CC BY
36
© Коллектив авторов, 2007 УДК 616-005.4:576.8.095.52 (045)
ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ СИНТЕТАЗЫ ОКСИДА АЗОТА У БОЛЬНЫХ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ СЕРДЦА - ЖИТЕЛЕЙ СТАВРОПОЛЬСКОГО КРАЯ
О.И. Боева, Е.В. Щеглова, И.В. Терентьева, А.В. Ягода Ставропольская государственная медицинская академия
Одним из генов-кандидатов на участие в развитии сердечно-сосудистых заболеваний является ген синтетазы оксида азота (N0) 3-го типа (N0S3) [2, 5]. Эндотелиальная N0-синтетаза является конституциональным ферментом, то есть экспрессируется и в условиях физиологической нормы, и при патологии. Снижение активности этой изоформы фермента приводит к нарастанию эндогенной недостаточности N0 - эндотелиального фактора релаксации, нарушению вазомоторики, усилению процессов тромбообразования и атероге-неза, прежде всего в коронарном русле, что является одним из ключевых звеньев патогенеза ишемической болезни сердца (ИБС) [12]. Ген N0S3 расположен на хромосоме 7q35-36. Лишь для одного из 4-х известных полиморфизмов гена N0S3 идентифицирована гомологичность структур генотипа и кодируемой аминокислотной последовательности: замена гуанина тимидином в 894 позиции ^894Т) 7 экзона гена N0S3 приводит к замещению глутаминовой кислоты аспарагиновой в 298 позиции молекулы фермента (Glu298Asp) [10]. В большинстве сообщений указывается на существование ассоциации между гомо- и/или гетерозиготностью по аллелю Asp и склонностью к развитию и/или более тяжелому течению ИБС [5, 10, 14, 6]. Вместе с тем в ряде других исследований на Европейской популяции не удалось подтвердить связи данного полиморфизма с уровнем активного продукта гена (N0) и роли Glu/ Asp в развитии ИБС [4, 9, 17, 20]. Столь противоречивые данные диктуют необходимость дальнейшего изучения влияния полиморфизма гена N0S3 на эти-опатогенез коронарного атеросклероза и ИБС.
Целью исследования было изучение полиморфизма гена NOS3 в совокупности с концентрациями его активного продукта (оксида азота) в плазме крови больных ИБС и их ассоциации с риском развития и неблагоприятного клинического течения заболевания у жителей Ставропольского края.
Материал и методы. В исследование были включены 86 пациентов (74% мужчин) кардиологического стационара в возрасте от 33 до 70 лет (средний возраст
56,2±9,3 лет), перенёсших острый коронарный синдром (ОКС). Из них у 47 больных ОКС реализовался в острый инфаркт миокарда, у 39 - в прогрессирующую стенокардию. Клинические формы ИБС выделяли на основании классификации ВКНЦ АМН СССР (1983) в соответствии с рекомендациями ВОЗ (1979).
Критериями отбора являлись клинико-биохимические и электрокардиографические признаки стабилизации состояния больных, артериальное давление не более 160/100 мм рт. ст., хроническая недостаточность кровообращения, не превышающая I-II ФК по NYHA, а также отсутствие тяжёлой сопутствующей патологии (сахарный диабет, заболевания печени и почек в фазе обострения, злокачественные новообразования). ОИМ в анамнезе имелся у 54 пациентов, из них 24% переносили его неоднократно. Гиперхолестеринемия установлена у 39 пациентов. Уровень общего холестерина в среднем по группе составил 5,6±1,4 ммоль/л, холестерина липопротеидов высокой плотности 1,04± 0,03 ммоль/л. У 70 больных была избыточная масса тела (индекс Кетле больше 25), в среднем по группе индекс Кетле составил 27,9±4,1 кг/м2. К моменту обследования все больные, не имевшие противопоказаний, получали терапию нитратами.
Контрольную группу составили 36 практически здоровых лиц, сопоставимых с больными по полу и возрасту, с отрицательным результатом тредмил-теста, отсутствием «классических» факторов риска и проявлений атеросклероза в анамнезе. Обследованные были жителями Ставропольского края, не состояли в родстве, характеризовались сходным социально-экономическим и этническим составом. Все пациенты дали письменное согласие на участие в исследовании.
Венозную кровь забирали утром после 12-часового голодания в вакуумные пробирки, содержащие 0,1 часть 0,129М ЭДТА на 10 частей крови. Количественное определение содержания в плазме крови нитрата - стабильного метаболита NO - проводили с помощью наборов «Parameter, Total NO/Nitrite/Nitrate», фирмы «RnD Systems, Inc», США. Результаты выражали в мкмоль/л.
Выделение геномной ДНК из венозной крови обследуемых проводили методом фенол-хлороформной
экстракции. Полиморфизм гена NOS3 Glu298Asp определяли по методике, описанной Д.А. Затейщиковым и соавт. [1]. Амплификацию полиморфных участков генов осуществляли на амплификаторе Master Cycler («Eppendorf», Германия). Для амплификации фрагмента ДНК, содержащего полиморфный маркер Glu298Asp, использовали следующие праймеры: NOS298L (5’-AAGGCAGGAGACAGTGGATGGA-3) и NOS298R (5’-CCCAGTCAATCCCTTTGGTGCTCA-3). В результате ПЦР получаются 3 фрагмента ДНК. Наличие одной полосы ДНК длиной 248 п.н. соответствует генотипу Glu/ Glu, двух полос (158 и 90 п.н.) — гомозиготе Asp/Asp, трех полос (90, 158 и 248 п.н.) — гетерозиготе Glu/Asp.
Статистический анализ материала проведён с использованием методов как параметрической, так и непараметрической статистики при помощи ППП «Statistica 6.0 for Windows». Достоверными считали различия при р<0,05. Правильность распределения частот генотипов определялась соответствием равновесию Hardy-Weinberg (p2+2pq+q2=1). Для оценки связи полиморфизма гена EDNI с возникновением и различными клиническими вариантами ИБС рассчитывали коэффициент относительного риска (ОР) Вульфа. Работа выполнена в соответствии с Хельсинкской декларацией.
Результаты. Как известно, распределение G и Т аллелей в различных этнических группах неравномерно: лица гомозиготные по аллелю Т чаще встречаются среди европейцев (10,73%), чем среди азиатов (0,48%,
р=0,0006), американских индейцев и испанцев [5, 18, 19]. Среди больных ОИМ данные по распространённости аллеля Т очень разнятся: от 2% в японской популяции до 36% среди европейцев [10]. В нашем исследовании распределение вариантов генотипа гена NOS3 у больных оказалось следующим: Glu/Glu - 45%, Glu/Asp
- 48%, Asp/Asp - 7%. Распределение соответствовало равновесию Харди-Вайнберга. Частоты аллелей Glu и Asp составили соответственно 0,69 и 0,31 (р<0,05). В контрольной группе вариант Glu/Glu встречался достоверно реже и составил 17% (р<0,05), в то время как генотип Glu/Asp имели 50% доноров (р<0,05), а Asp/Asp
- 33%. Частоты аллелей Glu и Asp статистически не отличались. Относительный риск ИБС составил 3,07 для носителей аллеля Glu и 3,99 - для лиц, имеющих генотип Glu/Glu, что свидетельствует о положительной связи данного аллеля с ИБС. ОР равный 0,33 для аллеля Asp, 0,92 - для генотипа Glu/Asp и 0,15 - для генотипа Asp/Asp, свидетельствует об устойчивости носителей данного аллеля, в особенности гомозиготного генотипа, к развитию ИБС. В связи с тем, что пациентов, гомозиготных по аллелю Asp, в данной выборке оказалось лишь семеро, в основном анализировали группу больных, гомозиготных по аллелю Glu, и больных, генотип которых содержал аллель Asp.
Как следует из таблицы 1, распределение генотипов, связанных с разновидностями Glu298Asp гена NOS3, не имело достоверной связи с наличием или от-
Таблица 1
Распределение генотипов полиморфного маркера Glu198Asp гена NOS3 у больных ИБС в зависимости от наличия факторов риска и клинических характеристик
Клинико-анамнестические характеристики Генотип в % Уровень значимости различий р*
Glu/Glu (n=39) Glu/Asp, Asp/Asp (n=48)
Пол муж (n=64) жен(n=23) 52 26 48 74 0,05
Возраст начала ИБС до 55 лет (n=28) с 55 лет (n=59) 67 37 33 63 0,02
ИМ в анамнезе нет (n=12) есть (n=74) 58 43 42 57 0,4
Исход ОКС НС (n=39) ОИМ (n=47) 40 49 60 51 0,2
Семейный анамнез ИБС нет (n=15) есть (n=71) 22 51 78 49 0,04
ГБ нет (n=22) есть (=65) 55 55 55 0,7
Общий холестерин < 5,2 (n=39) > 5,2 (n=27) 74 36 55 0,8
Холестерин ЛВП > 0,9 (n=46) < 0,9 (n=18) 44 48 56 52 0,8
* - двусторонний точный критерий Фишера. ГБ - гипертоническая болезнь. ЛВП - липопротеин высокой плотности.
Таблица 2
Содержание NO в плазме крови больных в зависимости от наличия факторов риска и клинико-анамнестических характеристик ИБС
Клинико-анамнестические параметры NO, фмоль/мл Уровень значимости различий p*
Пол муж (n=48) жен (n=18) 58,6±9,57 56,9±6,42 0,39
Возраст < 50 (n=18) > 50 (n=48) 62,7±11,02 55,9±10,46 0,05
Возраст начала ИБС до 55 лет (n=42) с 55 лет (n=24) 56,2±4,23 59,2±8,26 0,3
Курение да (n=38) нет (n=28) 51,4±6,31 64,3±11,02 0,004
ИМ в анамнезе есть (n=53) нет (n=13) 58,1±10,83 54,0±5,07 0,2
Исход ОКС НС (n=29) ОИМ (n=37) 56,02±7,22 59,3±4,26 0,26
ГБ есть (n=49) нет (n=17) 57,3±5,13 58,0±9,68 0,45
Общий холестерин < 5,2 (n=40) > 5,2 (n=26) 58,8±4,14 54,03±9,41 0,14
Холестерин ЛВП < 0,9 (n=47) > 0,9 (n=19) 59,8±3,67 54,3±6,27 0,15
* - по данным U критерия Манна-Уитни.
сутствием большинства проанализированных факторов риска сердечно-сосудистых осложнений и клинических характеристик в обследованной группе больных. Статистически значимые различия частот генотипов выявлены после разделения больных на подгруппы с учётом некоторых немодифицируемых факторов риска. Среди мужчин гомозиготы по аллелю Glu встречались в два раза чаще, чем среди женщин; частота данного аллеля составила 0,73. 74% женщин имели в генотипе аллель Asp, хотя частоты аллелей Glu и Asp существенно не отличались (0,56 и 0,44 соответственно). При выделении подгрупп больных в зависимости от времени манифестации ИБС и наличия ИМ у родственников 1-2-й степени родства не было отмечено различий по частоте аллелей Lys и Asn. В то же время генотип Glu/Glu почти в два раза чаще встречался в случаях дебюта заболевания в возрасте до 55 лет и отягощённого семейного анамнеза. Клинический вариант ИБС, наличие и количество перенесённых ранее ОИМ, факт гипертонической бо-
лезни в качестве сопутствующей патологии, показатели липидтранспортной функции крови и весоростовой индекс не имели достоверной ассоциации с вариантом генотипа.
В целом достоверных различий содержания нитрата в плазме крови пациентов (57,6±1,7) и здоровых лиц (53,8±1,06) не отмечено (р<0,05). Анализ концентрации нитрата в зависимости от варианта генотипа выявил тенденцию к относительному снижению показателя у гомозигот по аллелю Asp. Уровень значимости различий составил 0,25, что соответствовало 75% вероятности их достоверности. Статистически значимое снижение концентрации нитрата в плазме крови отмечено у курящих и пациентов старше 50 лет (табл. 2).
Обсуждение. Результаты мета-анализа, опубликованные в 2004 г., показали, что для лиц гомозиготных по аллелю Asp риск ИБС на 32% выше по сравнению носителями других генотипов [5]. При попытке объяснения механизма влияния мутации в 7 экзоне гена
была обнаружена связь аллеля Asp298 в генотипе NOS3 с нарушением антикоагулянтной функции эндотелия у женщин, снижением эндотелий-зависимой дилатации плечевой артерии у молодых курильщиков, с уменьшением биосинтеза оксида азота [1, 13]. Последнее может быть обусловлено функциональными или структурными дефектами NOS3 (нарушение транскрипции, стабильности матричной РНК, образование каталитически дефектного протеина) или с ускорением деградации фермента [6]. Однако, при сравнении ферментативной активности рекомбинантных молекул, имеющих аспарагиновую или глутаминовую кислоты в 298 позиции, а также степени эндогенной ингибиции обоих вариантов фермента различий получено не было [15].
В ходе Европейского исследования ЕСТ1М среди больных инфарктом миокарда французов выявлен повышенный риск для носителей Glu/Glu генотипа, тогда как в ирландской популяции подобной взаимосвязи выявлено не было [17]. Результаты 8-летнего наблюдения 3052 здоровых мужчин в Англии свидетельствовали об отсутствии ассоциации данного полиморфизма с уровнем N0 и риском ИБС в данной популяции больных [11]. Не удалось подтвердить значения Glu/Asp в развитии ИБС и в ряде других исследований [4, 9, 20].
В то же время есть свидетельства роста концентрации N0 и его метаболитов в плазме крови больных ИБС [3]. Усиление синтеза N0 при ИБС подтверждается исследованиями, в которых выявлено, что миокардиальная ишемия сопровождается повышением экспрессии эндотелиальной и индуцибельной N0-синтетаз [16]. В экспериментах на изолированных клеточных культурах и на животных было получено подтверждение связи увеличения плазменного содержания метаболитов N0 как с активацией продукции, так и угнетением его метаболизма за счет снижения активности супероксиддис-мутазы [8]. S. Ferlito [7] выдвинул гипотезу о компенсаторной и протективной роли увеличения продукции N0 при острой миокардиальной гипоксии. Дефекты синтеза этого медиатора при длительном течении ИБС, вероятно, являются результатом потери способности эндотелия к адекватной регуляции тонуса коронарных сосудов.
Одним из критериев включения больных в наше исследование была клинико-биохимическая стабилизация состояния. Поэтому отсутствие достоверных различий содержания N03 в плазме крови больных ИБС и здоровых может быть объяснено экзогенным поступлением донаторов оксида азота - органических нитратов.
Заключение. Таким образом, в южно-российской популяции выявлена положительная связь-ассоциация между гомозиготностью по аллелю Glu и развитием ИБС. Присутствие в генотипе аллеля Asp является про-тективным вариантом по отношению к ИБС. Выявлена тенденция к увеличению частоты генотипа Glu/Glu преимущественно у мужчин с ранним началом заболевания и отягощённым по сердечно-сосудистым осложнениям семейным анамнезом. Сведения о влиянии на риск развития коронарной болезни генотипов N0S3 могут прояснить вопрос о повышении вероятности возникновения этого заболевания у некоторых больных, несмотря на отсутствие наиболее распространённых модифицируемых факторов риска. В будущем типи-рование генетического маркера N0S3, возможно, позволит более четко определять показания к различным
видам первичной профилактики и терапии ИБС.
Полученные данные свидетельствуют также об отсутствии взаимосвязи между вариантом полиморфного маркера Glu298Asp гена NOS3 и концентрацией его активного продукта в плазме крови у больных, получающих органические нитраты. Тем не менее, табакокурение и возраст старше 50 лет могут способствовать ухудшению ответа больных на терапию нитропрепаратами.
Литература
1. Затейщиков, Д.А. Полиморфизм генов NO-синтетазы и рецептора ангиотензина II 1-го типа и эндотелиальный гемостаз у больных ишемической болезнью сердца / Д.А. Затейщиков, Л.О. Минушкина, О.Ю. Кудряшова // Кардиология. - 2000. - № 11. - С. 28-32.
2. Минушкина, Л.О. Изучение ассоциации эндотелиальной дисфункции и полиморфных маркеров гена NO-синтета-зы у больных ишемической болезнью сердца / Л.О. Минушкина, Д.А. Затейщиков, О.Ю. Кудряшова и др. // Дисфункция эндотелия: экспериментальные и клинические исследования. Труды республиканской научно-технической конференции. - Витебск, 2000. - С. 145-148.
3. Akarasereenont, P. Serum nitric oxide in patients with coronary artery disease / P. Akarasereenont, T. Nuamchit, P. Khunawat // J. Med. Assoc. Thai. - 2001. - № 84. - P. 730-739.
4. Aras, O. Endothelial nitric oxide gene polymorphism (Glu-
298Asp) is not associated with coronary artery disease in Turkish population / O. Aras, N.Q. Hanson, S.M Bakanay, et al. // Thromb. Haemost. - 2002. - № 87. - Р. 347-349.
5. Casas, J.P. Endothelial nitric oxide synthase genotype and
ischemic heart disease: meta-аnalysis of 26 studies involving 23028 subjects / J.P. Casas, G.L. Cavalleri, S.E. Humphries et al. // Circulation. - 2004. - № 109. - P. 1359-1365.
6. Dosenko, V.E. Allelic polymorphism of endothelial NO - synthase gene and its functional manifestations / V.E. Dosenko, V.Y. Zagoriy, N.V Haytovich et al. // Act. Biochim. Pol. -2006. - № 2. - P. 299-302.
7. Ferlito, S. Nitrite plasma levels in acute and chronic coronary
heart disease / S. Ferlito, M. Galina // Minerva. Cardioangiol.
- 1997. - №45. - P. 553-558.
8. Gielen, S. Exercise training in coronary artery disease and
coronary vasomotion / S. Gielen, G. Schuler, R. Hambrecht // Circulation - 2001. - № 103. - P. 1-6.
9. Granath, B. Lack of evidence for association between endothe-
lial nitric oxide synthase gene polymorphisms and coronary artery disease in the Australian Caucasian population / B. Granath, R.R. Taylor, F.M. Van Bockxmeer et al. // J. Cardio-vasc. Risk. - 2001. - № 8. - P. 235-241.
10. Hingorani, A.D. A common variant of the endothelial nitric oxide synthase (Glu2983Asp) is a major risk factor for coronary artery disease in the UK / A.D. Hingorani, C.F. Liang, J. Fatibene et al. // Circulation. - 1999. - № 100. - P. 15151520.
11. Jeerooburkhan, N. Genetic and environmental determinants of plasma nitrogen oxides and risk of ischemic heart disease / N. Jeerooburkhan, L.C. Jones, S. Bujac et al. // Hypertension.
- 2001. - № 38. - P. 1054-1061.
12. Kinay, S. Endothelial function and coronary artery disease / S. Kinay, P. Lippy, P. Ganz // Curr. Opin. Lipidol. - 2001. - № 12.
- P. 383-389.
13. Leeson, C.P.M. Glu298Asp endothelial nitric oxide synthase gene polymorphism interacts with environmental and dietary factors to influence endothelial function. / C.P.M. Leeson,
A.D. Hingorani, M.J. Mullen // Circulation Research. - 2002.
- № 90. - P. 1150-1153.
14. Colombo, M.G. Evidence for association of a common variant
of the endothelial nitric oxide synthase gene (Glu2983Asp polymorphism) to the presence, extent and severity of coronary artery disease / M.G. Colombo, M.G. Andreassi, U. Paradossi et al. // Heart. - 2002. - № 87. - P. 525-528.
15. Mc Donald, D.M. Functional comparison of the endothelial nitric oxide synthase Glu298Asp polymorphic variants in human endothelial cells // D.M. McDonald, N.J. Alp, K.M. Channon // Pharmacogenetics. - 2004. - № 14. - P. 831-839.
16. Penghai. W. Measurement of nitric oxide and peroxynitrite generation in post ischaemic heart / W. Penghai, J. Zeweir // J. Biol. Chem. - 1996. - № 271. - P. 29223-29230.
17. Poirier, O. Polymorphisms of the endothelial nitric oxide synthase gene: no consistent association with myocardial infarc-
tion in the ECTIM study // O. Poirier, C. Mao, C. Mallet et al. // Eur. J. Clin. Invest. - 1999. - № 29. - P. 284-290.
18. Rosas-Vargas, H. Endothelial nitric oxide synthase gene poly-
morphism in the Indian and Mestizo populations of Mexico / H. Rosas-Vargas, A. Flores-Segura, B. Guizada-Claure et al. // Hum. Biol. - 2003. - № 75. - P. 91-96.
19. Serrano, N.C. Endothelial nitric oxide synthase polymorphisms of clinical importance in cardiovascular illnesses: effect of ethnicity on the distribution in the Colombian population (In Spanish) / N.C. Serrano, L.A. Diaz, M.C. Paez et al. // Colombia COLCIENCIAS. - Bogota, 2005. - Technical report.
20. Wang, C.L. Lack of association between the Glu298Asp variant of the endothelial nitric oxide synthase gene and the risk of coronary artery disease among Taiwanese / C.L Wang, L.A Hsu, Y.S Ko et al. // J. Formos. Med. Assoc. - 2001. - № 100.
- P. 736-740.
ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ СИНТЕТАЗЫ ОКСИДА АЗОТА У БОЛЬНЫХ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ СЕРДЦА -ЖИТЕЛЕЙ СТАВРОПОЛЬСКОГО КРАЯ
О.И. БОЕВА, Е.В. ЩЕГЛОВА,
И.В. ТЕРЕНТЬЕВА, А.В. ЯГОДА
Целью исследования было изучение полиморфизма гена эндотелиальной синтетазы оксида азота (NOS3) в совокупности с концентрациями его активного продукта в плазме крови больных ИБС и их ассоциации с риском развития и неблагоприятного клинического течения заболевания у жителей Ставропольского края. Содержание оксида азота и Glu298Asp полиморфизм гена NОS3 изучены у 86 пациентов в возрасте от 33 до 70 лет, в том числе у 47 больных с острым инфарктом миокарда и 39 - с прогрессирующей стенокардией после стабилизации состояния. Обследованные не состояли в родстве, характеризовались сходным социально-экономическим и этническим составом.
В южно-российской популяции выявлена положительная связь-ассоциация между гомозиготностью по аллелю Glu и развитием ИБС. Присутствие в генотипе аллеля Asp является протективным вариантом по отношению к ИБС. Выявлена тенденция к увеличению частоты генотипа Glu/Glu преимущественно у мужчин с ранним началом заболевания и отягощённым по сердечно-сосудистым осложнениям семейным анамнезом. Полученные данные свидетельствуют также об отсутствии взаимосвязи между вариантом полиморфного маркера Glu298Asp гена NOS3 и концентрацией его активного продукта в плазме крови у больных получающих органические нитраты. Табакокурение и возраст старше 50 лет могут способствовать ухудшению ответа больных на терапию нитропрепаратами.
Ключевые слова: полиморфизм гена эндотелиальной синтетазы оксида азота, ишемическая болезнь сердца
ENDOTHELIAL NITRIC OXIDE SYNTHASE GENE POLYMORPHISM IN ISCHEMIC HEART DISIESE PATIENTS OF STAVROPOL TERRITORY
BOYEVA O.I., SHEGLOVA E.V.,
TERENTYEVA I.V., YAGODA A.V.
The purpose was to study endothelial nitric oxide synthase (NOS3) gene polymorphism and its active product concentration in plasma of ischemic heart disease (IHD) patients and their association with the development and adverse clinical evolution of the disease among population of Stavropol Territory. The nitric oxide level and Glu298Asp polymorphism of NOS3 gene were studied in 86 patients aged from 33 till 70 years including 47 patients with an acute myocardial infarction and 39 - with progressing angina after stabilization of clinical status. In the South Russian population positive association was revealed between Glu allele homozygosity and risk of IHD. Presence of Asp allele was identified as a protective genotype regarding IHD. The Glu/Glu genotype prevailed among men with early IHD and complicated cardiovascular family anamnesis. The data obtained testify to the absence of association between the type of Glu298Asp polymorphic marker and plasma concentration of its active product in patients treated with organic nitrates. Smoking and the age elder 50 years can promote lack of the respond to nitrates treatment.
Key words: endothelial nitric oxide synthase, gene polymorphism, ischemic heart disease
