CC BY
22
2015, Т. 17, № 4 2015, Vol. 17, No 4
«Дни Иммунологии в Санкт-Петербурге 2015» Immunology Days in St. Petersburg 2015
эукариотических клеток, а также ингибируют процесс ангиогенеза (I.-S. Park, 2003; R.H. Kim, 2009). Пиогенный стрептококк относится к патогенам, которые вызывают тяжелые инфекционные заболевания у человека, часто приводящие к развитию осложнений (Cunningham M.W, 2000). Роль аргининдеиминазы в патогенезе стрептококковой инфекции остается слабо изученной. Цель данного исследования состояла в выделении из продуктов разрушения пиогенного стрептококка и последующем проведении анализа биохимической и биологической активности АД S. pyogenes, серологической группы А, тип М22, штамм AL168.
Материалы и методы. В экспериментах использовали супернатант разрушенных ультразвуком стрептококковых клеток. Для выделения аргининдеиминазы последовательно использовали ионообменную хроматографию на UNO-sphere Q, гель-фильтрацию на Sephacryl S-200 HR и аффинную хроматографию на аргинин-сефаро-зе. Отбирали фракции, которые обладали способностью снижать концентрацию гуанидиновых групп аргинина и вызывали подавление пролиферации эндотелиальных клеток линии EA.hy926 не менее чем на 50% при разведении фракции в 25 раз. Идентификацию аргининдеимиазы проводили с помощью масс-спектрометрии фрагментов трипсинолиса, полученные пептидные фингерпринты анализировали on line при помощи программы MASCOT (http://www.matrixscience.com). Для определения гуани-диновых групп аргинина использовали модифицированную реакцию Сукагучи. Пролиферативную активность клеток оценивали по их распределению по фазам клеточного цикла, а также с использованием спектрофото-метрического метода (путем окрашивания монослоя красителем кристаллическим фиолетовым). Статистический анализ данных проводили c использованием t-критерия Стьюдента. Результаты. При SDS-электрофорезе в ПААГ во фракциях с антипролиферативной активностью был выявлен белок с M около 40 kDa, который был подвергнут масс-спектрометрическому анализу фрагментов трипсинолиза. Были найдены от 9 до 10 пептидов, соответствующих аргининдеиминазы из различных штаммов S. pyogenes серотипов M1, М2, М3, М4, М5, М6, M12, M18, M28, M49. Выделенный фермент отличался высокой процессивностью (число оборотов 35/c) и оптимумом pH — 6,8 — наиболее близким к рН плазмы крови (7,4). Его удельная активность составляла 46,7 мкмоль Agr/мин/мг белка. Изучение биологической активности аргининдеиминазы показало достоверное дозозависимое снижение пролиферативной активности эндотелиальных клеток до 60% (3 мкг аргининдеиминазы/мл), что соответствовало биологической активности супернатанта разрушенных ультразвуком стрептококков при разведении 1/50. При добавлении в культуральную среду экзогенного L-Arg в нарастающей концентрации способность фермента подавлять пролиферацию клеток частично снижалась, но полного восстановления пролиферативной активности клеток до уровня контроля не происходило, предположительно из-за появления в среде токсичного метаболита L-Arg — аммиака.
Заключение. Анализ биохимической и биологической активности аргинидеиминазы S. pyogenes, M22 показал, что фермент обладает активностью, сравнимой с изученными ферментами других микроорганизмов, и может играть важную роль в патогенезе стрептококковой инфекции.
ПОКАЗАТЕЛИ ИММУННОГО И ОКСИДАНТНОГО СТАТУСА ПРИ ДИАГНОСТИКЕ ОСТРОГО ПАНКРЕАТИТА БИЛИАРНОЙ И НЕБИЛИАРНОЙ ЭТИОЛОГИИ
Суняйкина О.А., Конопля А.И., Локтионов А.Л., Быстрова Н.А., Микаелян П.К., Азарова Ю.Э.
Курский государственный медицинский университет, Курск, Россия
Введение. Использование общепринятых лабораторных методов определения тяжести течения и эффективности лечения многих заболеваний не приносит нужного результата и в основном играет роль скринингового исследования. В этой связи весьма перспективен дифференцированный подход построения диагностического алгоритма в зависимости от этиологии острого панкреатита (ОП), в частности билиарной или небилиарной (ОБП и ОНБП) этиологии.
Цель и задачи — разработка дифференцированных подходов к лабораторной диагностике острого отечного и деструктивного билиарного и небилиарного панкреатита.
Материалы и методы. Под постоянным наблюдением в течение 6 лет в хирургическом отделении ОБУЗ «Курская городская клиническая больница №4» находилось 282 пациента в возрасте от 24 до 70 лет с различными формами ОБП и ОНБП, из которых 120 больных с отечной формой ОП (из них 62 с ОБП не оперированных и оперированных по поводу желчнокаменной болезни и ее осложнений и 58 с ОНБП) и 65 пациентов с деструктивным ОП (25 — с ОБП и 40 — с ОНБП) с прогнозируемым легким течением (менее 6 баллов по шкале APACHEII), в хирургическом лечении которых были исключительно использованы малоинвазивные методики. Уровень в сыворотке крови TNF, IL-1ß, IL-2, IL-6, IL-8, IL-18, G-КСФ, IFNa, IFNy, IL-4, IL-10, РАИЛ, С3, С4-компонентов комплемента, фактора Н и С1-ингибитора, определяли с помощью наборов реагентов методом твердофазного иммуноферментного анализа. Выраженность перекисно-го окисления липидов оценивали по концентрации ацил-гидроперекисей (АГП) и малоновогодиальдегида (МДА). Кроме этого, определяли активность каталазы и суперок-сиддисмутазы (СОД), общую антиокислительную активность (ОАА), содержание стабильных метаболитов оксида азота (CMNO). Активность и интенсивность фагоцитоза нейтрофилов, выделенных из периферической крови, оценивали по фагоцитарному индексу, фагоцитарному числу и индексу активности фагоцитоза. Активность кис-лородзависимых систем нейтрофилов оценивали по реакции восстановления нитросинеготетразолия, спонтанного и стимулированного зимозаном с расчетом функционального резерва нейтрофилов. В полученных по методу E. Beutler эритроцитах определяли уровень АГП, МДА, CMNO, ОАА, активность СОД и каталазы. Кроме этого, оценивали общую сорбционную способность эритроцитов и сорбционную емкость их гликокаликса. Мембраны эритроцитов получали методом G.T Dodge, электрофорез мембранных белков проводили по методу U.K.Laemmli. Белки окрашивали Кумасиголубым R-250 по модифицированной методике G. Fairbanks. Липиды мембран выделяли методом тонкослойной хроматографии.
Основные результаты. При отечной форме ОП установлены максимально измененные до стандартного лечения показатели иммунного статуса у больных с ОНБП
«Дни Иммунологии в Санкт-Петербурге 2015» Медицинская Иммунология
Immunology Days in St. Petersburg 2015 Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
и с ОБП, оперированных по поводу желчнокаменной болезни и ее осложнений. При этом с прогностической целью предложено использование определения в сыворотке крови концентрации TNF, IL-2, IL-4, IL-10, СЗ-компонента комплемента. Критерием деструктивных форм ОП являются изменения оксидантных и антиок-сидантных показателей, содержание белков и липидов в мембранах эритроцитов. Лабораторными дифференциально-диагностическими признаками деструктивных ОБП и ОНБП являются разнонаправленные изменения эритроцитарных сорбционных маркеров эритроцитов, IL-2, ОАА, IL-6, IL-10, СЗ-компонент комплемента, мембранная эритроцитарная представительность холе-стерола, фосфатидилэтаноламина, лизофосфатидил-холина, фосфатидилинозитола, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, глутатион^-трансферазы, эфи-ров холестерола, моно- и диглицеридов.
Заключение. Предложены лабораторные иммунные и метаболические показатели компонентов периферической крови для дифференциально-диагностических критериев острого отечного и деструктивного билиарного и небилиарного панкреатита.
ХРОНИЧЕСКАЯ ИШЕМИЯ ГОЛОВНОГО МОЗГА: ИММУНОМЕТАБОЛИЧЕСКИЕ НАРУШЕНИЯ, КОРРЕКЦИЯ
Шульгинова А.А.
Курский государственный медицинский университет, Курск, Россия
Введение. Одно из центральных мест в изучении це-реброваскулярной патологии занимает проблема лечения больных с хронической ишемией головного мозга (ХИМ). Иммунное воспаление и нарушение липидного обмена приводят к необратимому повреждению фосфо-липидных мембранных комплексов и деструктивному процессу в нейроглии, что является одной из причин клинических проявлений ХИМ. Это диктует необходимость оптимизации лечения таких больных применением наиболее эффективных сочетаний ноотропных и антиокси-дантных препаратов.
Цель и задачи — установление иммунных и метаболических нарушений и выявление эффективности использования фармакотерапии, включающей комбинацию препаратов ноотропного и антиоксидантного действия у пациентов с ХИМ.
Материалы и методы. Анализу подвергнуты результаты лечения 57 пациентов со II стадией ХИМ на фоне гипертонической болезни II стадии, которые были поделены на 3 группы, получавшие комплексную базовую и дополнительную терапию парными сочетаниями ноотропных и антиоксидантных препаратов. Иммунные нарушения оценивали по уровню в плазме крови цитокинов (TNF, IL-1ß, IL-6, IL-8, IL-18, IL-4, IL-10, рецепторного антагониста IL-1 (РАИЛ), IFNy, IL-2, IL-17), компонентов комплемента (С3, С3а, С4, С5, С5а), ее ингибиторов (фактора Н, С1-ингибитора), иммуноглобулинов классов M, G,
A. Метаболические изменения устанавливали по концентрации ацилгидроперекисей АГП), малонового диальде-гида (МДА), церулоплазмина (ЦП), С-реактивного белка (СРБ), неоптерина, стабильных метаболитов оксида азота (СМNO), активности каталазы, супероксиддисмутазы (СОД), общей антиокислительной активности (ОАА) сыворотки крови.
Основные результаты. До начала лечения в плазме крови больных ХИМ установлено значительное повышение концентрации цитокинов: IFNy, IL-2, IL-17, провоспа-лительных (TNF, IL-1ß, IL-6, IL-8, IL-18) с одновременным повышением противовоспалительных IL-4 и IL-10 при неизмененном содержании РАИЛ. Также выявлено повышение уровня С5, С5а, снижение содержания С3, С4-компонентов системы комплемента и всех исследованных классов иммуноглобулинов (IgM, IgG, IgA) при неизмененной концентрации, по сравнению с контрольной группой, фактора Н, С1-ингибитора и С3а компонента, отмечено повышение концентрации СМNO, СРБ, МДА, АГП, значительное снижение активности СОД и катала-зы, ОАА, уровня ЦП, увеличение содержания неоптери-на. Введение в схему лечения церебролизина и мексидола нормализовало уровень С3, С4-компонентов комплемента и IgG, ОАА, МДА, активность каталазы, снижало концентрацию TNF, IL-1ß, IL-6, IL-8, IL-18, IFNy, IL-2, IL-17, С5-компонента комплемента, активность СОД, уровень АГП, неоптерина и СРБ, повышало содержание IgA, IL-10 и РАИЛ. При использовании эмоксипина и пира-цетама отмечена нормализация уровня IL-17, С3, С4-компонентов комплемента и IgG, МДА, СРБ, ОАА и активность СОД, коррекция содержания TNF, IL-1ß, IL-6, IL-8, IL-18, IFNy, IL-2, С5, С5а-компонентов комплемента, IgA и М, АГП, неоптерина и СМга, ЦП, повышение концентрации противовоспалительных цитокинов IL-4, IL-10, РАИЛ, С1-ингибитора и фактора Н, активность каталазы. Аналогичные, но более выраженные корригирующие эффекты на иммунные и метаболические показатели, оказывала комбинация актовегин и церетон.
Заключение. На основании исследования пациентов с ХИМ при поступлении в клинику изменения им-мунометаболических показателей прямо или косвенно свидетельствует о наличии иммунного воспаления, дисфункции эндотелия, «оксидантного стресса», снижении антиоксидантной защиты. Наибольшей эффективностью обладает сочетание актовегин и церетон, наименьшей — применение церебролизина и мексидола, промежуточной — использование эмоксипина и пирацетама. Сравнивая результаты лабораторных изменений на фоне различных схем фармакотерапии с клиническими данными, установлено их совпадение. Своевременно начатое лечение, особенно использование сочетаниия актовегина и церетона, может на долгие годы сохранить профессиональную, социальную и бытовую адаптацию больных ХИМ, улучшить прогноз в отношении продолжительности жизни.
