CC BY
70
Реферат
РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА TLR4 Asp299Gly СРЕДИ БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ГЕПАТИТОМ С В ПОЛТАВСКОЙ ОБЛАСТИ
Дубинская Г.М., Сизова Л.М., Коваль Т.И., Шлыкова О.А.
Ключевые слова: хронический гепатит С, полиморфизм, ген TLR4, генотип.
Целью исследования было выяснение распространённости полиморфизма Asp299Gly гена TLR4 среди больных хроническим гепатитом С и здоровых лиц, а также уточнения роли функционального полиморфизма в генах, кодирующих TLR4 в риске развития хронического гепатита С. Проведено обследование 81 больного хроническим гепатитом С, которые находились на лечении в Полтавской областной клинической инфекционной больнице и 81 практически здоровых жителей Полтавской области. Результаты проведенных исследований показали, что частота гетерозиготного генотипа Asp/Gly TLR4 у больных хроническим гепатитом С составляет 14,8% и превышает показатели популяционного контроля в 4 раза (3,7%, р<0,05), частота выявления мутантной аллели 299Gly среди больных хроническим гепатитом С составляет 7,4% (р<0,05). Установлено, что наличие полиморфноизменённого генотипа TLR4 позволяет прогнозировать развитие хронического гепатита С. Согласно расчета показателя соотношения шансов, наличие мутантного аллеля 299Gly TLR4 в 4,2 раза повышает риск развития хронического гепатита С (OR=4,24; 95% CI 1,16-15,22).
Summary
PREVALENCE OF GENE TLR4 ASP299GLY POLYMORPHISM AMONG PATIENTS WITH CHRONIC HEPATITIS C IN POLTAVA REGION
Dubinska G. M., Sizov L.M., Koval T.I., Shlykova O.A.
Key words: chronic hepatitis C, polymorphism, gene TLR4, genotype.
The aim of the study was to determine the prevalence of polymorphisms Asp299Gly TLR4 gene in patients with chronic hepatitis C and healthy individuals, as well as to clarify the role of functional polymorphisms in genes encoding TLR4 in the risk of developing chronic hepatitis C. The study involved 81 patients with chronic hepatitis C who were treated at the Poltava Regional Clinical Hospital of Infectious Diseases, and 81 healthy residents of the Poltava region. The studies showed that the frequency of heterozygous genotype Asp / Gly TLR4 in the patients with chronic hepatitis C is 14.8% higher than in the population of control group in 4 times (3.7%, p <0.05), the frequency of detection of mutant alleles 299Gly among the patients with chronic hepatitis C is 7.4% (p <0.05). It has been established that the presence of TLR4 genotype allows of predicting the development of chronic hepatitis C. According to the calculation of odds ratios, the presence of the mutant allele 299Gly TLR4 increases risk of chronic hepatitis C (OR = 4,24; 95% CI 1,1615.22) in 4.2 times.
УДК 618.177-06:616.36:575.113
Жданович О.1., Коломйченко Т.В., Бойчук О.Г., Головчак 1.С. ПОЛ1МОРФ1ЗМИ ГЕНУ Ф1БРИНОГЕН БЕТА У Ж1НОК
З БЕЗПЛ1ДДЯМ ТА ЗАХВОРЮВАННЯМИ ПЕЧ1НКИ
Державна установа «1нститут педiатрN, акушерства та пнекологи НАМН Украши» Нацюнальна медична акаде1^я пюлядипломноТ ocbí™ ím. П.Л. Шупика 1вано-Франшський нацюнальний медичний уыверситет
Досл'джено 18 жiнок з трубно-пертонеальним безпл/'ддям, серед них 8 жнок з функцональними по-рушеннями гепато-бШарно)' системи (1-а група), останн 10 жiнок без таких ознак склали 2-у групу. До функцональних порушень в'дносили наявнсть УЗД-ознак порушень печiнки та бiохiмiчних мар-кер'т. Проведеними досл'дженнями встановлено пдвищення частоти пол1'морф1'зм1в C148T, -455GA гену fi-fíbrinogen та Ух несприятливих сполучень у жнок з безпл'ддям та функцональними порушен-нями гепатобШарно)' системи, що вказуе на схильнсть до розвитку тромбоз'т та акушерських ускладнень. Наявнсть алельних вар'ант'т гену fi-fíbrinogen е преморбiдним тлом, на якому можуть розвинутися репродуктивнi порушення, о^нка генетичного статусу жнки дозволить прогнозува-ти ефективнсть програм ДРТ, здйснювати преграв'дарну пдготовку для запобгання можливих акушерських i перинатальних ускладнень.
Ключов1 слова: безплщдя, допом1жж репродуктивн! технологи, патолопя печЫки, гемостаз, ген в-fibrinogen
Вступ Деяк автори вважають, що причиною пору-
„ шення дтородно'Т функци i безплщдя можуть бу-
Порушення системи гемостазу супроводжу- ^ . ^ . . ...
сг- ■ ■ ■ ти змини в ^omMi гемостазу, ау^муны реакцм
ють бтьшють патолопчних процеав в оргашзм^ ' ', ^юю™. a>lu™Jnni н^ч"
зокрема пов'язан як з порушеннями репродук- [ ,,
.. . ■.. ■ ■ Наибтьш вразливим етапом програми ДРТ
тивно' функци жшки, так i з патолопею гепатобн т. п^^ами нг
.. ^ на сьогодшшнш день е перюд iмплантацi' та лiарноl системи. м м к м 4
раннi термши вагiтностi, частота раннього само-втьного переривання вагiтностi залишаеться високою. Висловлюються припущення, що одш-ею з причин порушення iмплантацп i раннього переривання ваптносп можуть бути змши в сис-темi гемостазу. Зютавлення параметрiв гемостазу у па^енток програми ЕКЗ в ефективних i неефективних циклах стимуляцп показуе, що одним з лабтьних параметрiв схильних до впливу стимуляцп суперовуляцп i показових на раннiх етапах ембрюгенезу, е концентрацiя фiб-риногену. ^м того, за наявностi у жшки генети-чно'Т та придбано'Т форми тромбофти, можуть мати мiсце субктычы аборти, що оцiнюеться як безплщдя неясного генезу [2, 3, 4].
Печiнка вiдiграе дуже суттеву роль в проце-сах гемостазу: патолопя гепатоб^арно'Т систе-ми, що призводить до и функцюнально'Т непов-ноцiнностi, позначаеться на всiх компонентах гемостазу. Печшка е мiсцем синтезу вах факто-рiв згортання i Т'х iнгiбiторiв за винятком фактора Втлебранда i вiдповiдае за елiмiнацiю комплек-сiв «активований фактор - шпбп~ор». Захворю-вання печiнки призводять до складних комплек-сних порушень в системi гемостазу, але при цьому збер^аеться нестiйкий баланс мiж згор-туючою та антизгортуючою системою, який легко порушуеться у той чи шший бiк, тому у па^ен-тiв з ураженнями печшки може бути схильнiсть як до кровотеч, так i до тромбозiв. Порушення функцiТ печiнки можуть супроводжуватись кшьм-сними i якiсними порушеннями фiбриногену [5, 6].
На згортуючу систему кровi також впливае п-перестрогенемiя, що супроводжуе програми ДРТ [4].
Отже, порушення системи гемостазу не тть-ки можуть бути одшею з причин безплщдя, особливо за наявност гепатоб^арно'Т патологи, а i обумовлювати успiшнiсть програм ДРТ, збере-ження iндукованоТ ваптносп, ускладнення ТТ пе-ребiгу, перинатальн наслiдки.
Усi цi порушення можуть бути обумовлен ге-нетичною схильнютю до порушень системи гемостазу, зокрема полiморфiзмами гену фiбрiно-ген р, як вважають одними з первинних марке-рiв тромбофiлiТ i пов'язують з невиношуванням вагiтностi та прееклампсiею [3, 7].
Фiбриноген - глкопроте'Тн гостроТ фази, що синтезуеться в печшцк Вiн складаеться з трьох полiпептидiв Аа, Вр i Y, якi кодуються альфа (FGA), бета (FGB) i гамма (FGG) генами, вщпо-вiдно [8]. Фiбриноген е важливим компонентом згортання кровi i основним чинником, що визна-чае в'язкiсть кровi та агрегацш тромбоцитiв. Пiд дiею ферменту тромбшу цей бiлок здатний пе-ретворюватися на фiбрин i утворювати тромб. Вш модулюе функцiю ендотелiю i сприяе пролн фераци клiтин гладких м^в i мiграцiТ. Останнiм часом, з пщвищеними фiбриногену пов'яують ожиршня [9].
Локалiзацiя гену фiбриноген бета (FGB) -4q28 (рисунок 1).
Дтянка ДНК у регуляторнш обласн гена FGB, в якому вщбуваеться замiна гуанiну (G) на аденш (А) у позицп -455, позначаеться як гене-тичний маркер G (-455) А. Наявнiсть замiни впливае на штенсивнють синтезу бiлка фiбрино-гену. Частота зустрiчання мiнорного (А) алеля в европейськш популяци становить, за даними рь зних авторiв, вiд 5 до 10%.
Рисунок 1 - Хромосомна локалiзацiя гену фiбриноген бета ^28)
Мута^я -455А бета фiбриногену (FGB) су-проводжуеться пiдвищеною експресiею гена, що призводить до пщвищеного рiвня фiбриногену в кровi i збiльшуе ймовiрнiсть утворення тромбiв, що може призводити до тромбозiв i кардюваску-лярних захворювань та акушерських усклад-нень. У дослщженш групи здорових донорiв було встановлено, що мута^я -455А призводить до пщвищеного вмюту фiбриногену в кровi [8].
Полiморфiзм -156С> Т гена FGB полягае у нуклеотиднш замiнi цитозину (С) на тимш (Т) в
промоторнiй дiлянцi гена. Варiант Т супроводжу-еться пщвищеною експресiею гена, що призводить до збтьшення вмiсту фiбриногену в кровi i пiдвищуе ймовiрнiсть утворення тромбiв. За ра-хунок цього носи варiанту Т мають бтьший ри-зик захворювань серцево-судинноТ системи, порушень плацентаци та шших акушерських ускладнень.
Наявнiсть алельних варiантiв генiв е премор-бiдним тлом, на якому можуть розвинутися ре-продуктивн порушення, оцiнка генетичного ста-
тусу жшки дозволить прогнозувати ефективнють програм ДРТ, здшснювати прегравщарну подготовку для запоб1гання можливих акушерських i перинатальних ускладнень.
Мета
Дослщити полiморфнi варiанти гену фiбрiно-ген в у ж1нок з безплщдям та порушеннями гепа-тоб^арноТ системи.
Матерiали та методи
Дослiджено 18 жiнок з трубно-
перiтонеальним безплщдям, серед них 8 жшок з функцюнальними порушеннями гепато-б^арноТ системи (1-а група), останнi 10 ж1нок без таких ознак склали 2-у групу. До функцюнальних по-рушень вщносили наявнiсть УЗД-ознак пору-шень печшки та бiохiмiчних маркерiв (трансамн нази, лужна фосфатаза, б^рубш).
З таблиц 1 видно, що групи жшок достовiрно не вiдрiзнялись нi за вком, нi за тривалiстю без-плiддя.
Таблиця 1.
Характеристика обстежених жiнок, абс.ч. (%)
Показник Група жшок
1-а, n= 8 2-а, n= 10
Вк, роюв до 30 1 (12,5) 2 (20,0)
30 - 40 5 (62,5) 7 (70,0)
40 i бтьше 2 (25,0) 1 (10,0)
Тривалють безплщдя до 5 роюв 5 (62,5) 5 (50,0)
Молекулярно-генетичне дослщження полн морфних варiантiв за генами ^-fibrinogen (C148T, -455GA) проводилось в молекулярно-генетичнiй лабораторп Державного закладу «Референс-центр з молекулярной дiагностики МОЗ Укра'ши». Для генотипування венозну кров набирали в стерильних умовах в моновети об'емом 2,7 мл з калieвою сiллю етилендиамш-тетраоцтово' кислоти в якост антикоагулянту («Sarstedt», Германiя), заморожували та зберн гали при t -200С. 1з зразкiв кровi проводили видн лення геномно'' ДНК за допомогою комерцiйного набору "ДНК-сорб-В" (вщповщно до шструкцп надано' виробником). Для визначення C148T та -455GA гена ^-fibrinogen використовували протокол з ол^онуклеотидними праймерами з за-стосуванням методу ПЛР з наступним аналiзом полiморфiзму довжини рестрикцiйних фрагмен-^в (ПДРФ). Для цього амплiфiкували специфiчнi дiлянки генiв за допомогою пари специфiчних праймерiв («Metabion», Нiмеччина). Для амплн фкацп брали 3 мкл ДНК та додавали до сумЫ, що мютить 12,5 мкл Dream Tag Green PCR po-
бочого розчину, по 20 pmol праймеру 1 та 2, об'ем доводили до 25 мкл деюшзованою водою. ПЛР проводили в термоциклерi «FlexCycler BU» (Analytik Jena (Нiмеччина). Продукти амплiфiка-ц1Т фрагментiв ДНК гену ^-fibrinogen (C148T, -455GA) пщлягали гiдролiтичному розщепленню за допомогою ендонуклеаз рестрикцп HindIII. Стан амплiфiкацiйних та рестрикцшних фрагме-нтiв аналiзували за допомогою горизонтального електрофорезу в 2% агарозному гелi (160 V про-тягом 40 хвилин). Вiзуалiзацiю отриманих результат проводили за допомогою транслюмн натора та за молекулярною вагою фрагментiв ДНК дослiджуваних гешв визначали генотип особи.
Результати дослiдження та 1х обговорення
За отриманими даними у жшок з безплщдям та функцюнальними порушеннями гепатоб^ар-но! системи встановлена вища частота патоло-пчних полiморфiзмiв C148T гену ^-fibrinogen (рисунок 2).
100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%
25 50
50
50
25
□ - ТТ
□ -СТ
□ -СС
1 - а група
2-а група
Рисунок 2 - Частоти aeHomunie полiморфiзму C148T гену в-fibrinogen в досл'джуваних групах
Так, нормальний варiант полiморфiзму у го-мозиготнш формi СС зустрiчався лише у 37,5 % обстежених проти половини жшок з безплщдям без порушень печiнки. Гетерозиготна форма по-лiморфiзму СТ вiдмiчена вiдповiдно у половини жшок обох груп. Мутантний варiант полiморфiз-му, пов'язаний зi збтьшенням ризику тромбозiв та iнших патолопчних станiв, у гомозиготнiй фо-рмi вiдмiчено у 25,0 % жшок 1-1 групи, а у жшок 2-1 групи - не в^^чався. Таким чином, 70,0 % жшок з безплщдям та порушеннями печшки та половина жшок бул
ту Т полiморфiзму у гетеро- або гомозиготнш формi проти половини жшок без таких порушень, що значно перевищуе показники европей-ськоТ популяцп згiдно лiтературних даних.
Дослщженнями розподiлу частот варiантiв генотипiв за полiморфiзмом -455GA гену в-АЬпподеп у ж1нок з безплiддям при порушеннях печiнки встановлено зниження частоти протек-тивного алелю G i збiльшення частоти алелю А, вщповщального за ризик розвитку тромбозiв та акушерських ускладнень (рисунок 3) переважно
и (вА).
и носами мутантного вар!ан- за рахунок гетерозиготно! форм
100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%
25
50
2^
50
1 -а група
50
2-а група
□ -АА
□ - СтА
□ -ОО
Рисунок 3 - Частоти генотип1в пол1морф1зму -455GA гену в-АЬпподеп в дослджуваних групах
Таблиця 2.
Сполучення генотипов С148Т, -455GA гену в-АЬпподеп у жнок з безпл1ббям та патолог1ею гепатобт1рноГсистеми, абс.ч. (%)
Сполучення генотипiв eNOS 1-а, п= 8 2-а, п= 10
СС х GG 2 (25,0) 5 (50,0)
СС х GА - -
СС х АА - -
СТ х GG - -
СТ х GА 4 (50.0) 5 (50,0)
СТ х АА - -
ТТ х GG - -
ТТ х GА - -
ТТ х АА 2 (25,0) -
Досить рщкюний у загальнш популяцп гомо-зиготний варiант АА спостер^ався у 25,0 % жшок 1-1 групи.
Аналiз можливих сполучень полiморфiзмiв С148Т, -455GA гену в-АЬпподеп у жшок з безплщдям показав (таблиця 2), що з 9 можливих сполучень в^^чено лише 3 варiанти, причому у жшок обох груп повнютю совпадали як гомозиготы форми, так i гетерозиготн форми обох по-лiморфiзмiв, а сполучення гомозиготних форм, як обумовлюють розвиток тромбозiв та акушерських ускладнень, зус^чались лише у жшок з безплщдям та гепатоб^арною патолопею.
Висновки та перспективи подальших розробок
Проведеними дослщженнями встановлено
пщвищення частоти полiморфiзмiв С148Т, -455GA гену в-АЬпподеп та Т'х несприятливих сполучень у жшок з безплщдям та функцюналь-ними порушеннями гепатоб^арноТ системи, що вказуе на схильнють до розвитку тромбозiв та акушерських ускладнень.
Наявнють алельних варiантiв гену в-fibrinogen е преморбiдним тлом, на якому мо-жуть розвинутися репродуктивн порушення, оцiнка генетичного статусу жшки дозволить про-гнозувати ефективнiсть програм ДРТ, здшсню-вати прегравiдарну пщготовку для запобiгання можливих акушерських i перинатальних усклад-нень.
Лтература
The role of thrombophilia and thyroid autoimmunity in unexplained infertility, implantation failure and recurrent spontaneous abortion / Jose' Bellver, S.R. Soares, C. A'lvares [et all.] // Human reproduction. - 2008. - V. 23, N 2. - P. 278-284. Джанджгава Ж.Г. Неудачи ЭКО и материнская тромбофилия / Ж.Г. Джанджгава, В.О. Бицадзе // Проблемы репродукции. -2005. - N 5. - С. 41-43.
Баранов В.С. Определение наследственной предрасположенности к некоторым частым заболеваниям при беременности / В.С. Баранов, Э.К. Айламазян. - СПб. : Н-Л, 2009. - 66 с. Саидова Р.А. Исследование состояния системы гемостаза у женщин с подозрением на гиперпластические процессы эндометрия в репродуктивном периоде / Р.А. Саидова, Е.В. Федина // Вестник новых медицинских технологий. - 2006. - Вып. № 3, том XIII. - С. 55-57.
Caldwell S.H. Coagulation disorders and hemostasis in liver disease: pathophysiology and critical assessment of current management / S.H. Caldwell, M. Hoffman, T. Lisman [et all.] // Hepatology. - 2006. - Vol. 44. - P. 1039-1046. Буланова Е.Л. Нарушения гемостаза у больных с поражениями печени / Е.Л. Буланова // Досягнення бюлогм та медицини. -2012. - № 1(19). - С. 70-75.
Camilleri R. -455G/A p-fibrinogen gene polymorphism, factor V Leiden, prothrombin G20210A mutation and MTHFR C677T, and placental vascular complications / R. Camilleri, S. Raymond, D. Peebles [et all.] // Blood Coagulation & Fibrinolysis. - V. 15. - P. 139-147.
Van 't H.F.M. Two common, functional polymorphisms in the promoter region of the beta-fibrinogen gene contribute to regulation of plasma fibrinogen concentration / H.F.M. Van 't, S.J. Bahr, A. Silveira [et all.] // Arterioscler Thromb Vasc Biol. - 1999. - V. 19 (12). - P. 3063-3070.
Mosesson M.W. Fibrinogen and fibrin structure and functions / M.W. Mosesson // J Thromb Haemost. - 2005. - N 3. - P. 1894-1904.
References
The role of thrombophilia and thyroid autoimmunity in unexplained infertility, implantation failure and recurrent spontaneous abortion / Jose' Bellver, S.R. Soares, C. A'lvares [et all.] // Human reproduction. - 2008. - V. 23, N 2. - P. 278-284. Dzhandzhgava Zh.G. Neudachi EKO i materinskaya trombofiliya / Zh.G. Dzhandzhgava, V.O. Bicadze // Problemy reprodukcii. - 2005.
- N 5. -S. 41-43.
Baranov V.S. Opredelenie nasledstvennoj predraspolozhennosti k nekotorym chastym zabolevaniyam pri beremennosti / V.S. Baranov, E.K. Ajlamazyan. - SPb. : N-L, 2009. - 66 s. Caidova R.A. Issledovanie sostoyaniya sistemy gemostaza u zhenschin s podozreniem na giperplasticheskie processy endometriya v reproduktivnom periode / R.A. Caidova, E.V. Fedina // Vestnik novyh medicinskih tehnologij. - 2006. - Vyp. № 3, tom HIII.
- S. 55-57.
Caldwell S.H. Coagulation disorders and hemostasis in liver disease: pathophysiology and critical assessment of current management / S.H. Caldwell, M. Hoffman, T. Lisman [et all.] // Hepatology. - 2006. - Vol. 44. - P. 1039-1046. Bulanova E.L. Narusheniya gemostaza u bol'nyh s porazheniyami pecheni / E.L. Bulanova // Dosyagnennya biologi'' ta medicini. -2012. - № 1(19). - S. 70-75.
Camilleri R. -455G/A ß-fibrinogen gene polymorphism, factor V Leiden, prothrombin G20210A mutation and MTHFR C677T, and placental vascular complications / R. Camilleri, S. Raymond, D. Peebles [et all.] // Blood Coagulation & Fibrinolysis. - V. 15. - P. 139-147.
Van 't H.F.M. Two common, functional polymorphisms in the promoter region of the beta-fibrinogen gene contribute to regulation of plasma fibrinogen concentration / H.F.M. Van 't, S.J. Bahr, A. Silveira [et all.] // Arterioscler Thromb Vasc Biol. - 1999. - V. 19 (12). - P. 3063-3070.
Mosesson M.W. Fibrinogen and fibrin structure and functions / M.W. Mosesson // J Thromb Haemost. - 2005. - N 3. - P. 1894-1904.
Реферат
ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА ФИБРИНОГЕН БЕТА У ЖЕНЩИН С БЕСПЛОДИЕМ И ЗАБОЛЕВАНИЯМИ ПЕЧЕНИ Жданович О.И., Коломийченко Т.В., Бойчук О.Г.
Ключевые слова: бесплодие, вспомогательные репродуктивные технологии, патология печени, гемостаз, ген p-fibrinogen.
Исследовано 18 женщин с трубно-перитонеальным бесплодием, среди них 8 женщин с функциональными нарушениями гепатобилиарной системы (первая группа), остальные 10 женщин без таких признаков составили вторую группу. К функциональным нарушениям относили наличие УЗИ-признаков нарушений печени и биохимических маркеров. Проведенными исследованиями установлено повышение частоты полиморфизмов C148T, -455GA гена p-fibrinogen и их неблагоприятных сочетаний у женщин с бесплодием и функциональными нарушениями гепатобилиарной системы, указывает на склонность к развитию тромбозов и акушерских осложнений. Наличие аллельных вариантов гена p-fibrinogen является преморбидным фоном, на котором могут развиться репродуктивные нарушения, оценка генетического статуса женщины позволит прогнозировать эффективность программ ВРТ, осуществлять прегравидарную подготовку для предотвращения возможных акушерских и перинатальных осложнений.
Summary
BETA-FIBRINOGEN GENE POLYMORPHISMS IN WOMEN WITH INFERTILITY AND LIVER DISEASE Zhdanovich O.I., Kolomiychenko T.V., Boychuk O.G.
Key words: infertility, assisted reproductive technologies, liver disease, hemostasis, gene p-fibrinogen.
The study involved 18 women with tubal-peritoneal infertility, including 8 women with functional disorders of the hepatobiliary system (the 1st group), the remaining 10 women with no such evidence made up the 2nd group. Functional disorders included the ultrasound evidence of liver affections and biochemical markers. Our investigations revealed increased frequency of polymorphisms C148T, -455GA gene p-fibrinogen and their adverse combinations in women with infertility and functional disorders of the hepatobiliary system that indicated a tendency to develop thrombosis and obstetrical complications. The presence of allelic variants of the gene p-fibrinogen is premorbid background, which can contribute the development of reproductive disorders, therefore genetic evaluation of the status of women will predict the effectiveness of ART programs, and carry out prenatal care to prevent possible obstetric and perinatal complications.
2
2
3
3
4
4
б
б
6
6
7
7
S
S
9
9
