CC BY
81
УДК 575.174.015.3:615.273.53:572.79 (1-925.14)
ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА VKORC1 (C1173T), ОПРЕДЕЛЯЮЩЕГО ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ИНДИВИДОВ К ВАРФАРИНУ, В ПОПУЛЯЦИЯХ КОРЕННЫХ ЭТНОСОВ СЕЛЬКУПОВ И ТУНДРОВЫХ НЕНЦЕВ, А ТАКЖЕ У РУССКИХ СЕВЕРНОЙ СИБИРИ
Р. П. Корчагина, Л. П. Осипова, Н. А. Вавилова, Е. Н. Воронина, М. Л. Филипенко
THE POLYMORPHISM OF THE VKORC1 (C1173T) GENE, DETERMINING INDIVIDUAL SUSCEPTIBILITY TO WARFARIN, IN POPULATIONS OF INDIGENOUS PEOPLES OF SELKUPS AND TUNDRA NENETS AND IN THE RUSSIANS OF NORTHERN SIBERIA
R. P. Korchagina, L. P. Osipova, N. A. Vavilov., E. N. Voronina, M. L. Filipenko
Проведено исследование полиморфизма VKORC1 C1173T в популяциях коренных самодийских этносов, селькупов и тундровых ненцев, а также у русских Северной Сибири в связи с определением популяционной чувствительности к антикоагулянту варфарину. Показано, что в изученных самодийских популяциях, по сравнению с русскими Северной Сибири, существенно преобладает мутантный гомозиготный генотип VKORC1 1173TT, частота которого составляет 57,1 % у тундровых ненцев, 71,8 % у селькупов и 13,6 % у русских. Частоты аллеля VKORC1 1173Т у самодийцев (74,7 % у тундровых ненцев; 84,6 % у селькупов) значительно и достоверно превышают таковые для русских Северной Сибири (36,9 %). Результаты проведенного исследования могут быть использованы в протоколах дозирования варфарина в целях достижения максимально безопасной и эффективной терапии.
In relation with determining population sensitivity to warfarin the study of the VKORC1 C1173T polymorphism in Northern Siberia populations of indigenous Samoedic peoples (Selkups and Tundra Nenets) and also in Russians has been conducted. It was revealed, the mutational genotype VKORC1 1173TT considerably dominations in studied Samoedic populations as compared with Russians. The frequencies of genotype VKORC1 1173TT were 57,1 % in Tundra Nenets, 71,8 % in Selkups and in 13,6 % Russians. The frequencies of VKORC1 C1173T allele in Tundra Nenets (74,7 %) and Selkups (84,6 %) essentially and reliably are above ones in Russians of Northern Siberia (36,9 %). Our data can be used in the protocols of recommendations for dosing warfarin with a view to reaching at most safe and efficient therapy in populations of native residents of Northern Siberia.
Ключевые слова: VKORC1 C1173T, антикоагулянт варфарин, коренные этносы Северной Сибири, realtime PCR.
Keywords: VKORC1 C1173T, anticoagulant warfarin, indigenous peoples of Northern Siberia, real-time PCR.
Введение
Ген УКОЯС1, локализованный на хромосоме 16 в области р12^21, кодирует субъединицу 1 витамина К эпоксидредуктазного комплекса (УКОЯ). Белок УКОЯС1 состоит из 163 аминокислотных остатков общим размером 18 кДа [10, с. 127 - 140; 15, с. 347 - 353]. УКОЯС1 - это ключевой фермент в цикле витамина К, осуществляющий превращение неактивной формы витамин К 2,3-эпоксида в активную восстановленную форму витамин К-гидро-хинон. Витамин К-гидрохинон является кофактором для фермента у-глутамилкарбоксилазы, которая катализирует реакцию посттрансляционного карбок-силирования остатков глутаминовой кислоты в витамин К-зависимых белков (факторы свертывающей и противосвертывающей систем крови, белки костного метаболизма), тем самым активируя данные факторы [8, с. 1 - 7; 10, с. 127 - 140].
Фермент УКОЯС1 является «мишенью» для непрямых антикоагулянтов кумаринового ряда, к которому относится варфарин, широко применяющийся в лечении и профилактике тромбозов, инфарктов и других сердечно-сосудистых осложнений [3, с. 177 - 179; 16, с. 1 - 6; 22, с. 1013 - 1021]. Однако во время терапии варфарином у пациентов могут развиться нежелательные побочные реакции в виде кровотечений. Наиболее опасными из них являются желудочно-кишечные кровотечения и кровоизлияние в мозг [6, с. 72 - 77]. Для повышения безопасно-
сти применения антикоагулянта необходимо учитывать все предрасполагающие факторы к развитию кровотечений (вес, пол, возраст пациента, наличие сопутствующих заболеваний др.), в том числе и генетическую предрасположенность, обусловленную этнической принадлежностью индивида [5, с. 77 -79; 13, с. 1609 - 1616; 14, с. 3827 - 3834].
Риск возникновения кровотечений у индивидов связан с полиморфизмом в нескольких генах [4, 7]. Одним из таких полиморфизмов является УКОЯС1 С1173Т в гене УКОЯС1, обусловленный заменой остатка цитозина на остаток тимина в позиции 1173 первого интрона гена (ге9934438). Этот полиморфный вариант, приводящий к снижению активности фермента, ассоциирован с повышенной чувствительностью индивидов к варфарину [21, с. 262 -270]. Индивидам с мутантным аллелем УКОЯС1 1173Т требуются более низкие дозы варфарина, по сравнению с носителями нормального аллеля УКОЯС1 1173С, причем средняя ежедневная доза снижается на 43 % для гомозигот УКОЯС1 1173ТТ и на 22 % для гетерозигот УКОЯС1 1173СТ [9, с. 645 -649]. По данным разных исследователей, аллель УКОЯС1 1173Т встречается примерно у 9 % африканцев, 36 - 45 % европейцев и 84 - 92 % азиатов [12, с. 611 - 613; 17, с. 1723 - 1729; 22, с. 1013 -1021].
Основанием для проведения настоящего исследования является отсутствие сведений о распро-
страненности полиморфизма VKORC1 C1173T, определяющего чувствительность индивидов к варфа-рину, в популяциях коренных малочисленных этносов и у русских Северной Сибири, в связи с повсеместно увеличивающейся в настоящее время частотой сердечно-сосудистых заболеваний. Цель исследования - изучить распределение полиморфизма VKORC1 C1173T в популяциях коренных самодийских этносов селькупов и тундровых ненцев, а также у русских Северной Сибири.
Материалы и методы
В исследовании приняли участие этнические представители селькупов и тундровых ненцев, проживающих в Ямало-Ненецком автономном округе (ЯНАО) РФ, а также русских, проживающих в ЯНАО и Красноярском крае (территория Северной Сибири). Тундровых ненцев и селькупов относят к самодийской ветви уральской языковой семьи. По антропологическим и генетическим данным, в их генофондах фиксируются европеоидная и монголоидная компоненты [1, с. 103 - 145; 2, с. 129 - 140]. Селькупский этнос в настоящее время представлен южными селькупами, расселенными в основном на территории Томской области, и северными селькупами, живущими на территориях Туруханского района Красноярского края и ЯНАО. Согласно переписи 2002 г, на территории ЯНАО проживают 1797 селькупов [http://www.perepis2002.ru/ct/html/TOM _13_01.htm]. Ненцы - самый крупный из самодийских этносов, который включает в себя европейских и сибирских тундровых и лесных ненцев. Тундровые ненцы составляют основу коренного населения ЯНАО и Ненецкого автономного округа. Согласно переписи 2002 г, на территории ЯНАО проживают
26435 ненцев [http://www.perepis2002.ru/ct/html/ TOM_13_01. htm].
Генетический материал для исследования собирался во время экспедиций в Ямало-Ненецкий автономный округ и Красноярский край сотрудниками лаборатории популяционной этногенетики ИЦиГ СО РАН в период 1988 - 2009 гг. под руководством канд. биол. наук Л. П. Осиповой. Забор крови производился квалифицированным медицинским персоналом по международным правилам с использованием «Информированного согласия» от добровольцев, практически здоровых на момент исследования. Выборки, в которые не вошли метисы разных уровней от браков с русским и другими пришлыми этносами, были сформированы из пула этнических представителей селькупов (N = 330) и тундровых ненцев (N = 310). В исследование были также включены 346 представителей этнических русских Северной Сибири.
Образцы ДНК были выделены из лейкоцитарных фракций венозной крови стандартным фенол-хлороформным методом с использованием протеи-назы К. Генотипирование однонуклеотидных замен в гене VKORC1 проводилось в режиме реального времени с использованием конкурирующих TaqMan-зондов, комплементарных полиморфным участкам ДНК. Структуры праймеров и зондов приведены в таблице 1. Общий объем реакционной смеси составлял 25 мкл, смесь содержала ДНК с концентрацией 15 нг/мкл, 300 нМ каждого праймера; по 100 - 200 нМ Taqman-зондов, конъюгированных с FAM или R6G; 200 мкМ dNTPs, амплификационный буфер (650 мМ Tris-HCl, 240 мМ (NH4)2SO4, 0,5 % Tween 20, 35 мМ MgCl2), термостабильную Taq-полимеразу - 0,5 ед. акт./реакц.
Таблица 1
Структуры праймеров и зондов для локуса VKORC1
Последовательность праймеров Последовательность зондов
5'- GGGAGGATAGGGTCAGTG -3' 5 'R6G-CTAGTCCAAGGGTCGATGATC-BHQ2-3'
5'- ACCTGGGCTATCCTCTGTTC -3' 5 '-FAM-CCTAGTCCAAGAGTCGATGATC-BHQ2-3'
ПЦР проводилась в следующих условиях: начальная денатурация 1мин 30 сек при 96 °С; затем 45 циклов, включающих денатурацию при 96°С 8 сек, отжиг праймеров и последующую элонгацию при 60°С в течение 40 сек (каждый шаг сопровождался регистрацией флюоресцентного сигнала в диапазонах, соответствующих интервалам флюоресценции флюорофоров FAM и R6G. Работа проводилась с использованием амплификатора iCycler iQ 4 (Bio-Rad, USA). Полученные данные обрабатывались с помощью программы «Bio-Rad iQ5». Популяционные частоты аллельных вариантов вычисляли на основе наблюдаемых частот генотипов. Оценку соответствия частот генотипов равновесию Харди-Вайнберга проводили с использованием критерия х2
(Пирсона), применяя on-line тест-программу
[http ://ihg2 .helmholtz-muenchen.de/cgibin/hw/hwa1 .pl] (при p > 0,05 равновесие выполняется). Oценку достоверности различий по частотам аллелей между исследованными выборками проводили по критерию х2 с помощью статистической программы Statistica 1993 (при p < 0,05 результаты считались достоверно значимыми).
Результаты и обсуждение
Распределение частот генотипов VKORCl представлено в таблице 2. Во всех выборках наблюдается соответствие распределения частот генотипов равновесию Харди-Вайнберга.
Таблица 2
Частоты УКОЯС! - генотипов и их соответствие равновесию Харди-Вайнберга
в исследованных популяциях
Популяция Размер выборки Генотипы VKORC1 Соответствие частот генотипов равновесию Харди-Вайнберга
CC CT TT
Селькупы 330 2,7 % (9) 25,5 % (84) 71,8 % (237) p = 0,638
Тундровые ненцы 310 7,7 % (24) 35,2 % (109) 57,1 % (177) p = 0,216
Русские Северной Сибири 346 39,9 % (138) 46,5 % (161) 13,6 % (47) p = 0,997
Примечание: в скобках приведено количество лиц с определенным генотипом.
Выявлено, что в исследованных самодийских популяциях преобладает мутантный гомозиготный генотип УКОЯС1 1173ТТ, частота которого составила 57,1 % у тундровых ненцев и 71,8 % у селькупов. Высокие частоты мутантного генотипа, около 84 -92 %, характерны также для монголоидных популяций [12, 20]. Однако в нашей выборке русских Северной Сибири, у русских, проживающих в Санкт-Петербурге, и в других европеоидных популяциях
доля гомозиготного мутантного генотипа УКОЯС1 1173ТТ существенно снижена и варьирует в пределах 14 - 19 % [11, с. 2020 - 2024; 12, с. 611 - 613; 17, с. 1723 - 1729; 19, с. 487; 22, с. 1013 - 1021].
Нами проведен парный сравнительный анализ частот мутантного аллеля УКОЯС1 1173Т между исследованными и некоторыми другими популяционными выборками (таблица 3).
Таблица 3
Частоты VKORC11173T аллеля и достоверность различий между популяциями
Популяция Общее число аллелей Частота аллеля VKORC1 1173Т, % Селькупы Тундровые ненцы Русские Северной Сибири
Селькупы 660 84,6 == 5 ; Х2=80,2; p=0,00
Тундровые ненцы 620 74,7 х2=2,1; p=0,15 Х2=54,7; p=0,00
Русские Северной Сибири 692 36,9 Х2=80,2; p=0,00 Х2=35,1; p=0,00
Европеоиды (Франция) [16] 878 40,0 Х2=77,3; p=0,00 Х2=50,2; p=0,00 х2=0,6; p=0,43
Монголоиды (Китай, Han Chinese) [11] 780 92,0 х2=1,1; p=0,29 Х2=6,5; p=0,01 ^=105,9; p=0,00
Примечание: жирным шрифтом выделены достоверно различающиеся величины в парном сравнении.
Сравнительный анализ показал, что частота мутантного аллеля УКОЯС 1 1173Т выше у селькупов (84,6 %), чем у тундровых ненцев (74,7 %), но эти различия не являются достоверными (р = 0,15). Тем не менее частоты УКОЯС1 1173Т в выборках тундровых ненцев и селькупов существенно и достоверно превышают таковые в выборках русских Северной Сибири и европеоидов Франции (р = 0,00), но являются более низкими по сравнению с частотами, наблюдаемыми в китайской выборке. Такое распределение УКОЯС 1 1173Т в популяциях показывает, что самодийцы занимают промежуточное положение между европеоидами и монголоидами по частотам встречаемости данного аллеля. Этот факт согласуется с антропологическими и генетическими данными о наличии в генофондах этих коренных этносов как европеоидной, так и монголоидной компонент.
Многими исследователями показано наличие ассоциации полиморфизма УКОЯС1 С1173Т с повышенной чувствительностью пациентов-носителей этого варианта к варфарину и риску развития кровотечений [9, с. 645 - 649; 12, с. 611 - 613; 18, с. 996 -998; 22, с. 1013 - 1021]. Выявление наличия подобной связи в популяциях коренных этносов Сибири (селькупов и тундровых ненцев) возможно будет провести при включении в исследование представителей указанных этносов, нуждающихся в терапии варфарином. На настоящий момент мы имеем выборки только практически здоровых индивидов. Однако исследование выявило, что мутантный вариант УКОЯС1 1173Т широко распространен в исследованных популяциях, а особенно - среди самодийцев, поэтому, предполагая, что такая связь существует и у коренных этносов, - необходимо лечащим врачам в случае назначения терапии антикоагулянтом вар-фарином с осторожностью подбирать дозу лекарства
для индивидов с аллелем УKOЯC1 1173Т. В особо чувствительную группу риска предположительно входят индивиды с гомозиготным генотипом -УКОЯС1 1173ТТ. Вероятно, для лиц с данным генотипом потребуются более низкие дозы препарата, чем для индивидов с генотипами УКОЯС1 1173СТ и СС.
Таким образом, в настоящем исследовании впервые изучен полиморфизм гена УКОЯС1 (С1173Т) в популяциях селькупов, тундровых ненцев и русских Северной Сибири в этническом контексте. Показаны резкие этнические различия между коренными самодийскими популяциями и русскими Сибири по частоте распространенности мутантного варианта УКОЯС1 1173Т. Высказано предположение о существовании связи между наличием варианта УКОЯС 1 1173Т и чувствительностью к антикоагулянту варфарину у коренных самодийских этносов (селькупов и тундровых ненцев). Результаты проведенного исследования могут учитываться врачами при назначении терапии варфарином в целях достижения максимально безопасного и эффективного лечения на индивидуальном уровне среди исследованных лиц, а также в целях дополнительного изучения механизмов развития, лечения и профилактики сердечно-сосудистых заболеваний и других патологий, в которых задействованы витамин К-зависимые белки.
Финансовая поддержка данного исследования осуществлялась Интеграционным проектом № 5.5 (2006 - 2008 гг.), Гос. контрактом № 01-15/36 и экспедиционными грантами СО РАН № 1/8 за 2008 г. и № 1/2 за 2009 г. (для О.Л.П.); Интеграционными проектами СО РАН № 17 (2009-2011 гг.) и № 84 (2009-2011 гг.) (для Ф.М.Л.).
Авторы выражают глубокую благодарность представителям коренных этносов, принявшим участие в данном исследовании. А также Андреен-кову О. В., Бочкареву М. Н., Зубкову Е. А. за выделение образцов ДНК; Бурлаковой Н. А., Чуркиной Т. В., Молетотовой Н. А, Карафет Т. М. и Вепреву С. Г. за помощь в проведении экспедиционных исследований.
Литература
1. Дебец, Г. Ф. Селькупы (антропологический очерк) [Текст] / Г. Ф. Дебец // Труды института этнографии. - М.; Л.: Изд-во АН СССР, 1947.
2. Осипова, Л. П. Генетические маркеры иммуноглобулинов (система вш) для оценки процессов миграции и метисации в популяциях человека в Северной Сибири [Текст] / Л. П. Осипова // Сибирский экологический журнал. - 1994. - Т. 1. - № 2.
3. Панченко, Е. П. Венозные тромбозы в терапевтической клинике. Факторы риска и возможности профилактики [Текст] / Е. П. Панченко // Сердце. - 2002. - Т. 1. - № 4. - Вып. 4.
4. Сироткина, О. В. Аллельные варианты СУР2С9*2 и СУР2С9*3 гена цитохрома СУР2С9 в популяции Санкт-Петербурга и их клиническое значение при антикоагулянтной терапии варфарином
[Текст] / О. В. Сироткина, А. С. Улитина, А. Е. Та-раскина и др. // Российский кардиологический журнал. - 2004. - № 6.
5. Сычев, Д. А. Генетическая основа чувствительности к непрямым антикоагулянтам: фокус на полиморфизм генов VKORC1 и APOE [Текст] / Д. А Сычев, И. В. Игнатьев, В. Г. Кукес // Российский кардиологический журнал. - 2005. - Т. 55.
6. Сычев, Д. А. Фармакогенетика непрямых антикоагулянтов: значение генотипа в повышении эффективности и безопасности терапии [Текст] / Д. А. Сычев, Е. С. Кропачева, И. В. Игнатьев и др. // Кардиология. - 2006. - № 7.
7. Caldwell, M. D. CYP4F2 genetic variant alters required warfarin dose [Text] / M. D. Caldwell, T. Awad, J. A. Johnson // Blood. - 2008. - Vol. 111. -No. 8.
8. Crawford, D. VKORC1 common variation and bone mineral density in the third national health and nutrition examination survey [Text] / D. Crawford, K. Brown-Gentry, M. Rieder // PLoS ONE. - 2010. -Vol. 5. - No. 12.
9. D'Andrea, G. A polymorphism in the VKORC1 gene is associated with an interindividual variability in the dose-anticoagulant effect of warfarin [Text] /
G. D'Andrea, R. L. D'Ambrosio, P. D. Perna et al. // Blood. - 2005. - Vol. 105. - No. 2.
10. D'Andrea, G. Oral anticoagulations: Pharmacogenetics Relationship between genetic and non-genetic factors [Text] / G. D'Andrea, R. L. D'Ambro-sio, M. Margaglione // Blood Reviews. - 2008. -Vol. 22.
11. Lacut, K. Vitamin K epoxide reductase genetic polymorphism is associated with venous thromboembolism: results from the EDITH study [Text] / K. Lacut, C. Larramendy-Gozalo, G. Le Gal et al. // Journal of Thrombosis and Haemostasis. - 2007. - Vol. 5.
12. Larramendy-Gozalo, C. Genetic polymorphism of vitamin K epoxide reductase (VKORC1) 1173 C>T in a Chinese and a Caucasian population [Text] / C. Larramendy-Gozalo, J. Q. Yang, C. L. Verstuyft et al. // Pharmacology and Toxicology. - 2006. - Vol. 98.
13. Lee, M. VKORC1 haplotypes in five East-Asian populations and Indians [Text] / M. Lee, C. Chen,
H. Chuang // Pharmacogenomics. - 2009. - Vol. 10. -No. 10.
14. Limdi, N. A. Warfarin pharmacogenetics: a single VKORC1 polymorphism is predictive of dose across 3 racial groups [Text] / N. A. Limdi, M. Wadelius, Cavallari L. et al. // Blood. - 2010. - Vol. 115. - No. 18.
15. Oldenburg, J. Vitamin K epoxide reductase complex subunit 1 (VKORC1): the key protein of the vitamin K cycle [Text] / J. Oldenburg, C. G. Bevans, C. R. Muller, M. Watzka // Antioxid Redox Signal. -2006. - Vol. 8. - No. 3 - 4.
16. Oldenburg, J. VKORC1: molecular target of coumarins [Text] / J. Oldenburg, M. Watzka, S. Rost, C. R. Muller // Journal of Thrombosis and Haemostasis.
- 2007. - Vol. 5. - No. 1.
17. Osman, A. Main gaplotypes and mutational analysis of vitamin K epoxide reductase (VKORC1) in a
Swedish population: a retrospective analysis of case records [Text] / A. Osman, C. Enstrom, K. Arbring, P. Soderkvist, L. Lindahl // Journal of Thrombosis and Haemostasis. - 2006. - Vol. 4.
18. Reitsma, P. H. C1173T dimorphism in the VKORC1 gene determines coumarin sensitivity and bleeding risk [Text] / P. H. Reitsma, J. F. van der Heij-den, A. P. Groot, F. R. Rosendaal, H. R. Buller // PLOS Medicine. - 2005. - Vol. 2. - No. 10.
19. Sirotkina, O. The vitamin K epoxide reductase gene polymorphisms and pharmacogenetics of warfarin [Text] / O. Sirotkina, A. Ulitina, A. Markov, T. Vavilova // Journal of Thrombosis and Haemostasis.
- 2007. - Vol. 5. - No. 2.
20. Suh, J. W. Vitamin K epoxide reductase complex subunit 1 gene polymorphism is associated with
atherothrombotic complication after drug-eluting stent implantation: 2 - Center prostective cohort study [Text] / J. W. Suh, S. H. Baek, J. S. Park et al. // Am. Heart. J.
- 2009. - Vol. 157. - No. 5.
21. Wadelius, M. Common VKORC1 and GGCX polymorphisms associated with warfarin dose [Text] / M. Wadelius, L. Y. Chen, K. Downes et al. // Pharma-cogenomics Journal. - 2005. - Vol. 5.
22. Wang, Y. Regulatory polymorphism in Vitamin K epoxide reductase complex subunit 1 (VKORC1) affects gene expression and warfarin dose requirement / Y. Wang, H. Chen, K. M. Moramy // Blood. - 2008. -Vol. 112. - No. 4.
