CC BY
56
Медицинская иммунология 2010, Т. 12, № 1-2, стр. 115-124 © 2010, СПб РО РААКИ
Оригинальные статьи
ПОЛНОРАЗМЕРНЫЙ ПЕПТИДНЫЙ АНАЛИЗ АНТИГЕННОГО ПРОФИЛЯ ПОВЕРХНОСТНЫХ БЕЛКОВ
СИБИРСКИХ изолятов вируса гепатита C
Гражданцева А.А.1, Сиволобова Г.Ф.1, Major M.2, Чуб Е.В.1, Швалов А.Н.1, Юдин П.В.1, Нетесов С.В.1, 3, Локтев В.Б.1, 3, Кочнева Г.В.1
1. ФГУНГосударственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора, Новосибирская обл, г. Кольцово
2. Центр по оценке и исследованиям биологических препаратов, Управление по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами США, Мэриленд, г. Бетезда
3. ГОУВПО «Новосибирский государственный университет», г. Новосибирск
Резюме. С помощью панели перекрывающихся синтетических пептидов изучены антигенные профили поверхностных гликопротеинов вируса гепатита С (ВГС) трех генотипов 1b, 2a/2c и 3а, которые наиболее широко распространены на территории России, и в частности в г. Новосибирске. Показано, что общие для всех генотипов ВГС высокоиммуногенные пептидные эпитопы белков Е1 и Е2 расположены в позициях аминокислот 250-260, 315-325 (Е1-белок), 390-400 (гипервариабельный район 1), 430-440 и 680-690 (Е2-белок). Наибольшие межгенотиповые различия регистрируются в позициях 280-290, 410-430 и 520-540. В районе 280-290 ак белка Е1 выявлена новая антигенная детерминанта, характерная только для 2а/2с генотипа ВГС. Широкое варьирование границ большинства эпитопов свидетельствует о высокой изменчивости вирусных белков Е1 и Е2. Однако схожесть репертуара антивирусных антител, индуцированных разными генотипами ВГС, свидетельствует о возможности создания принципиально новых универсальных вакцин против ВГС на основе картированных антигенных районов белков Е1 и Е2.
Ключевые слова: вирус гепатита С, генотип, пептидный анализ, антигенная детерминанта.
Grazhdantseva A.A., Sivolobova G.F., Major M., Chub E.V., Shvalov A.N., Yudin P.V., Netesov S.V., Loktev V.B., Kochneva G.V.
FULL-LENGTH PEPTIDE ASSAY OF ANTIGENIC PROFILE OF ENVELOPE PROTEINS FROM SIBERIAN IsOLATEs OF HEPATITIs c virus
abstract. Antigenic profiles of envelope glycoproteins of hepatitis C virus presented by three genotypes 1b, 2a/2c and 3a, which are most widespread in the territory of Russia and, in particular, in Novosibirsk, were studied using a panel of overlapping synthetic peptides. It was shown that highly immunogenic peptide epitopes of Е1 and Е2 proteins common for all HCV genotypes, are located in amino acid positions 250-260, 315-325 (Е1 protein), 390-400 (hypervariable region 1), 430-440, and 680-690 (Е2 protein). The greatest inter-genotypic differences were recorded in positions 280-290, 410-430 and 520-540. A novel antigenic determinant was detected in the region of aa 280-290 of the Е1 protein which was typical only for HCV 2a/2c genotype. A broad variation in the boundaries for the most epitopes suggests a high variability of the Е1 and
_______________________________________________________ Е2 viral proteins; however, a similar repertoire of
antibodies induced by different HCV genotypes indicates to an opportunity of designing a new generation of cross-reactive HCV vaccines based on mapping of the E1 and E2 antigenic regions. (Med. Immunol., vol. 12, N1-2, pp 115-124)
Keywords: hepatitis C virus, gemtype, peptide analysis, antigenic determinant.
Адрес для переписки:
Кочнева Галина Вадимовна,
ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора 630559, Новосибирская обл., г. Кольцово.
Тел.: (383) 336-73-17.
Факс: (383)336-74-09.
115
Гражданцева А.А. и др.
Медицинская Иммунология
Введение
Вирус гепатита С (ВГС) является строго антропонозным агентом и вызывает у человека тяжелый вирусный гепатит c возможным прогрессированием в цирроз или первичный рак печени. Характерной особенностью гепатита С является развитие хронических форм заболевания в 7580% случаев и чрезвычайно высокая вариабельность вируса [6, 17]. Постоянное образование новых антигенных вариантов ВГС в организме инфицированного человека позволяет вирусу ускользать от защитного ответа иммунной системы [2]. Показано, что в организме хронически инфицированного ВГС человека образуется большое количество противовирусных антител как к структурным белкам С, Е1 и Е2, так и неструктурным NS2, NS3, NS4 и NS5 [4, 7, 9, 19]. Роль антител в патогенезе ВГС инфекции не ясна, однако ряд антител к поверхностным белкам ВГС обладает вируснейтрализующей активностью [11,25], что свидетельствует о важности изучения иммуногенных свойств данных белков для создания средств профилактического и терапевтического контроля инфекции.
Неравнозначность участков поверхностных белков Е1 и Е2 ВГС в индукции иммунного ответа была отмечена в целом ряде работ [4, 10, 15]. Кроме того, эти белки образуют на поверхности вириона гетеродимер и формируют составные антигенные детерминанты, часть которых представлена фрагментом белка Е1, а часть — белка Е2 [14]. Наиболее антигенно значимым участком белка Е1 является район, включающий 192-211 ак N-концевой части молекулы, и участок 313-327 ак, прилегающий к гидрофобному домену на С-конце белка Е1 [8, 11]. В составе белка Е2 обнаружены два гипервариабельных района HRV1 (384-410 ак) и HRV2 (474-482 ак), антитела к которым обладают выраженной ви-руснейтрализующей активностью [5, 18].
В настоящее время описано 6 основных генотипов ВГС с уровнем гомологии 65,7-68,9%, более 100 субтипов с уровнем гомологии 76,9-80,1 и миллионы постоянно образующихся внутри каждого инфицированного организма квазивидов с уровнем гомологии 90,8-99% [3, 20]. Наиболее интенсивно мутациям подвергаются поверхностные гликопротеины Е1 и Е2 [22], поэтому для создания универсальной вакцины, мониторинга инфекции, диагностики и лечения принципиально важно выявить общие закономерности антигенной структуры и уровень антигенной вариабельности основных иммуногенных доменов поверхностных гликопротеинов ВГС.
Одним из возможных подходов для анализа антигенного профиля гликопротеинов Е1-Е2 ВГС является использование библиотеки синте-
тических пептидов, перекрывающих аминокислотную последовательность этих белков, и различных панелей ВГС-позитивных сывороток человека. Пептиды, специфически реагирующие с ВГС-позитивными сыворотками, могут быть использованы для совершенствования диагностики инфекции и для индукции антивирусных иммуноглобулинов в качестве возможных компонентов вакцин.
Целью настоящей работы является сравнительное сканирование антигенно-значимых детерминант поверхностных белков ВГС с использованием генотип-специфической панели ВГС-позитивных сывороток, полученных от хронических больных в г. Новосибирске, и набора синтетических пептидов, перекрывающих полную последовательность гетеродимера Е1Е2 (192-809 ак) и рассчитанных на основе структуры изолята ВГС генотипа 1а.
Материалы и методы
Сыворотки крови. Образцы сывороток крови были получены от пациентов ГУЗ Государственный новосибирский областной клинический диагностический центр, г. Новосибирск, с диагнозом «хронический гепатит С». Панель сывороток включала 45 образцов, собранных в период с 1 января по 31 декабря 2008 года. Исследование проводили с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (ред. Указ Президента РФ от 24.12.1993 N 2288, Федеральные законы от 02.03.1998 № 30-ФЗ, от 20.12.1999 № 214-ФЗ). Забор крови проводили только после получения письменного информированного согласия пациента, как описано ранее [1]. Исследование одобрено этическим комитетом ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.
Диагностика антител к ВГС. Наличие антител к ВГС класса G в сыворотке крови определяли с использованием коммерческих тест-систем «D-0751 РекомбиБест анти-ВГС» и «D-0756 РекомбиБест анти-ВГС подтверждающий тест» (ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск) в соответствии с инструкцией производителя. Данные тест-системы выявляют антитела к коровому и неструктурным белкам ВГС, но не детектируют антитела к поверхностным Е1- и Е2-белкам.
Количественный анализ РНК ВГС. Количественное определение РНК ВГС проводили с использованием наборов реагентов «TR-V1-M (RG, iQ, Мх) АмплиСенс HCV-Монитор-FRT» (ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии», г. Москва) в соответствии с инструкцией производителя.
Генотипирование изолятов ВГС. Генотип ВГС определяли на основе анализа фрагмента
116
2010, Т. 12, № 1-2
Антигены вируса гепатита С
5’UTR-области генома вируса. Для этого проводили амплификацию указанного района генома, как описано в работе [1], с последующим секвенированием полученного фрагмента. Сек-венирование проводили по методу CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing на автоматическом секвенаторе CEQ2000XL DNA Analysis System (Beckman Coulter Inc., USA). Последовательности всех амплифицированных фрагментов определяли по обеим цепям синтезированной ДНК.
Полученные последовательности, а также про-тотипные последовательности известных генотипов, депонированные в базе данных GenBank, использовали для проведения филогенетического анализа при помощи метода UPGMA. Критерием отнесения исследуемого изолята к определенному генотипу являлось попадание последовательности этого изолята в ветвь филогенетического дерева, включающую также последовательности прототипных изолятов данного генотипа, и не включающую прототипные последовательности других генотипов. Индексы статистической поддержки узлов дерева вычисляли в тесте bootstrap с 500 репликациями.
Пептидный анализ. Набор синтетических перекрывающихся пептидов, охватывающий полную последовательность белков Е1 и Е2 ВГС (192-809 ак), был синтезирован в фирме Mimotopes LTD (Австралия). Структура пептидов рассчитана на основе аминокислотной последовательности штамма H77 ВГС, генотип 1а. Набор состоит из 76 пептидов. Пептиды на N-конце несут ковалентно связанный биотин для сорбции на планшете с подложкой из стрептавидина (первый пептид содержит биотин на С-конце) и последовательность SGSG, которая выступает в качестве разделительного звена при прикреплении пептида к поверхности планшета через биотин-стрептавидиновый комплекс. В таблице 1 представлена структура пептидов и позиции пептидов, начиная с первой аминокислоты белка Е1, 192 ак, и заканчивая 809 ак на геномном полипротеине. Пептиды 2-75 имеют длину 20 аминокислотных остатков, первый пептид — 19 ак. Перекрывание пептидов, за исключением концевых, составляет 12 ак, благодаря чему при сканировании каждая последовательность представлена 2-3 раза.
Иммуноферментный анализ с использованием в качестве антигенов синтетических пептидов проводили в соответствии с протоколом, предоставленным фирмой Mimotopes LTD (Австралия). Кратко:
— Сорбция стрептавидина. Исходный раствор стрептавидина (Sigma, США, кат. № С-4762, 2 мг/мл) разводили деионизованной водой 1:400 до концентрации 5 мкг/мл, помещали по 100 мкл раствора в лунку 96-луночного планшета
(SP. Lifescience, Республика Корея) и высушивали в течение 20 ч при 37 °С. Места неспецифической сорбции блокировали последующей обработкой планшета раствором 5% обезжиренного молока в фосфатно-солевым буфере рН 7,4, ФСБ (Gibco, Cat. 18912-014).
— Сорбция пептидов. Лиофилизованные пептиды тщательно, осторожно, исключая взаимную контаминацию, растворяли в свежеперегнанном диметилформамиде до концентрации 5 мг/мл. По 100 мкл раствора каждого пептида в разведении 1:500 в ФСБ помещали в лунку покрытого стрептавидином планшета, инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре на шейкере, затем планшеты промывали 5 раз ФСБ с добавлением 0,1% Tween 20 (Sigma, Cat. P1379) (ФСБ / Tween 20).
— Связывание сывороток и проявление результатов. Сыворотки пациентов в разведении 1:800 в ФСБ / Tween 20 / 5% молока вносили по 100 мкл в лунку и инкубировали в течение 20 ч при 4 °C, затем планшеты отмывали 5 раз раствором ФСБ / Tween 20. В качестве вторичных антител использовали козьи антитела к IgG человека, меченные пероксидазой хрена (KPL, Cat. 074-1006) в рабочем разведении 1:2700 в ФСБ / Tween 20 / 5% молока и инкубировали при 20 °C в течение 1 часа на шейкере. Планшеты отмывали 5 раз ФСБ / Tween 20 и дважды только ФСБ для удаления следов детергента. Связавшиеся антитела визуализировали реакцией со свежеприготовленным раствором субстрата ТМБ (ЗАО «Вектор-Бест», г. Кольцово, Россия). Останавливали реакцию раствором 2М серной кислоты. Регистрацию результатов проводили на спектрофотометре SpectraCount, Packard BioScience Company, USA, оптическую плотность (ОП) измеряли при соотношении длин волн 450/620 нм. ИФА для каждой сыворотки проводился по крайней мере дважды. В качестве отрицательного контроля использовали сыворотки людей, не имеющих маркеров ВГС.
При проведении ИФА для контроля связывания пары стрептавидин-биотин использовали систему из положительного Biotin-SGSG-KPLAQ-NH2 и отрицательного Biotin-SGSG-GLAQ-NH2 контрольных пептидов и мышиных моноклональных антител (Mimotopes,LTD,Австралия,сat.IMX-BP-C-ABY) со специфичностью KPLaq, которые входили в состав пептидного набора.
Результаты и обсуждение
Характеристика обследуемой группы. Исследуемые образцы крови получены от жителей г. Новосибирска с длительной (не менее 3 лет) хронической инфекцией ВГС. Возраст участников исследования составил 18-35 лет с примерно
117
Гражданцева А.А. и др.
Медицинская Иммунология
равным соотношением мужчин и женщин. Часть участников призналась во внутривенном употреблении наркотических препаратов. В образцах крови всех пациентов с использованием коммерческого ИФА были выявлены антитела класса IgG против белка Core и неструктурных белков NS3, NS4 и NS5. Вирусная нагрузка составила 104-106 копий РНК ВГС/мл сыворотки при определении методом количественной ОТ-ПЦР с праймерами на консервативную 5’UTR-область генома ВГС.
Определение генотипа исследуемых изолятов ВГС проводили при помощи филогенетического анализа последовательности 5’UTR-области генома ВГС (рис. 1). Данная область, несмотря на высокий уровень консервативности, является достаточно информативной для дифференциации генотипов и большинства субтипов ВГС [16, 17]. По результатам анализа в коллекцию сывороток, использованную далее в нашей работе, были отобраны образцы, содержащие ВГС трех генотипов — 1b, 2a/2c (использованный метод не позволяет дифференцировать эти два субтипа) и 3a, которые наиболее широко распространены на территории России, и в частности в г. Новосибирске. Каждая генотипическая группа сывороток включала 15 образцов.
Пептидное сканирование антигенных детерминант нативных поверхностных белков Е1 и Е2 ВГС. На рисунке 2 представлены результаты ИФА с набором синтетических пептидов трех ВГС-позитивных и одной контрольной (6 образцов) групп сывороток. На рисунке видно, что разброс значений оптической плотности (ОП) при анализе разных сывороток очень велик. Минимальное значение варьирует от 0,05 до 0,66 (mean±SD = 0,18±0,11), а максимальное — от 0,77 до 2,22 (1,87±0,40). Такой разброс, по-видимому, является следствием индивидуальных особенностей иммунного ответа, степенью поражения печени, нарушениями обмена веществ, сопутствующими заболеваниями и др. Уровень ОП контрольных ВГС-негативных сывороток (рис. 2) варьировал от 0,046 до 0,5 (0,19+0,073) на протяжении всей сканированной последовательности Е1- и Е2-белков ВГС, что свидетельствует об отсутствии специфического связывания.
Для увеличения репрезентативности антигенных профилей и нивелирования колебаний неспецифических фоновых значений ОП индивидуальных сывороток в пептидном анализе мы использовали следующий алгоритм обработки результатов (все расчеты проводили в среде программного обеспечения «LabView»):
1. На первом этапе нами было проведено нормирование данных пептидного ИФА в рамках максимального и минимального значений
ОП для каждой сыворотки. При этом минимальное значение ОП каждой сыворотки рассматривали как фон и считали равным 0, а максимальное значение приравнивали к 2, т.е. как бы «растягивали» по шкале 0-2 (стандартный диапазон значений ОП в ИФА). Коэффициент нормирования для разных сывороток варьировал от 0,96 до 3,23 со средним значением 1,31+0,56.
2. Для корректного сравнения нормализованных значений ВГС-позитивных сывороток с контрольными негативными образцами все значения ОП последних были умножены на коэффициент 1,31 (средний коэффициент нормирования ВГС-позитивных сывороток, см. выше).
3. Затем для каждого пептида рассчитывали среднее значение ОП внутри группы сывороток одного генотипа (ОПА1/1Ь; ОПА1/2а2с; ОПА1/3а и т.д.).
4. В связи с тем, что пептидный анализ носит ступенчатый характер (в нашем случае размер «ступени» составляет 8 ак) и не позволяет строго картировать антигенные детерминанты в соответствии с позициями определенных аминокислот на полипротеине Е1Е2 ВГС, нами была проведена теоретическая оценка антигенной активности каждой аминокислоты тестируемых Е1- и Е2-бел-ков ВГС (ОПак) с учетом количества пептидов, в которых она участвует в пептидном анализе:
— если аминокислота, соответствующая определенной позиции в полипротеине Е1Е2, встречается 1 раз в пептидном анализе (первые 8 ак 192-199 и последние 6 ак 804-809, см. табл. 1), то для определения ОПак такой аминокислоты в каждой генотипической и контрольной группах сывороток использовали среднее значение ОП соответствующего пептида (соответственно А1 или D10, см. табл. 1). Например,
ОП192/1Ь = ОПА1/1Ь или ОП804/2а2с = ОП^10/2а2с;
— если аминокислота встречается 2 раза в пептидном анализе (например, позиции 200-207, 212-215, 220-223 и т.д., см. табл. 1), мы делали допущение, что ее активность реализуется одинаково в обоих пептидах и определяли ОПак как среднее значение ОП соответствующих двух пептидов в каждой генотипической и контрольной группах сывороток. Например, ОП200/1Ь = (ОПВ1/1Ь +
ОПС1/1Ь)/2;
— если аминокислота встречается 3 раза в пептидном анализе (например, позиции 208-211, 215-219, 224-227 и т.д., см. табл. 1), то аналогично предыдущему пункту значение ее ОПак определяли как среднее значение ОП соответствующих трех пептидов в каждой генотипической и контрольной группах сывороток. Например,
ОП216/1Ь = (ОПВ1/1Ь + ОПС1/1Ь + ОПИ1/1Ь)/3.
Такой подход уменьшает размер «ступеней» в перекрывающемся пептидном анализе до 4 ак и позволяет наложить профиль
118
2010, Т. 12, № 1-2
Антигены вируса гепатита С
Н112
Н206
Н195
524
231
458
1bAJ132996
H117
H194
H114
198
320
H156
247
389
384
1b D11168 1a M62321 1a D107749 1a M67463 5a Y13184 5aAF064490 5aAF007520 6a AB306366 6d AB301814 6e AB162875 4a Y11604 4d DQ418786 104 50 375
2a AB047644
H62
H198
1001
H88
H132
H126
H157
H59
290
H116
341
276
2c AB301777
2b AB030907
2b D10988
147
H209
357
H118
H109
H123
277 H119 184 H122 H124
3a D17763
364
394
H124
H130
H21
3b D49374 3b Aj621218
0,000 0,005
Рисунок 1. Филогенетическое дерево, построенное на основе UPGMA-анализа последовательностей области 5’UTR генома ВГС
Примечание. Размер последовательностей составил 240 нуклеотидов. Изоляты, полученные нами, отмечены жирным шрифтом.
Для прототипных последовательностей указаны субтипы и уникальные шифры базы данных GenBank. Крупными цифрами (1-6) отмечены узлы, соответствующие предполагаемым общим предкам генотипов. Приведены индексы статистической поддержки узлов, превышающие 60, а также масштаб шкалы генетических расстояний.
119
Гражданцева А.А. и др.
Медицинская Иммунология
SaasSagagSSgaagHSSagBssgsagSigSSSSSSgSSaEaaaBffisstesaisiSsIsgSggSsegggggeggfcgg
Пептид (ак)
Рисунок 2. Результаты ИФА сывороток пациентов, инфицированных разными генотипами ВГС, и негативных сывороток человека с набором синтетических пептидов, перекрывающих полную последовательность белков Е1 и Е2 ВГС
Примечание. На оси абсцисс указаны соответствующие пептидам позиции аминокислот на полипротеине ВГС. По оси ординат указана ОП каждого пептида при А450/620. Генотипы ВГС указаны в рамках в правом верхнем углу рисунка, «ВГС отр.» обозначает значения ОП негативных на присутствие маркеров ВГС сывороток человека (отрицательный контроль), «среднее» обозначает среднее значение ОП для всех генотипов ВГС
антигенности пептидов на непрерывную аминокислотную последовательность полипротеина Е1Е2.
Суммированные по разным генотипам ВГС результаты расчета представлены на рисунке 3.
Как следует из представленных на рисунке 3 данных, в белках Е1 и Е2 исследованных нами си-
бирских изолятов ВГС генотипов 1b, 2а/2с и 3а выявляется значительное количество общих иммуногенных районов, что согласуется с ранее опубликованными данными по изолятам ВГС из разных регионов мира [4, 12, 15, 16, 22, 24]. Важно также учесть, что пептиды синтезированы
120
2010, Т. 12, № 1-2
Антигены вируса гепатита С
ТАБЛИЦА 1. СТРУКТУРА СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ, ПЕРЕКРЫВАЮЩИХ ПОЛНУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ Е1- И Е2-бЕлкОВ ВГС (шТАмм H77, ГЕНОТИП 1а)
№ Позиция ак Последовательность аминокислот № Позиция ак Последовательность аминокислот
A1 192-211 Y*QVRNSSGLYHVTNDCPNSSGSG G5 496-515 SGSGIVPAKSVCGPVYCFTPSPVV
В1 200-219 SGSGLYHVTNDCPNSSIVYEAADA H5 504-523 SGSGGPVYCFTPSPVVVGTTDRSG
C1 208-227 SGSGPNSSIVYEAADAILHTPGCV A6 512-531 SGSGSPVVVGTTDRSGAPTYSWGA
D1 216-235 SGSGAADAILHTPGCVPCVREGNA B6 520-539 SGSGDRSGAPTYSWGANDTDVFVL
E1 224-243 SGSGPGCVPCVREGNASRCWVAVT C6 528-547 SGSGSWGANDTDVFVLNNTRPPLG
F1 232-251 SGSGEGNASRCWVAVTPTVATRDG D6 536-555 SGSGVFVLNNTRPPLGNWFGCTWM
G1 240-259 SGSGVAVTPTVATRDGKLPTTQLR E6 544-563 SGSGPPLGNWFGCTWMNSTGFTKV
H1 248-267 SGSGTRDGKLPTTQLRRHIDLLVG F6 552-571 SGSGCTWMNSTGFTKVCGAPPCVI
A2 256-275 SGSGTQLRRHIDLLVGSATLCSAL G6 560-579 SGSGFTKVCGAPPCVIGGVGNNTL
B2 264-283 SGSGLLVGSATLCSALYVGDLCGS H6 568-587 SGSGPCVIGGVGNNTLLCPTDCFR
C2 272-291 SGSGCSALYVGDLCGSVFLVGQLF A7 576-595 SGSGNNTLLCPTDCFRKHPEATYS
D2 280-299 SGSGLCGSVFLVGQLFTFSPRRHW B7 584-603 SGSGDCFRKHPEATYSRCGSGPWI
E2 288-307 SGSGGQLFTFSPRRHWTTQDCNCS C7 592-611 SGSGATYSRCGSGPWITPRCMVDY
F2 296-315 SGSGRRHWTTQDCNCSIYPGHITG D7 600-619 SGSGGPWITPRCMVDYPYRLWHYP
G2 304-323 SGSGCNCSIYPGHITGHRMAWDMM E7 608-627 SGSGMVDYPYRLWHYPCTINYTIF
H2 312-331 SGSGHITGHRMAWDMMMNWSPTAA F7 616-635 SGSGWHYPCTINYTIFKVRMYVGG
A3 320-339 SGSGWDMMMNWSPTAALVVAQLLR G7 624-643 SGSGYTIFKVRMYVGGVEHRLEAA
B3 328-347 SGSGPTAALVVAQLLRIPQAIMDM H7 632-651 SGSGYVGGVEHRLEAACNWTRGER
C3 336-355 SGSGQLLRIPQAIMDMIAGAHWGV A8 640-659 SGSGLEAACNWTRGERCDLEDRDR
D3 344-363 SGSGIMDMIAGAHWGVLAGIAYFS B8 648-667 SGSGRGERCDLEDRDRSELSPLLL
E3 352-371 SGSGHWGVLAGIAYFSMVGNWAKV C8 656-675 SGSGDRDRSELSPLLLSTTQWQVL
F3 360-379 SGSGAYFSMVGNWAKVLVVLLLFA D8 664-683 SGSGPLLLSTTQWQVLPCSFTTLP
G3 368-387 SGSGWAKVLVVLLLFAGVDAETHV E8 672-691 SGSGWQVLPCSFTTLPALSTGLIH
H3 376-395 SGSGLLFAGVDAETHVTGGSAGRT F8 680-699 SGSGTTLPALSTGLIHLHQNIVDV
A4 384-403 SGSGETHVTGGSAGRTTAGLVGLL G8 688-707 SGSGGLIHLHQNIVDVQYLYGVGS
B4 392-411 SGSGAGRTTAGLVGLLTPGAKQNI H8 696-715 SGSGIVDVQYLYGVGSSIASWAIK
C4 400-419 SGSGVGLLTPGAKQNIQLINTNGS A9 702-723 SGSGGVGSSIASWAIKWEYVVLLF
D4 408-427 SGSGKQNIQLINTNGSWHINSTAL B9 710-731 SGSGWAIKWEYVVLLFLLLADARV
E4 416-435 SGSGTNGSWHINSTALNCNESLNT C9 718-739 SGSGVLLFLLLADARVCSCLWMML
F4 424-443 SGSGSTALNCNESLNTGWLAGLFY D9 726-747 SGSGDARVCSCLWMMLLISQAEAA
G4 432-451 SGSGSLNTGWLAGLFYQHKFNSSG E9 734-755 SGSGWMMLLISQAEAALENLVILN
H4 440-459 SGSGGLFYQHKFNSSGCPERLASC F9 742-763 SGSGAEAALENLVILNAASLAGTH
A5 448-467 SGSGNSSGCPERLASCRRLTDFAQ G9 750-771 SGSGVILNAASLAGTHGLVSFLVF
B5 456-475 SGSGLASCRRLTDFAQGWGPISYA H9 758-779 SGSGAGTHGLVSFLVFFCFAWYLK
C5 464-483 SGSGDFAQGWGPISYANGSGLDER A10 766-787 SGSGFLVFFCFAWYLKGRWVPGAV
D5 472-491 SGSGISYANGSGLDERPYCWHYPP B10 774-795 SGSGWYLKGRWVPGAVYAFYGMWP
E5 480-499 SGSGLDERPYCWHYPPRPCGIVPA C10 782-803 SGSGPGAVYAFYGMWPLLLLLLAL
F5 488-507 SGSGHYPPRPCGIVPAKSVCGPVY D10 788-809 SGSGFYGMWPLLLLLLALPQRAYA
Примечание. * - Y192 - первая аминокислота гликопротеина Е1.
121
Гражданцева А.А. и др.
Медицинская Иммунология
Положение аминокислоты
Рисунок 3. Антигенные профили поверхностных белков ВГС трех разных генотипов, построенные на основе расчета активности отдельных аминокислот Е1Е2 полипротеина ВГС в пептидном анализе
Примечание. Вдоль оси абсцисс указаны позиции аминокислот в полипротеине Е1Е2 ВГС, вдоль оси ординат указаны рассчитанные для каждой аминокислоты значения ОПак. Остальные обозначения - как на рисунке 2.
на основе аминокислотной последовательности американского штамма H77 с генотипом 1а, поэтому картированные нами сайты иммуногенности имеют гомологию также и с этим генотипом ВГС. Общие высокоиммуногенные пептидные эпитопы выявлены в следующих позициях: 250-260, 315-325
(Е1-белок), 390-400 (гипервариабельный район 1 белка Е2), 430-440, 680-690 (Е2 белок) (здесь и далее указаны центральные участки пиков из рисунке 3). В позициях 340-350, 490-500 и 560-580 ак также регистрируются общие, но существенно слабее реагирующие эпитопы. Широкое варьирование
122
2010, Т. 12, № 1-2
Антигены вируса гепатита С
границ большинства эпитопов свидетельствует о высокой изменчивости белков Е1 и Е2, однако способность антител, индуцированных разными генотипами ВГС, реагировать с одинаковыми пептидами свидетельствует о возможности создания на их основе универсальных иммуногенных конструкций для разработки вакцин против ВГС.
Наибольшие межгенотиповые различия регистрируются в позициях 280-290, 410-430
и 520-540. Так, в частности, в районе 280-290 ак белка Е1 нами выявлена ранее не описанная в литературе антигенная детерминанта, характерная только для 2а/2с субтипа ВГС выделенных нами сибирских изолятов. Интересно отметить, что детерминанта 412-426 ак, проявляющая межгенотиповые вируснейтрализующие свойства in vitro [21, 25], и эпитопы конформационной де-терминаты 412-423+528-535 ак белка Е2, описанные в [13], выявлены нами также только в случае 2а/2с субтипа ВГС. Однако расположенная рядом блокирующая вируснейтрализацию детерминанта 434-446 ак [25] является высокоиммуногенной во всех исследованных генотипах ВГС. Это согласуется с данными, представленными в [26], где из 9 тестированных ВГС-позитивных сывороток человека антитела к блокирующему эпитопу 434-446 ак были выявлены в четырех образцах, а к нейтрализующему 412-426 ак только в двух, причем в существенно более низком титре. В статье [23] было также показано, что антитела к узнающему эпитопу 412-423 ак вирусней-трализующего моноклонального антитела AP33 выявляются лишь в 2,5% случаев природной инфекции ВГС. Авторы высказали предположение, что низкая иммуногенность данного района связана с присутствующим в позиции 417 ак сайтом гликозилирования белка Е2.
В ряде работ было показано, что в N-концевой (192-202 ак) области белка Е1 расположен высокоиммуногенный эпитоп, обладающий вирусней-трализующей активностью [7, 8]. Нам не удалось выявить в этом районе значимых иммуногенных эпитопов ни для одного из исследованных генотипов ВГС. В опубликованных работах не приведены генотипы тестированных изолятов ВГС, поэтому различия, возможно, связаны с присутствием антигенных детерминант в структуре N-концевой части Е1-белка других, отличных от наших субтипов ВГС.
В исследуемой группе сывороток нам не удалось выявить антитела ко второму гипервариабельному району Е2-белка в позиции 470-480 ак, хотя в литературе показано наличие иммуногенных эпитопов в данном районе Е2-белка 1а и 1b субтипов ВГС [4]. Возможно, это объясняется наиболее высокой вариабельностью изо-лятов 1 генотипа ВГС по сравнению с другими
генотипами и, соответственно, отличием группы изолятов, исследованных в нашей работе, от изученных в работе [4].
Выявленные нами межгенотиповые различия антигенного профиля поверхностных белков ВГС свидетельствуют о необходимости геноти-пирования изолятов при изучении свойств поверхностных белков Е1 и Е2 и некорректности в ряде случаев распространения данных, полученных для отдельного генотипа, на вирус гепатита С в целом (как следует из рис. 3, среднее).
Благодарности
Работа выполнена при поддержке грантом Международного научно-технического центра (МНТЦ) №3255-п и грантом «Научная школа» НШ-387.2008.4.
Список литературы
1. Шустов А.В., Кочнева Г.В., Сиволобо-ва Г.Ф., Гражданцева А.А., Гаврилова И.В., Нестеров А.Е., Стрельцова М.А., Пальцев А.И., Локтев А.В., Максютов А.З., Акинфеева Л.А., Торшин В.П., West T.E., Ryder R.W, Онищенко Г.Г. Частота встречаемости маркеров гепатита С и факторы риска у персонала больниц Новосибирской области // Журн. микробиол. эпидеми-ол. и иммунобиологии (ЖМЭИ). — 2002. — T. 2. — C. 26-32.
2. Bowen D.G., Walker C.M. Adaptive immune responses in acute and chronic hepatitis C virus infection // Nature. — 2005. — VOl. 436. — P. 946-952.
3. Bukh J., Miller R.H., Purcell R.H. Genetic heterogeneity of hepatitis C virus: quasispecies and genotypes // Semin Liver Dis. — 1995. — ЛЫ. 15. — P. 41-63.
4. Carlos M.P., Yamamura Y., Vu Q., Conzen K., Anderson D.E., Torres J.V. Humoral immunity to immunodominant epitopes of Hepatitis C virus in individuals infected with genotypes 1a or 1b // Clin. Immunol. - 2004. - Vol. 111. - P. 22-27.
5. Farci P., Shimoda A., Wong D., Cabezon T., De Gioannis D., Strazzera A., Shimizu Y., Shapiro M., Alter H., Purcell R. Prevention of hepatitis C virus infection in chimpanzees by hyperimmune serum against the hypervariable region 1 of the envelope 2 protein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1996. — Vol. 93. - P. 15394-15399.
6. Gotto J., Dusheiko G.M. Hepatitis C and treatment with pegylated interferon and ribavirin // Int. J. Biochem. Cell Biol. - 2004. - Vol. 36, N 10. -P. 1874-1877.
7. Ishida C., Matsumoto K., Fukada K., Matsushita K., Shiraki H., Maeda Y Detection of antibodies to hepatitis C virus (HCV) structural proteins in anti-HCV-positive sera by an enzyme-linked immunosorbent assay using synthetic peptides
123
Гражданцева А.А. и др.
Медицинская Иммунология
as antigens // J. Clin. Microbiol. — 1993. — Vol. 31. — P. 936-940.
8. Keck Z-Y, Sung VM.H., Perkins S., Rowe J., Paul S., Liang T.J., Lai M.M.C., Foung S.K.H. Human monoclonal antibody to hepatitis C Virus E1 glycoprotein that blocks virus attachment and viral infectivity // J. Virol. - 2004. - Vol. 78, N 13. -P 7257-7263.
9. Lecnmann M., Ihlenfeldt H.G., Braunschweiger I., Gierls G., Jung G., Matz B., Kaiser R., Sauberbruch T., Spengler U. T and B Cell responses to different hepatitis C virus antigens in patients with chronic hepatitis C infection and in healthy anti-hepatitis C virus-positive blood donors without viremia // Hepatology. — 1996. — ЛЫ. 24, N 4. - P. 790-795.
10. Martinez-Donato G., Duenas-Carrera S., Alvarez-Lajonchere L., Morales J., Acosta-Rivero N., Martinez E., Vina A., Guerra I., Perez A., Musacchio A., Garcia J., Reyes O., Garay H.E., Gonzalez L.J., Alvarez J.C., Soria Y. Antigenicity and immunogenecity of the hepatitis C virus envelope E2 protein // Biotecnologia Aplicada. - 2006. - Vol. 23, N 1. - P 60-63.
11. Meunier J.C., Russell R.S., Goossens V., Priem S., Walter H., Depla E., Union A., Faulk K.N., Bukh J., Emerson S.U., Purcell R.H. Isolation and characterization of broadly neutralizing human monoclonal antibodies to the E1 glycoprotein of hepatitis C virus // J. Virol. - 2008. - ЛЫ. 82, N 2. - P. 966-973.
12. Olenina L.V, Nikolaeva L.I., Sobolev B.N., Blokhina N.P, Archakov A.I., Kolesanova E.F. Mapping and characterization of B cell linear epitopes in the conservative regions of hepatitis C virus envelope glycoproteins // J. Viral. Hepat. - 2002. -Vol. 9. - P 174-182.
13. Perotti M., Mancini N., Diotti R.A., Tarr A.W, Ball J.K., Owsianka A., Adair R., Patel A.H., Clementi M., Burioni R. Identification of a broadly cross-reacting and neutralizing human monoclonal antibody directed against the hepatitis C virus E2 protein // J. Virol. - 2008. - Vol. 82, N 2. -P 1047-1052.
14. Petit M.-A., Jolivet-Reynaud C., Peronnet E., Michal Y., Tre'po C. Mapping of a conformational epitope shared between E1 and E2 on the serum-derived human hepatitis C virus envelope // J. Biol. Chem. - 2003. - Vol. 278, N 45. - P 44385-44392.
15. Petrik J., Alexander G.J.M., Pearson G., Allain J.P Reactivity of synthetic peptides representing selected sections of hepatitis C virus Core and envelope proteins with a panel of hepatitis C virus-seropositive human plasma // J. Med. Virol. -1997. - Vol. 51. - P 67-79.
16. Sallberg M., Ruden U., Wrhren B., Mag-nius L.O. Antigenic regions within the hepatitis C virus envelope 1 and structural proteins: identification of an IgG3-restricted recognition site within the envelope
1 protein // Clin. Exp. Imunol. - 1993. - ЛЫ. 91. -P. 489-494.
17. Seeff L.B. Natural history of chronic hepatitis C // Hepatology. - 2002. - Vol. 36, N 5. -P. 35-46.
18. Shimizu Y.K., Igarashi H., Kiyohara T. A hyperimmune constructs against a synthetic peptide corresponding to the hypervariable region 1 of hepatitis C virus can prevent viral infection in cell cultures // Virol. - 1996. - Vol. 223. - P. 409-412.
19. Simmonds P, Rose K.A., Graham S., Chan S.W, McOmish F., Dow B.C., Follet E.A., Yap PL., Marsden H. Mapping of serotype-specific, immunodominant epitopes in the NS-4 region of hepatitis C virus (HCV): use of type-specific peptides to serologically differentiate infections with HCV types 1,2, and 3 // J. Clin. Microbiol. - 1993. -Vol. 31. - P 1493-1503.
20. Simmonds P. The origin and evolution of hepatitis viruses in humans // J. Gen. Virol. -2001. - Vol. 82. - P 693-712.
21. Tarr A.W, Owsianka A.M., Timms J.M., Patrick McClure C., Brown R.J.P, Hickling TP, Pietschmann T., Bartenschlager R., Patel A.H., Ball J.K. Characterization of the hepatitis C virus E2 epitope defined by the broadly neutralizing monoclonal antibody AP33 // Hepatology. - 2006. -Vol. 43, N 3. - P. 592-601.
22. Tarr A.W, Owsianka A.M., Szwejk A., Ball J.K., Patel A.H. Cloning, expression and functional analysis of patient-derived hepatitis C virus glycoproteins // Methods Mol. Biol. - 2007. -Vol. 379. - P 177-197.
23. Tarr A.W., Owsianka A.M., Jayaraj D., Brown R.J.P., Hickling T.P., Irving WL., Patel A.H., Ball J.K. Determination of the human antibody response to the epitope defined by the hepatitis C virus-neutralizing monoclonal antibody AP33 // J. Gen. Virol. - 2007. - Vol. 88. - Р 2991-3001.
24. Zhang Z.-X., Sonnerborg A., Sallberg M. Antigenic structure of the hepatitis C virus envelope 2 protein // Clin. Exp. Immunol. - 1994. - Vol. 98. -P. 382-387.
25. Zang P, Wu C.G., Mihalik K., Virata-Theimer M.L., Yu M.W, Alter H.J., Feinstone S.M. Hepatitis C virus epitope-specific neutralizing antibodies in Igs prepared from human plasma // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2007. - Vol. 104, N 20. - P 8449-8454.
26. Zhang P, Zhong L., Struble E. B., Wrtanabe H., Kachko A., Mihalik K., Virata-Theimer M.L., Alter H.J., Feinstone S., Major M. Depletion of interfering antibodies in chronic hepatitis C patients and vaccinated chimpanzees reveals broad crossgenotype neutralizing activity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2009. - Vol. 106, N 18. - P 537-541.
поступила в редакцию 20.10.2009 принята к печати 09.11.2009
124
