CC BY
34
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 546.17:611-018.74:575.191
© Л.П. Воронина, И.В. Севостьянова, О.С. Полунина, 2011
Л.П. Воронина, И.В. Севостьянова, О.С. Полунина ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ СИНТАЗЫ ОКСИДА АЗОТА
ГОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России
В статье представлены результаты исследования полиморфизма гена эндотелиальной синтазы оксида азота у соматически здоровых (270 человек) и больных бронхиальной астмой (270 пациентов). В группе больных бронхиальной астмой обнаружены гендерные различия частоты встречаемости полиморфного участка гена эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS 4a/4b).
Ключевые слова: бронхиальная астма, полиморфизм гена эндотелиальной синтазы оксида азота.
L.P. Voronina, I.V. Sevostyanova, O.S. Polunina POLIMORPHISM OF GENE IN ENDOTHELIAN SYNTHETASE OXYNITROGEN
The article deals with the results of investigation of gene polymorphism in endothelial synthetase oxynitrogen in somatic healthy persons (270) and patients with bronchial asthma (270). In the group of patients there were found out gender differences of quantity in cases of polymorphic gene parts in endothelial synthetase oxynitrogen (eNOS 4a/4b).
Key words: bronchial asthma, polymorphism of gene in endothelial synthetase oxynitrogen.
Одной из причин инвалидизации и высокой летальности в популяции больных бронхиальной астмой (БА) является вовлечение в патологический процесс сердца и сосудов. В качестве первичного звена поражения сосудистой стенки в настоящее время рассматривается дисфункция эндотелия - одно из системных проявлений БА, развивающееся в ответ на воздействие ряда патогенетических повреждающих факторов заболевания [3, 4].
Нормально функционирующий эндотелий отличает непрерывная базальная выработка оксида азота (NO) с помощью эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) из L-аргинина. Это необходимо для поддержания нормального базального тонуса сосудов. Мутация некоторых аллелей гена eNOS приводит к нарушению его экспрессии, и, в свою очередь, к уменьшению выработки NO. В научных кругах широко обсуждается влияние генетических детерминант на функцию эндотелия сосудов и структурно-функциональное состояние миокарда у пациентов с сердечно-сосудистой патологией. Работы по изучению генетических маркеров дисфункции эндотелия у больных БА практически отсутствуют. Ген eNOS локализован в 7 хромосоме и кодирует белок, состоящий из 1203 аминокислот. Промотор гена eNOS содержит несколько доменов, то есть может регулироваться рядом факторов транскрипции. На сегодня описан полиморфизм гена eNOS в 11 локусах, 8 из которых изучали в качестве возможных факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний. Среди исследованных полиморфных участков одним из наиболее значимых факторов риска признан минисателлитный повтор в интроне 4 (eNOS 4a/4b полиморфизм).
Минисателлит 4a/4b в 4-м интроне гена eNOS насчитывает 2 аллеля, состоящих из 4 или 5 тандемных повторов размером 27 пар нуклеотидов. Нормальный вариант содержит 5 повторов (обозначается как 4b), му-тантный вариант содержит 4 повтора (4a). Влияние варианта 4a связано с нарушением экспрессии гена NOS3, что приводит к уменьшению выработки NO [1].
Цель исследования. Изучить полиморфизм эндотелиальной синтазы оксида азота у соматически здоровых и больных бронхиальной астмой.
Материалы и методы. Исходя из цели исследования, было обследовано 540 человек, из них 270 больных БА и 270 соматически здоровых лиц Астраханского региона в качестве контрольной группы. Динамическое наблюдение за больными БА и их комплексное лабораторное и инструментально - функциональное обследование осуществлялось в условиях терапевтического отделения МУЗ «Городская клиническая больница №4 имени В.И. Ленина».
Возраст обследованных пациентов с БА колебался от 20 до 59 лет (средний возраст 42,14±1,6 года), среди них мужчин было 132 человек (48%), женщин - 138 (52%). Средняя длительность заболевания составила 14,4±1,2 лет. Лица контрольной группы были сопоставимы по полу и возрасту с обследованными больными БА.
Пациенты, выбранные нами для исследования, состояли на диспансерном учете у пульмонолога по поводу БА, диагноз был верифицирован ранее. В группу наблюдения не включались лица с впервые выявленной БА, а также пациенты с наличием в анамнезе или по данным дообследования общесоматической патологии в стадии обострения.
Все пациенты, выбранные нами для исследования, имели диагноз - Бронхиальная астма, смешанная форма (эндо- и экзогенная), среднетяжелое или тяжелое персистирующее течение, фаза обострения.
Генотипирование по полиморфному маркеру гена NOS3 проводили на геномной ДНК, выделенной из цельной крови 270 больных БА. В качестве контроля полиморфизм указанного гена был исследован у 270 соматически здоровых лиц. Полиморфные участки гена NOS3 амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Аллели полиморфного участка eNOS 4b/4a идентифицировали путем ПДРФ анализа, продукты амплификации обрабатывали соответствующими рестриктазами с последующим разделением в 7% акриламид-ном геле. Фрагменты ДНК окрашивали бромистым этидием и визуализировали в УФ - свете на приборе UV-VIS IMAGER-II (США).
Статистическая обработка данных проводилась при помощи статистической программы STATISTICA 7.0, Stat Soft, Inc. Для проверки статистических гипотез при сравнении числовых данных 2 несвязанных групп использовали U-критерий Манна-Уитни. При сравнении качественных данных использовали критерий хи-квадрат (%2) Пирсона. Вычисляли абсолютный (АР), относительный риски (ОР), отношение шансов (ОШ). Абсолютные частоты полиморфных аллелей изучаемого полиморфизма распределялись в четырехпольную таблицу кростабуляции. Значения ОР>1 рассматривали как фактор риска развития данной патологии, а ОР<1 как предохраняющий фактор. Так же риск оценивали, опираясь на значение ОШ: при ОШ <1 - нет риска; 1,1-1,5 - низкий риск; 1,5-2 - средний риск; 2-2,5 - повышенный риск; > 2,5 - высокий риск [2].
Поскольку большинство количественных признаков не подчинялись нормальному распределению, то оценка интенсивности корреляционной связи проводилась с помощью рангового коэффициента корреляции Спирмена. Критический уровень статистической значимости принимали 5% (р=0,05).
Результаты исследования и их обсуждение. Рассмотрев частоту встречаемости полиморфного участка гена эндотелиальной синтазы оксида азота, а именно минисателитного повтора 4Ь/4а в 4 интроне, мы выявили, что у больных БА полиморфный генотип аЬ встречался у 132 чел из 270, против 97 из 270 в группе соматически здоровых лиц. Различия были статистически значимы (значение коэффициента х2=9,29 при уровне значимости р=0,0023).
Абсолютный риск - это относительная частота изучаемого события в определенной группе. Рассчитав значение абсолютного риска в группе больных БА, мы установили, что АР (т.е. относительная частота встречаемости) полиморфного генотипа у больных БА составляет 0,489 или 48,9%, а в группе соматически здоровых лиц 0,359 или 35,9% (табл. 1).
Таблица 1
Риск наличия полиморфного генотипа 4а/4Ь у больных бронхиальной астмой
Статистический показатель Расчетное значение показателя
Абсолютный риск в группе больных БА 0,488 (48,8%)
Абсолютный риск в группе контроля 0,359 (35,9%)
Повышение абсолютного риска в группе больных БА 0,129 (12,9%)
Относительный риск в группе больных БА 1,36
Доверительный интервал для относительного риска [0,107; 0,509]
Повышение относительного риска 0,361
Отношение шансов 1,7
Доверительный интервал для отношения шансов [0,188; 0,880]
Таким образом, у больных БА повышение абсолютного риска (то есть частоты встречаемости полиморфного генотипа а/Ь) составляет 0,129 или 12,9%. Границы доверительного интервала для разности относительных частот составили 0,046; 0,212. То, что значения доверительного интервала отличны от нуля, доказывает, что различия между группой больных БА и группой соматически здоровых лиц являются статистически значимыми.
Вычислив относительный риск частоты встречаемости полиморфных генотипов в группе больных БА и в группе соматически здоровых лиц как отношение абсолютных рисков, установили, что ОР составляет 1,36, то есть больные бронхиальной астмой составляют группу риска по носительству полиморфного варианта аЬ гена €N083. Доверительный интервал (ДИ) для относительного риска составил 0,106; 0,509. Отношение шансов встречаемости полиморфного генотипа в группе больных БА к шансам данного события в группе соматически здоровых лиц составило 1,75 или приблизительно 9:5, то есть риск является средним. Доверительный интервал составил 0,188; 0,880, и так как ДИ отличен от 1, это подтверждает статистическую значимость различий между группами.
Таблица 2
Частота встречаемости полиморфного участка 4а/4Ь гена эндотелиальной синтазы оксида азота у больных бронхиальной астмой в зависимости от пола
Исследуемая группа больных БА Группа с генотипом 4а/4Ь Группа с генотипом 4Ь/4Ь
Женщины п=138 89 * 49
Мужчины п=132 43 * 89
Примечание: * - х2=27,5; р<0,00001.
Изучая распределение генотипов минисателлита 4Ь/4а гена еN0S у больных бронхиальной астмой в зависимости от пола, мы установили, что полиморфный генотип аЬ встречался у 89 из 138 женщин и у 43 из 132 мужчин (табл. 2). Гендерные различия частоты встречаемости полиморфного генотипа были статистически значимы. Значение коэффициента %2 составило 27,5, при уровне статистической значимости р<0,00001. Рассчитав значение абсолютного риска в группе женщин и мужчин, страдающих БА, мы установили, что АР (то есть относительная частота встречаемости) полиморфного генотипа в группе женщин составляет 0,644 или 64,4%, а в группе мужчин 0,326 или 32,6%.
Таким образом, у женщин больных БА повышение абсолютного риска (то есть частоты встречаемости) полиморфного генотипа 4а/4Ь составляет 0,319 или 31,9%. Границы ДИ для разности относительных частот составили 0,205; 0,433. То, что значения Д И отличны от нуля, доказывает, что различия между группой женщин и группой мужчин больных БА являются статистически значимыми. Вычислив относительный риск частоты встречаемости полиморфных генотипов в группе женщин больных БА и в группе мужчин как отношение абсолютных рисков, установили, что ОР составляет 1,98, то есть у женщин больных БА риск носительства полиморфного гена выше, чем у мужчин. ДИ для относительного риска составил 0,406; 0,960. Отношение шансов встречаемости полиморфного генотипа в группе женщин больных БА к шансам данного события в группе мужчин составило 3,76 или приблизительно 19:5, то есть риск является высоким. ДИ составил 0,8157; 1,8327, и так как он отличен от 1, это подтверждает статистическую значимость различий между группами.
Выводы. У больных БА имеет место статистически значимое увеличение частоты встречаемости полиморфного участка гена эндотелиальной синтазы оксида азота: минисателлитного повтора в интроне 4 (eN0S4b/4a) по сравнению с соматически здоровыми лицами. У больных БА имеются гендерные различия частоты встречаемости полиморфного генотипа аЬ: женский пол статистически значимо (р<0,00001) увеличивает частоту встречаемости данного генотипа.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Баранов В.С. Генетический паспорт - основа индивидуальной и предиктивной медицины. - СПб.: Изд-во Н-Л, 2009. - 528 с.
2. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ 8ТАТ18Т1СА. - М.: Медиа Сфера, 2002. - 312 с.
3. Федосеев Г.Б., Трофимов В.И. Бронхиальная астма. - СПб, 2006. - 308 с.
4. Чучалин А.Г. Глобальная стратегия лечения и профилактики бронхиальной астмы (вША). - М.: Атмосфера, 2002. - 160 с.
Воронина Людмила Петровна, кандидат медицинских наук, доцент кафедры внутренних болезней педиатрического факультета ГОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, Россия, 414000, г. Астрахань, ул. Бакинская, 121, тел. (8512) 52-41-43
Севостьянова Ирина Викторовна, кандидат медицинских наук, ассистент кафедры внутренних болезней педиатрического факультета ГОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, Россия, 414000, г. Астрахань, ул. Бакинская, 121, тел. (8512) 52-41-43, е-шаД: [email protected]
Полунина Ольга Сергеевна, доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой внутренних болезней педиатрического факультета ГОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России
