в фагоцитарных клетках крови при внесении ДНК было противоположным изменению активности 5'-нуклеотидазы, относительно равномерным и не зависело от используемой концентрации препарата (рис. 3).
На протяжении всего срока наблюдения показатели активности АТФ-азы были выше, чем значения для интактных клеток. Наибольшая активность фермента отмечалась в период от 2 ч до конца срока наблюдения и была дозозависимой.
□ 1 ч Ш2 ч 03 ч
Рис. 2. Активность 5'-нуклеотидазы плазматической мембраны фагоцитирующих клеток крови при их взаимодействии с ДНК из молок лососевых рыб
Т, % 25 20 15 10 5 0
Т ■ 1 1 1
I
= ' 1 Е = =
0,0001 0,001 0,01 0,1 1 ДНК,
мг/мл
В 1,5 ч 02 ч Н3 ч
Рис. 3. Активность АТФ-азы фагоцитов крови при взаимодействии с ДНК из молок лососевых рыб
Таким образом, наши данные показали усиление адгезивной активности фагоцитов под влиянием ДНК, что служит одним из механизмов реализации ее положительного влияния на макроорганизм. Система фагоцитов, являясь звеном быстрого реагирования, в свою очередь играет важнейшую роль в антибактериальной, противоопухолевой защите организма, в реакциях немедленной гиперчувствитель-
ности и т. п. [7]. В ряде случаев снижение уровня адгезии клеток сопровождает вторичные иммунодефициты различного генеза, поэтому применение в комплексе лечения как БАД к пище, так и продуктов на их основе, обладающих способностью корригировать адгезивные свойства фагоцитов, весьма целесообразно и будет способствовать повышению функциональной активности факторов врожденного иммунитета [7, 11].
По данным литературы активность АТФ-аз является одним из показателей активации стадии клеточного цикла, поэтому обнаруженное нами отчетливое ее повышение указывало на наличие активности №+/К+-АТФ-азы в цитозоле клеток [2, 6]. Так как активность этого фермента выявляется с усилением синтетической активности клеток при стимуляции процесса транскрипции (считывания) информации с ДНК, то, вероятно, внесение ДНК опосредованно стимулирует этот процесс в фагоцитах крови.
Установленное нами отчетливое снижение активности 5'-нук-леотидазы плазматической мембраны фагоцитирующих клеток под влиянием ДНК отражает снижение внутриклеточного содержания этого фермента, что указывает на активацию фагоцитов в ответ на введение ДНК.
В настоящее время систему фагоцитирующих клеток рассматривают как совокупность достаточно иммунокомпетентных и имму-норегуляторных клеток, участвующих в межклеточных контактах и взаимодействиях, формирующих определенный иммунный гомеостаз, от функциональной полноценности которых во многом зависят генез, течение и исход многих патологических состояний [7].
Установленная способность ДНК из молок лососевых рыб активировать некоторые маркеры функциональной активности фагоцитов в эксперименте является обоснованием целесообразности ее применения в клинической практике как в виде БАД к пище, так и в составе продуктов на ее основе.
Литература
1. Бутаков А.А. Разработка комплекса экспресс-методов оценки фагоцитарного звена иммунитета для иммуноэпи-демиологических исследований: дис. ... канд. мед. наук / А.А. Бутаков. - М., 1991. - 131 с.
2. Зварич Е.И. Са2-АТФ-аза плазматических мембран. Структура и функции / Е.И. Зварич // Биол. мембраны. 1991. Т. 8, № 6. С. 565-584.
3. Касьяненко Ю.И. Биологически активная пищевая добавка - дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) из молок лососевых / Ю.И. Касьяненко, Л.М. Эпштейн, А.К. Гажа и др. // Изв. ТИН-РО. 1999. Т. 125. С. 139-146.
4. Кириличева Г.Б. Поведение активности ферментов цитоплазматической мембраны макрофагов под действием бактери-
альных полисахаридов / Г.Б. Кириличева, А.А. Кириличева, М.А. Туманян // Тез. докл. науч.-практ. конф. «Иммуномодуляторы в инфекционной патологии». М., 1988. С. 55-56.
5. Ллойда З. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы /
З. Ллойда, Р. Госсрау, Т. Шиблер. - М.: Мир, 1982. - 270 с.
6. Мастернак Т.Б. Адъювантные свойства и влияние иммуномодуляторов на активность 5'-нуклеотидазы макрофагов / Т.Б. Мастернак, Е.А. Жигадло. Е.Ю. Малкина и др. // Иммунология. 1994. № 4. С. 23-26.
7. Маянский А.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге / А.Н. Маян-ский, Д.Н. Маянский. - Новосибирск: Наука, 1989. - 278 с.
8. Определение безопасности и эффективности биологически активных добавок к пище: МУК 2.3.2.721-98. - М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 1999. - 87 с.
9. Пат. СССР № 915446. Способ получения ДНК из молок рыб / М. А. Гаймула, В.Х. Кална, У.Я. Микстайс, Л.М. Эпштейн. - За-явл. 10.10.80; опубл. 01.07.91.
10. Петров Р.В. Методические материалы по экспериментальному (фармакологическому) и клиническому испытанию иммуномодулирующего действия фармакологических средств / Р. В. Петров, Р.М. Хаитов, В.М. Манько и др. - М.: Фармакол. комитет, 1984. - 28 с.
11. Amaout M.A. Structure and function of the leukocyte adhesion molecules CD11/CD18 / M.A. Arnaout // Blood. 1990. Vol. 75. P. 1037-1050.
© Федянина Л.Н., Каленик Т.К., Плехова Н.Г., 2008 г.
