CC BY
56
УДК 616.36-005.8
л.а. гараева, С.д. маянская
Казанский государственный медицинский университет, 420012, г. Казань, ул. Бутлерова, д. 49
Полиморфизм генов трансформирующего фактора роста, липопротеинлипазы, фибриногена и гликопротеина 3 альфа у пациентов с коронарным атеросклерозом различной степени тяжести
Гараева Лилия Айратовна — аспирант кафедры госпитальной терапии, тел. +7-937-773-97-30, e-mail: [email protected] Маянская Светлана дмитриевна — доктор медицинских наук, профессор кафедры госпитальной терапии, тел. +7-905-316-99-66, e-mail:[email protected]
В статье представлены данные об ассоциации полиморфизмов однонуклеотидных локусов генов фибриногена бета rs1800788(FGB), липопротеинлипазы rs328(LPL), гликопротеина 3 альфа rs5918(GpIIIa) и трансформирующего фактора роста бета rs1800469(TGF) с тяжестью течения коронарного атеросклероза у 319 больных. Все пациенты были разделены на группы сравнения по конечным точкам в виде однократных и повторных инфарктов миокарда. В каждой группе изучалась частота встречаемости редких аллелей. Получены данные об ассоциации генотипов с частотой развития повторных инфарктов миокарда: С аллели rs328 (OR = 2,92, 95 %C.I. = (1,39-6,11), P = 0,005), T аллели rs1800788 (OR = 1,91, 95 %C.I. = (1,15-3,17), P = 0,01) и Т аллели rs1800469 (OR = 1,88, 95 %C.I. = (1,12-3,16), P = 0,02). Ассоциации ни одного из перечисленных генов с однократными инфарктами миокарда, а также ассоциации rs5918 ни с одним из изучаемых параметров обнаружено не было.
Ключевые слова; повторный инфаркт миокарда, прогрессирование коронарного атеросклероза, ассоциация полиморфизмов генов фибриногена бета, липопротеинлипазы, гликопротеина 3 альфа, трансформирующего фактора бета.
L.A. GARAEVA, s.D. MAYANsKAYA
Kazan State Medical University, 49 Butlerov Str., Kazan, Russian Federation, 420012
Transforming growth factor beta, lipoprotein lipase, fibrinogen and glycoprotein 3 alpha gene polymorphisms in patients with coronary atherosclerosis of various severity
garaeva L.A. — postgraduate student of the Department of Hospital Therapy, tel. +7-937-773-97-30, e-mail: [email protected] Mayanskaya s.D. — D. Med. Sc., Professor of the Department of Hospital Therapy, tel. +7-905-316-99-66, e-mail: [email protected]
The article presents data on the associations of polymorphisms of single nucleotide ooci of genes of transforming growth factor beta (rs5918), lipoprotein lipase (rs328), fibrinogen (rs1800788) and glycoprotein 3 alpha (rs5918) with severity of coronary atherosclerosis in 319 patients. All patients were divided into comparison groups according to the endpoints of single and recurrent myocardial infarctions. In each group the frequency of occurrence of rare alleles was examined. Recurrent myocardial infarction was highly associated with alleles of the following gene polymorphisms: rs1800788(FGB)(OR = 1,91, 95 %C.I. = (1,15-3,17), P = 0,01), rs328(LPL) (OR = 2,92, 95 %C.I. = (1,39-6,11), P = 0,005) and rs1800469(TGF) (OR = 1,88, 95 %C.I. = (1,12-3,16), P = 0,02). Associations of these genes with single myocardial infarctions, as well as association of glycoprotein 3 alpha (rs5918) gene polymorphism were not revealed.
Key words: recurrent myocardial infarction; progression of coronary atherosclerosis; association of transforming growth factor beta, lipoprotein lipase, fibrinogen and glycoprotein 3 alpha gene polymorphisms.
ременные вопросы диагн
Несмотря на достигнутые успехи в диагностике и лечении, ишемическая болезнь сердца остается одной из главных причин смертности в большинстве развитых стран мира. Многообразие различных морфологических изменений в коронарных сосудах — от вялотекущего атеросклеротического процесса с периодически возникающей дестабилизацией бляшки и последующими тромбозами до острого коронароспазма [1] — способствовало выделению большого количества клинических вариантов ИБС, которые включают в себя как нестабильную стенокардию с разной степенью выраженности ее проявлений, так и острый инфаркт миокарда. Общность морфологического субстрата, нестабильность «уязвимой» атеросклеротической бляшки, объединяет эти варианты под единым названием «острый коронарный синдром» (ОКС) [2] и позволяет рассматривать их как цепь последовательно возникающих событий в сосудах, а затем и в миокарде.
Учитывая волнообразный характер течения ОКС, а также выявленный при нем целый ряд маркеров острой фазы воспаления, можно предположить, что и нестабильная стенокардия, и острый инфаркт миокарда протекают по всем правилам воспалительного процесса. Условия развития ОКС включают эндотелиальную дисфункцию, скорость и системность тромбогенеза, степень активации огромного количества медиаторов воспаления, включающих белки острой фазы, лейкотриены, цитокины, про-станоиды, протеазы и кислородзависимые свободные радикалы, а также биоцидный потенциал самих клеток-эффекторов воспаления [3, 4]. В недрах воспалительного процесса зарождаются предпосылки для будущей репарации и фиброгенеза органов-мишеней. Таким образом, прогрессирование атеросклеротического процесса включает целый комплекс патологических реакций, среди которых выделяют воспалительный процесс, нарушение метаболизма липидов и патологию свертывания крови. Эти процессы меняются по-разному на этапе инициации атеросклеротического поражения и в условиях уже сформировавшегося тяжелого атеросклероза на стадии развития фатальных осложнений.
Полиморфизм генов может значительно влиять на количество и активность, поэтому представляется важным оценить генетические вариации некоторых белков, участвующих в атерогенезе.
Цель исследования — изучить распространенность полиморфизма генов трансформирующего фактора роста бета, липопротеинлипазы, фибриногена бета и гликопротеина 3 альфа у пациентов с различными проявлениями коронарного атеросклероза и ассоциацию полиморфизма генов с тяжестью
течения коронарного атеросклероза и частотой развития фатальных осложнений.
Материал и методы. Были обследованы 319 человек в возрасте от 44 до 73 лет с верифицированным по данным ангиографии атеросклерозом, находившиеся на стационарном лечении в сосудистом отделении № 1 РКБ МЗ РТ, а также в кардиологических отделениях городской клинической больницы № 7 г. Казани. Пациентам проводилась коронароангиография, а также ангиография сосудов брюшной части аорты, нижних конечностей, ветвей дуги аорты по показаниям, оценивались общий анализ крови, липидный спектр и коагуло-грамма. Диагноз ОКС верифицировался с помощью данных ЭКГ и исследования уровня тропонинов в крови. У всех пациентов был взят образец венозной крови для генотипирования однонуклеотидных полиморфных локусов (ОНП) генов фибриногена бета rs1800788(FGB), липопротеинлипазы rs328(LPL), гликопротеина 3 альфа rs5918(GpIIIa) и трансформирующего фактора роста бета rs1800469(TGF).
Полная клинико-лабораторная характеристика обследованных пациентов отображена в табл. 1.
Генотипирование однонуклеотидных полиморн-фых локусов проводили с помощью реакции преципитации в режиме реального времени с использованием конкурирующих TaqMan-зондов. Для статистической обработки использованы пакеты статистики Genetics и HardyWeinberg программного обеспечения R-project (www.r-project.org). Соответствие равновесию Харди-Вайнберга оценивали с помощью точного теста Фишера (p exact).
Результаты. В исследование вошли пациенты с верифицированным атеросклеротическим поражением различной степени тяжести (n = 319). Все пациенты были разделены на группы сравнения по нескольким признакам. В первом случае группы сравнения были сформированы в зависимости от наличия острого или перенесенного инфаркта миокарда. В группу с более тяжелым течением (первая группа, n = 164) вошли пациенты, имеющие либо острый инфаркт миокарда, верифицированный по данным ангиографии, анализов крови, ЭКГ и эхо-кардиографии (ЭХОКГ), либо пациенты с хотя бы одним установленным по данным ангиографии, ЭКГ, ЭХОКГ и анамнеза перенесенным инфарктом миокарда. В группу с более легким течением были включены пациенты с атеросклерозом без верифицированного острого и перенесенного инфаркта миокарда (вторая группа, n = 155).
В дальнейшем эти же пациенты были разделены на группы сравнения в зависимости от наличия
Таблица 1.
Клиническая характеристика пациентов (n = 319)
Характеристика пациентов Количество пациентов
Абс %
Мужчины 199 62,7
Женщины 119 37,3
Наличие гипертонической болезни 219 77,4
Наличие ИБС 182 78,1
Наличие острого или перенесенного инфаркта миокарда 164 51,4
Наличие повторного инфаркта миокарда 39 12,2
повторного инфаркта миокарда. В группу с более тяжелым течением (первая группа, п = 39) вошли пациенты с острым инфарктом миокарда на фоне постинфарктного кардиосклероза, а также пациенты с двумя и более верифицированными перенесенными инфарктами миокарда. В группе с более легким течением рассматривались пациенты без повторных инфарктов миокарда (вторая группа, п = 270).
Распределение генотипов исследуемых ОНП в зависимости от тяжести течения атеросклеротиче-ского процесса представлено в табл. 2 и 3. Распределение частот встречаемости ОНП в общей группе соответствует распределению Харди-Вайнберга.
В каждом случае изучалась ассоциация редкого аллеля с выраженностью патологического процесса. Частота редкого аллеля рассчитывалась путем сложения гомо- и гетерозиготных генотипов, несущих данную аллель.
Исследование проводилось с помощью логистического регрессионного анализа, на основании результатов которого вычисляли отношение шансов и уровень значимости полученных результатов. Критический уровень значимости принимали равным 0,05. Результаты представлены в табл. 4 и 5.
Ввиду значимости гиперхолестеринемии и гипер-тензии для прогрессирования атеросклеротическо-го процесса, помимо стандартных поправок на пол и возраст, в регрессионную модель были введены поправки на высокий уровень общего холестерина и наличие гипертензии.
Исходя из данных табл. 4 видно, что достоверных различий генотипа в группах сравнения, разделенных по наличию острого или однократного перенесенного инфаркта миокарда, получено не было. В то же время получены значимые отличия в группах, разделенных по наличию повторного инфаркта миокарда. С частотой возникновения тяжелых поражений в виде повторного инфаркта ассоциируются С аллель гена липопротеинлипазы (ОЯ = 2,92, 95 %С.1. = (1,39-6,11), Р = 0,005), Т аллель гена фибриногена (ОЯ = 1,91, 95 %С.1. = (1,15-3,17), Р = 0,01) и Т аллель гена трансформирующего фактора роста Ь (ОЯ = 1,88, 95 %С.1. = (1,12-3,16), Р = 0,02). Ассоциации между развитием повторного инфаркта миокарда и частотой встречаемости гена гликопротеина 3 альфа получено не было (табл. 5).
Обсуждение. В целом влияние пептидов, которые кодируются исследованными генами, на атеро-генез достаточно широко изучено. Однако полученные результаты свидетельствуют о значительном вкладе полиморфизма генов фибриногена, липо-протеинлипазы и трансформирующего фактора роста именно на терминальных стадиях атероскле-ротического поражения, что несомненно является интересным предметом для изучения.
Необходимо отметить, что полиморфизмы выбранных нами генов-кандидатов неоднократно изучались ранее в их ассоциации с частотой развития атеросклероза в тех или иных популяциях. Некоторые исследователи также рассматривали их вли-
Таблица 2.
Распределение генотипов ГОБ гс1800788, ¡.Р1 ^328, врШа ^5918 и ГвР ^1800469 в зависимости от наличия острого или перенесенного инфаркта миокарда
Группы пациентов Количество пациентов с генотипом FGBrs1800788
с/с сД
Первая группа, п = 164 69 86 9
Вторая группа, п = 155 86 49 20
Всего, п = 319 155 135 29
LPL ^328
с/с с/д д/д
Первая группа, п = 164 148 14 2
Вторая группа, п = 155 127 28 0
Всего, п = 319 275 42 2
GpШa ^5918
с/с сД
Первая группа, п = 164 4 28 132
Вторая группа, п = 155 3 40 112
Всего, п = 319 7 68 144
ГСЯ ^1800469
с/с сД
Первая группа, п = 164 79 69 16
Вторая группа, п = 155 70 73 12
Всего, п = 319 149 142 28
Примечание: с/, V, д/ аллели полиморфных участков
Таблица 3.
Распределение генотипов FGB ^1800788, LPL rs328, GpIIIa гс5918 и TGF rs1800469 в зависимости от наличия повторного инфаркта миокарда
Количество пациентов с генотипом FGB rs1800788
c/c c/t t/t
Первая группа, п = 39 10 25 49
Вторая группа, п = 270 145 110 25
Всего, п = 319 155 135 29
LPL rs328
c/c c/g g/g
Первая группа, п = 39 29 8 2
Вторая группа, п = 270 246 34 0
Всего, п = 319 275 42 2
GpIIIa rs5918
c/c c/t t/t
Первая группа, п = 39 4 4 31
Вторая группа,п = 270 3 64 213
Всего, п = 319 7 68 144
TGF rs1800469
c/c c/t t/t
Первая группа, п = 39 10 24 5
Вторая группа,п = 270 139 118 23
Всего, п = 319 149 142 28
Примечание: с/, Ь/, д/ аллели полиморфных участков Таблица 4.
Ассоциация полиморфных локусов FGB ^1800788, LPL ^328, GpIIIa rs5918 и TGF rs1800469 в зависимости от наличия острого или перенесенного инфаркта миокарда
ОНП Первая группа (n = 164) Вторая группа (n = 155) OR, 95 % C.I., P-value
rs328 (LPL) c/c - 148 c/g + g/g - 14+2 c/c - 127 c/g + g/g - 28+0 0.60 [0.32-1.11] p = 0.10
rs5918 (Gp3a) t/t - 132 c/c + c/t - 28+4 t/t - 112 c/c + c/t - 40+3 0.70 [0.44-1.12] p = 0.13
rs1800788 (FGB) c/c - 69 c/t + t/t - 86+9 c/c - 86 c/t + t/t - 49+20 1.17 [0.83-1.66] p = 0.37
rs1800469 (TGF) c/c - 79 c/t + t/t - 69+16 c/c - 70 c/t + t/t - 73+12 0.92 [0.65-1.31] p = 0.65
Примечание. OR — отношение шансов, 95 % C.I. — доверительный интервал, P-value — уровень значимости.
яние на прогрессирование атеросклероза в виде связи полиморфизмов с количественными параметрами ангиографии, а также наличием фатальных осложнений, в частности инфарктов. Однако нами не было обнаружено ни одного исследования, рассматривающего полиморфизмы именно с позиции повторного инфаркта миокарда, что, возможно, может вносить некоторые корректировки и требует серьезного дальнейшего изучения.
Так, трансформирующий фактор роста Ь — ци-токин с плейотропным эффектом, включается в процесс атерогенеза на многих уровнях. С одной стороны, он уменьшает активацию и пролиферацию гладкомышечных клеток, предотвращает накопление макрофагами холестерина в бляшке, а противовоспалительный его эффект проявляется в
уменьшении цитокин-зависимой экспрессии хемо-кинов и молекул адгезии. С другой стороны, повышенный уровень TGF Ь приводит к гиперпродукции экстрацеллюлярного матрикса, что может провоцировать фиброзирование, участвует в активации металлопротеиназы, замешанной в нестабильности бляшки, а также однозначно провоцирует ремоде-лирование сосудов [5].
Существует ряд мнений о стабилизирующем эффекте цитокина на ранних этапах атерогенеза, однако многочисленные исследования обнаруживают его патологическое влияние на этапе формирования фатальных осложнений [6].
Полиморфизм однонуклеотидного локуса ^1800469 гена TGF однозначно приводит к повышению концентрации цитокина благодаря потере
Таблица 5.
Ассоциация полиморфных локусов FGB ^1800788, LPL rs328, GpIIIa rs5918 и TGF rs1800469 в зависимости от наличия повторного инфаркта миокарда
ОНП Первая группа (n = 39) Вторая группа (n = 280) OR, 95 %C.I., P-value
rs328 (LPL) c/c - 29 c/g + g/g - 8 +2 c/c - 246 c/g + g/g - 34 +0 2.92 [1.39-6.11] p = 0.005
rs5918 (Gp3a) t/t - 31 c/c + c/t - 4+4 t/t - 213 c/c + c/t - 64 +3 1.21 [0.64-2.31] p = 0.56
rs1800788 (FGB) c/c - 10 c/t + t/t - 25 + 4 c/c - 145 c/t + t/t - 110 +25 1.91 [1.15-3.17] p = 0.01
rs1800469 (TGF) c/c - 10 c/t + t/t - 24 + 5 c/c - 113 c/t + t/t - 118 + 23 1.88 [1.12-3.16] p = 0.02
Примечание. OR — отношение шансов, 95 % C.I. — доверительный интервал, P-value — уровень значимости.
негативного влияния факторов транскрипции [7]. Поэтому полученные нами данные об ассоциации редкого -509-Т аллеля с риском возникновения повторного инфаркта миокарда подтверждают гипотезу об отрицательном влиянии цитокина на поздних стадиях атерогенеза. В целом немногочисленные исследования полиморфизма цитокина как отрицают какое бы то ни было его влияние на атерогенез, так и представляют выводы, согласующиеся с нашими [8, 9].
Липопротеинлипаза является одним из ключевых ферментов метаболизма липидов и отвечает за утилизацию наиболее богатых липидами липопротеи-нов. Многочисленные исследования доказывают, что при снижении количества или активности фермента в крови существенно повышается уровень триглицеридов, что указывает на его антиатероген-ные свойства.
Мутация гена липопротеинлипазы на участке S447x (^328) — один из наиболее частых вариантов полиморфизма этого гена, который приводит к укорочению фермента и повышению его активности, а также снижению уровня триглицеридов [10]. Некоторые исследователи предполагают, что все это может оказывать протективный эффект в отношении частоты развития атеросклероза, хотя в большинстве случаев различия в группах сравнения минимальны [11].
Полученные данные свидетельствуют, скорее, о прямой проатерогенной роли липопротеинлипазы в отношении прогрессирования заболевания. Это может объясняться тем, что помимо утилизации триглицеридов из плазмы, липопротеинлипаза, синтезируемая макрофагами, провоцирует накопление ими жиров и формирование пенистых клеток, что соответственно приводит к формированию нестабильной бляшки [12] и может проявляться именно на поздних этапах атерогенеза.
В то же время участие фибриногена в прогресси-ровании атеросклероза достаточно широко изучено. Фибриноген провоцирует пролиферацию и миграцию клеток в бляшку так же, как и его метаболит фибрин. Помимо этого, метаболиты фибриногена также притягивают лейкоциты в глубокие слои бляшки и способствуют накоплению липидов, участвуя в образовании нестабильной, богатой жирами бляшки [13]. Существуют многочисленные исследования об участии повышенного уровня фибриногена в формировании тяжелых форм атеросклероза [14].
Однако данные литературы ставят под сомнение влияние полиморфизма ^1800788 бета цепи фибриногена на его количество и активность [15].
И хотя некоторые исследователи находят ассоциацию полиморфизма с частотой возникновения атеросклероза, его участие в атерогенезе, по-прежнему, остается спорным, хотя, по нашим данным, значимость полиморфизма rs1800788 в развитии тяжелых осложнений атеросклеротического процесса вполне вероятна.
Существуют также данные об участии фибриногена в атерогенезе посредством аккумуляции и агрегации тромбоцитов [16]. Основным рецептором фибриногена на поверхности тромбоцитов является гликопротеид-3-альфа. Однако в нашем исследовании его полиморфизм не показал никакого влияния ни на одну из конечных точек. Это позволяет задуматься о том, что, возможно, тромбообразование, в отличии от воспаления и нарушения метаболизма липидов, не является основным механизмом в развитии именно тяжелых форм атеросклеротического поражения.
Заключение. Таким образом, в результате исследования была обнаружена ассоциация rs328 гена липопротеинлипазы, rs1800788 гена бета цепи фибриногена и rs1800469 гена трансформирующего фактора роста с частотой развития повторных инфарктов миокарда. В то же время связи полиморфизмов с острым коронарным синдромом или однократным перенесенным инфарктом обнаружено не было, что может говорить о влиянии генотипа этих белков именно на этапе значительного атеросклеротического поражения. Не было обнаружено связи полиморфизма rs5918 гена гликопротеида 3 альфа ни с одним из изучаемых параметров, что может свидетельствовать о менее существенной роли тромбообразования в развитии тяжелого атеросклероза. Учитывая противоречивые данные литературы, требуются дополнительные исследования влияния полиморфизмов rs1800788, rs328, rs5918 и rs1800469 на тяжесть течения коронарного атеросклероза и развитие его фатальных осложнений.
ЛИТЕРАТУРА
1. Davies M.J. Risk of thrombosis in human atherosclerotic plaque: role of extracellular lipid, macrophage, and smooth muscle cell content / M.J. Davies, P.D. Richardsom, N. Woolf et al. // British Heart Journal. — Vol. 69. — 1993. — Pp. 377-381.
2. Gorlin R. Anatomic-physiologic links between acute coronary syndromes / R. Gorlin, V. Fuster, J.A. Ambrose // Circulation. — Vol. 74. — 1986. — Pp. 6-9.
3. Falk E. Coronary plaque disruption / E. Falk, P.K. Shah, Fuster V. // Circulation. — Vol. 92. — 1995. — Pp. 657-671.
4. Luscher T.F. Endothelium dysfunction in the co-ronary circulation / T.F. Luscher, G Noll / Journal of Cardiovascular Pharmacology. — Vol. 24. — No. 3. — 1994. — Pp. 16-26.
ременные вопросы диагностики
5. Grainger D.J. TGF-ß and atherosclerosis in man / D.J. Grainger // Cardiovascular Research. — Vol. 7. — No. 2. — 2007. — Pp. 213-222.
6. Xu S. Liu AC. Common pathogenic features of atherosclerosis and calcific aortic stenosis: role of transforming growth factor-beta / Xu S. Liu AC, Gotlieb AI. // Cardiovascular Pathology. — Vol. 19. — No. 4, 201. — Pp. 236-247.
7. Shah R. A molecular mechanism for the differential regulation of TGF-betal expression due to the common SNP -509C-T (c. -1347C > T) / R. Shah, C.K. Hurley, P.E. Posch // Human genetics. — Vol. 120. — 2006. — Pp. 461-469.
8. Sie M.P. TGF-beta 1 polymorphisms and risk of myocardial infarction and stroke: the Rotterdam Study / M.P. Sie, A.G. Uitterlinden, M.J. Bos et al. // Stroke. Vol. 37. — 2006. — Pp. 2667-2671.
9. Cambien F. Polymorphisms of the transforming growth factor-ß1 gene in relation to myocardial infarction and blood pressure: the etude cas-témoin de l'infarctus du myocarde (ECTIM) study / F. Cambien, S. Ricard, A. Troesch et al. // Hypertension. — Vol. 28. — 1996. — Pp. 881-887.
10. Anette Varbo. Remnant Cholesterol as a Causal Risk Factor for Ischemic Heart Disease / Anette Varbo, Marianne Benn, Anne Tybjœrg-Hansen et al. // Journal of the American College of Cardiology. — Vol. 61. — No. 4. — 2013. — Pp. 427-436.
11. Sagoo G.S. Seven Lipoprotein Lipase Gene Polymorphisms, Lipid Fractions, and Coronary Disease: A HuGE Association Review and Meta-Analysis / G.S. Sagoo // American Journal of Epidemiology. — Vol. 168. — No. 11. — 2008. — Pp. 1233-1246.
12. James R. Mead, Dipak P. Ramji. Review The pivotal role of lipoprotein lipase in atherosclerosis / R. James // Cardiovascular Research. — Vol. 55. — 2002. — Pp. 261-269.
13. Papageorgiou N. Is fibrinogen a marker of inflammation in coronary artery disease? / N. Papageorgiou, D. Tousoulis, G. Siasos // Hellenic Journal of Cardiology. — Vol. 51. — 2010. — Pp. 1-9.
14. Luca G. De. High fibrinogen level is an independent predictor of presence and extent of coronary artery disease among Italian population / G. De Luca, M. Verdoia, E. Cassetti et al. // Journal of Thrombosis and Thrombolysis. — Vol. 31. — No. 4. — 2011. — Pp. 458-463.
15. Behague I. ß Fibrinogen Gene Polymorphisms Are Associated With Plasma Fibrinogen and Coronary Artery Disease in Patients With Myocardial Infarction / I. Behague, O. Poirier, V. Nicaud, A. Evans // Circulation. — No. 93. — 1996. — Pp. 440-449.
16. Czaja M. Hemorheological Parameters and Fibrinogen in Atherosclerosis / M. Czaja, M. Kabat, J. Wasilewski // Journal of Cardiology and Therapy. — Vol. 1. — No. 9. — 2014. — Pp. 206-211.
