CC BY
66
Медицинская шшуштогия^ ОрШиНаЛЬНЫв СГЛОЖЬи
О 2001, СПб РО РААКИ
ПОКАЗАТЕЛИ ИММУНИТЕТА ПЛОДА В РАННЕЙ ДИАГНОСТИКЕ ВНУТРИУТРОБНОЙ ИНФЕКЦИИ
Останин А.А., Макагон А.В.*, Леплина О.Ю., Пасман Н.М., Черных Е.Р.
Лаборатория клеточной иммунотерапии, Институт клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск,
* Родильный дом муниципальной клинической больницы №1, г. Новосибирск
Резюме. С целью изучения иммунной системы человека в антенатальном периоде развития и разработки новых подходов к ранней диагностике внутриутробной инфекции исследовали параметры иммунитета плода в группах здоровых (п=8) и инфицированных (n=l 8) женщин во втором триместре беременности. Фетальную кровь получали из пуповинной вены плода с помощью кордоцентеза. Было установлено, что иммунная система плода в отличие от иммунитета взрослого человека характеризуется абсолютной лимфопенией; снижением относительного количества CD3+, CD4+, С08+Т-лимфоцитов, CD16+NK-KneT0K, HLA-DR^’mohouhtob; увеличением СБ20+В-кле-ток и НЬА-ОЯ+лимфоцитов; низкой концентрацией IgG, IgM и IgA в сыворотке; низким уровнем СопА- и анти-СБЗ-стимулированного пролиферативного ответа in vitro. Сравнительная оценка показателей иммунитета плодов в группах здоровых и инфицированных беременных женщин показала, что наличие инфекционной патологии у матери ассоциируется с увеличением концентрации IgM в сыворотке пуповинной крови, 2-кратным возрастанием нейтрофильно-лимфоцитарного индекса (НЛИ) за счет уменьшения количества фетальных лимфоцитов и увеличения полиморфноядерных нейтрофилов, а также с выраженным угнетением СопА- и анти-СБЗ-индуцирован-ной пролиферации МНК. Выявление сочетанных изменений параметров иммунитета плода в виде увеличения IgM, НЛИ и снижения митогенной реактивности соответственно выше и ниже медианных значений, характерных для здоровых плодов, позволяло диагностировать риск развития внутриутробной инфекции со специфичностью 100% и чувствительностью 61%.
Ключевые слова: иммунитет плода, кордоцентез, пуповинная кровь, внутриутробная инфекция.
Ostanin A.A., Makagon А. V., Leplina О. Yu., Pasman N.M., Chernykh H.R.
THE PARAMETERS OF FETAL IMMUNITY IN EARLY DIAGNOSTICS OF PRENATAL INFECTION
Abstract. The parameters of fetal immunity in healthy and infected pregnant women in second gestation trimester were studied with the purpose to evaluate the antenatal features of human immune system and to devise a new approach in early diagnostics of intrauterine infection. Fetal blood was obtained by cordocentesis from umbilical vein. In contrast to adult the immune system of fetus was characterized by increase of lymphocyte count; decrease of relative quantity of CD3+, CD4+, CD8+N-lymphocytes, CD16+NK-cells, HLA-DRh'El’mono-cytes; enlargement of CD20+A-cells and activated HLA-DR+lymphocytes; by low content of serum IgG, IgM and IgA; low level of ConA- and anti-CD3-induced proliferative response. The comparative analysis in healthy (group
1, n=8) and infected (group 2, n=18) pregnant women has shown that the alterations of fetal immunity in second group were manifested by i) significant increase of serum IgM, ii) 2-fold enlargement of neutrophil/lymphocyte ratio (NLR) due to decrease of lymphocyte count and simultaneously increase of neutrophil count, iii) profound inhibition of ConA- and anti-CD3-induced proliferation. The increase of IgM and NLR (above the median level
_____________________________________________ of the normal range) along with the decrease of mito-
Адрес для переписки: gen reactivity (below the median level of the normal
6300091, Новосибирск, ул. Ядринцевская 14, range) allowed to identify the risk of prenatal infection
Институт клинической иммунологии СО РАМН, with specificity 100% and sensitivity 61%. The impor-
0станину A.A. tance of post-natal follow-up and treatment, although
Тел.:3832-28-21-01, факс:3832-22-70-28 not addressed in this article, must be emphasized.
E-mail: [email protected] (Med.Immunol., 2001, vol.3, N 4, pp 515-524)
Введение
Проблема ранней диагностики, профилактики и лечения внутриутробной инфекции (ВУИ) человека остается чрезвычайно важной и, вместе с тем, во многом нерешенной задачей современной неонато-логии. Актуальность исследований в этой области обусловлена высокой частотой развития ВУИ и не снижающимися показателями летальности новорожденных и детей раннего возраста в случае их внутриутробного инфицирования. По данным ВОЗ, только в одном 1995 году в течение первого года жизни от инфекционных заболеваний умерло 8 млн. детей, из которых 5 млн. погибло в течение первой недели постнатального периода [14]. Анализ летальности больных 1000-коечной Детской Морозовской клинической больницы г. Москвы за 1993-1995 гг., проведенный Самсыгиной Г.А. с соавт. свидетельствует о неуклонном росте доли ВУИ в структуре общей смертности. При этом также подчеркивается, что среди умерших больных 83-88% составляют дети раннего (до 1 года) возраста [5].
Среди этиологических факторов развития внутриутробной инфекции чаще других отмечают некоторые внеклеточные (стрептококки группы В) и внутриклеточные бактерии (хламидийная, мико-, уреа- и токсоплазменная инфекция), а также вирусы (цитомегаловирус; вирус герпеса; гепатита С) [14, 15]. До недавнего времени при изучении ВУИ основное внимание исследователей было сконцентрировано на состоянии здоровья беременной женщины и оценке возможного риска трансмиссии инфекционного заболевания от матери ребенку. С разработкой и внедрением в клиническую практику новых, инвазивных методов пренатальной диагностики, таких как амниоцентез и кордоцентез, появилась возможность непосредственного исследования плода и/или его микроокружения на наличие внутриутробной инфекции. Панель существующих в настоящее время лабораторных методов идентификации ВУИ включает: а) выделение патогенных организмов в соответствующих лабораторных условиях; б) выявление патогенной ДНК или РНК методом полимеразной цепной реакции (РС11-диагнос-тика); в) выявление инфекционного возбудителя с использованием методом флюоресценции или гибридизации т г) оценку уровня фетальных ан-тигенспецифических ^М или ^А методом имму-ноферментного анализа [24]. Тем не менее, следует отметить некоторые недостатки вышеперечисленных подходов. В силу своей узкой направленности на выявление одного возбудителя, используемые методы должны применяться в комплексе и охватывать широкий спектр патогенов, чтобы не пропустить наличие какой-либо иной или смешанной формы инфекции. Именно поэтому данные подходы являются достаточно трудоемкими и дорогостоящими. Кроме того, даже на сегодняшний день четко не
определена их чувствительность и специфичность в отношении ранней диагностики внутриутробного инфицирования плода и прогноза развития патологии новорожденных в постнатальном периоде.
Между тем, имеются основания полагать, что дальнейшие перспективы раннего выявления ВУИ лежат в плоскости изучения онтогенеза иммунной системы человека, исследования функциональных и количественных характеристик иммунитета плода в норме и при инфекционном воздействии. Очевидно, что через понимание закономерностей становления и формирования иммунного ответа в процессе внутриутробного развития плода можно прийти к разработке наиболее эффективных методов диагностики и прогноза развития ВУИ.
В настоящее время в качестве иммунологического критерия внутриутробной инфекции принято считать повышенное содержание IgM [6, 19], тогда как предикторная роль других параметров иммунитета плода остается во многом не изученной. Целью представленной работы явилось исследование иммунной системы человека в антенатальном периоде развития, а также сравнительный анализ особенностей иммунитета плода в группах здоровых и инфицированных беременных женщин и разработка на этой основе новых подходов к ранней диагностике внутриутробной инфекции.
Материалы и методы
Исследования были выполнены в группе 26 женщин в возрасте от 16 до 41 лет (средний возраст 27 ± 5 лет) во втором триместре беременности (в среднем 24 ± 0,5 неделя гестационного периода). Обследование женщин проводилось в условиях родильного дома и включало тщательный соматический и акушерско-гинекологический анамнез, ультразвуковое исследование (УЗИ) плода, клинико-лаборатор-ные (общий анализ крови, мочи), биохимические и микробиологические исследования, включая бактериологические посевы, серодиагностику, а также использование метода полимеразной цепной реакции для идентификации ДНК наиболее частых инфекционных агентов: Chlamydia trachomatis, Ureaplasma ureliticum, Mycoplasma hominis, Trichomonas vaginalis, Herpes simplex viruses type I and type II, Cytomegaloviruses. Амплификация проводилась с использованием наборов фирмы “Литех” (г. Москва) и термального циклера фирмы “ДНК-тех-нология” (г. Москва).
Объектом иммунологического исследования являлась кровь плодов, полученная из пуповинной вены с помощью кордоцентеза, который выполнялся двухигольным способом (иглами 18 G и 22 G) под ультразвуковым контролем. Процедура кордоцентеза проводилась с целью пренатального карио-типирования по направлению медико-генетической
консультации. Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли стандартно центрифугированием гепа-ринизированной пуповинной крови в градиенте плотности фиколла-верографина. Клетки в концентрации ОДхЮб/лунку культивировали в 96-луноч-ных круглодонных планшетах для иммунологических исследований в среде RPMI-1640 (Sigma), дополненной 0,3 мг/мл L-глютамина, 5 мМ HEPES-буфера, 100 мкг/мл гентамицина и 10% инактивированной сыворотки доноров IV(AB) группы крови при 37°С в С02-инкубаторе. Для стимуляции клеток использовали конканавалин A (ConA, Sigma) и моноклональные анти-СБЗ-антитела (анти-СОЗ-мАТ, Медбиоспектр, г. Москва) в конечной концентрации 15 и 1 мкг/мл соответственно. Интенсивность пролиферации оценивали через 72 ч по включению 3Н-тимидина (1 |Жю/лунку), добавленного за 18 ч до окончания культивирования.
Методом проточной цитофлюориметрии (FACS, Becton Dickinson), используя соответствующие моноклональные антитела (ТОО “Сорбент”, Москва), определяли содержание различных субпопуляций клеток (CD3+, CD4^ и CD8+Т-лимфоцитов, CD20+ В-лимфоцитов, СВ16+ЫК-клеток), а также относительное количество лимфоцитов и моноцитов, экс-
прессирующих НЬА-БН антигены. Рассчитывали величину иммунорегуляторного СВ4/СБ8 индекса.
Концентрацию иммуноглобулинов класса С, М, А в сыворотке пуповинной крови определяли методом радиальной иммунодиффузии в геле по Ман-чини с использованием соответствующих диагностических наборов (производства НПЦ “Медицинская иммунология”, Москва).
В качестве контроля использовали кровь 40 здоровых доноров крови, представленных лицами обоего пола в возрасте от 21 до 45 лет.
Математическая обработка полученных результатов проводилась методами описательной, параметрической и непараметрической статистики на персональном компьютере с использованием программы ‘^айвйса 5.0”.
Результаты
Сравнительная оценка показателей иммунного статуса здоровых доноров крови и плодов, обследованных на 21 - 26 неделе гестационного периода, показала (табл. 1), что по количественным, функциональным параметрам иммунная система плода на данном этапе онтогенеза существенно отличается от
Табл. 1. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ПОКАЗАТЕЛЕЙ ИММУНИТЕТА ПЛОДОВ И ВЗРОСЛЫХ ДОНОРОВ КРОВИ
Показатель Доноры (п=40) Плоды (п=26)
Лимфоциты (х 109/л) 1,85 ± 0,09 3,23 ± 0,25**
CD3 Т-лимфоциты (%) 68,3 ± 1,0 57,4 ± 1,7**
CD3 Т-лимфоциты (х 10э/л) 1,15 ± 0,06 1,86 ± 0,15**
CD4 Т-лимфоциты (%) 42,3 ± 1,3 35,5 ± 1,8**
CD4 Т-лимфоциты (х 109/л) 0,51 ± 0,06 1,14 ± 0,09**
CD8 Т-лимфоциты (%) 27,0 ± 1,0 20,0 ± 1,0**
CD8 Т-лимфоциты (х 109/л) 0,39 ± 0,06 0,66 ± 0,07**
CD4/CD8 индекс 1,6 ± 0,1 2,0 ± 0,2*
CD20 В-лимфоциты (%) 11,2 ± 0,3 26,0 ± 2,0**
CD20 В-лимфоциты (х )109/л 0,26 ± 0,03 0,80 ± 0,08**
CD16 NK-клетки (%) 16,0 ± 1,3 8,0 ± 1,3**
HLA-DR лимфоциты (%) 13,5 ± 1,8 25,0 ±2,1**
HLA-DRhi9h моноциты (%) 44,0 ± 2,0 25,5 ± 1,8**
IgG (г/л) 9,4 ± 0,6 2,68 ± 0,33**
igM (г/л) 2,2 ± 0,33 0,23 ± 0,04**
|дА (г/л) 1,4 ± 0,11 0,38 ± 0,07**
Спонтанная пролиферация (имп/мин) 2430 ±215 1770 ± 150**
СопА-индуцированная пролиферация 58330 ± 3990 14340 ± 3430**
(имп/мин)
ИВсопА 35,0 ± 3,1 10,4 ± 3,3**
Анти-СОЗ-индуцированная 28350 ± 1800 5890 ± 1490**
пролиферация (имп/мин)
ИВа„ти_соз 18,8 ± 3,2 4,2 ± 0,9**
Примечание: ИВСопД и ИВанти свз - индекс влияния СопА и анти-СйЗ-мАТ - представлял собой отношение уровня пролиферативного ответа в стимулированных культурах к уровню спонтанной пролиферации. * ри <0,05 и ** ри<0,01 - достоверность различий показателей (II - непараметрический критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).
иммунной системы взрослого человека. Из представленных данных видно, что в фетальной крови достоверно снижено процентное количество основных субфракций Т-лимфоцитов (CD3\ CD4+, С08+Т-кле-ток), натуральных киллерных клеток, а также моноцитов с высоким уровнем экспрессии HLA-DR антигенов. В то же время регистрируется более чем 2-кратное увеличение показателей относительного содержания CD20+B-mieTOK и HLA-DR+лимфоцитов, находящихся между собой в очень тесной прямой корреляционной взаимосвязи (гр= 0,9 р<0,001). Следует отметить, что при столь выраженных изменениях относительного состава, абсолютное количество лимфоцитов в крови плодов значительно превышает аналогичный показатель здоровых доноров. Тем не менее, исследование пролиферативной активности МНК в культуре in vitro, а также оценка сывороточного уровня иммуноглобулинов четко свидетельствуют о функциональной незрелости циркулирующих фетальных Т- и В-клеток. Так, в целом по группе обследованных плодов интенсивность пролиферации МНК, стимулированных СопА или анти-СОЗ-мАТ, была в 4 - 4,8 раза ниже пролиферативного ответа клеток взрослых доноров. Пуповинная кровь плодов характеризовалась также низким содержанием иммуноглобулинов класса G, М и А. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о своеобразии иммунной системы ребенка в антенатальном периоде развития, которое проявляется, главным образом, количественными диспропорциями и функциональной незрелостью лимфоидных клеток.
Следует подчеркнуть, что в группе обследованных нами плодов на уровне индивидуальных значений отмечалась существенная вариабельность некоторых иммунологических показателей, а именно, пролиферативной активности клеток и уровня IgM.
Учитывая тот факт, что повышенное содержание в сыворотке пуповинной крови иммуноглобулинов класса М принято считать в качестве диагностического критерия внутриутробной инфекции, логично было предположить, что гетерогенность параметров иммунной системы плодов во многом определяется наличием или отсутствием какой-либо инфекционной патологии у женщины в период вынашивания беременности.
С целью проверки высказанного предположения был проведен ретроспективный сравнительный анализ в группах относительно здоровых (группа 1, п=8) и инфицированных (группа 2, п=18) беременных женщин. При включении женщин во вторую группу учитывался комплекс параметров: наличие инфекции, подтвержденной методами РС11- и/или серодиагностики; степень чистоты мазков [1]; эхографические маркеры пренатальной патологии (многоводие, маловодие, изменения в плаценте, кисты сосудистых сплетений и др.) [3, 4]. Общая характеристика беременных женщин в сформированных группах представлена в табл. 2.
При сравнении показателей гемограммы матерей, а также плодов в исследуемых группах статистически значимые различия обнаруживались только в отношении фетальной крови (табл. 3). Наличие инфекционной патологии у матери было сопряжено с изменением лейкоцитарной формулы плода в сторону уменьшения относительного количества лимфоцитов, и увеличения содержания полиморфноядерных нейтрофилов, что проявлялось 2-крат-ным возрастанием нейтрофильно-лимфоцитарного индекса (НЛИ) в среднем с 0,25 до 0,5 расч.ед. (ри<0,05). Сравнительная оценка показателей иммунитета плодов в оппозитных группах показала (табл. 4), что у инфицированных беременных женщин в отличие от здоровых женщин регистрирует-
Табл. 2. ХАРАКТЕРИСТИКА БЕРЕМЕННЫХ ЖЕНЩИН В ИССЛЕДУЕМЫХ ГРУППАХ
Группа 1 (п=8) Группа 2 (п=18)
Средний возраст (лет) 28 ± 7 (18 - 40) 26 ± 3,8 (16 - 41)
Срок беременности (недель) 24 ± 0,6 (21 - 26) 25 ± 0,7 (22 - 26)
Наличие инфекции
(по данным РСЯ- и/или - 14 (78,0%)
серодиагностики)
Наличие эхографических маркеров
пренатальной патологии 1 (12,5%) 11 (61,0%)
Степень чистоты мазков:
■ 1 степень 4 (50,0%) 1 (5,5%)
■ 2 степень 4 (50,0%) 7 (39,0%)
• 3 степень - 7 (39,0%)
■ 4 степень - 3 (16,5%)
Примечание: возраст беременных и продолжительность гестационного периода представлены в виде М ± Б.Е. (диапазон минимальных и максимальных значений). Остальные показатели в виде абсолютной и относительной частоты встречаемости в исследуемых группах.
ся более выраженное угнетение СопА- и анти-СОЗ-индуцированного пролиферативного ответа фетальных МНК, а также статистически значимое увеличение концентрации в сыворотке крови.
Поскольку достоверные различия в сформированных группах были выявлены только в отношении показателей ИЛИ, уровня ^М, митоген-сти-мулированной пролиферации МНК плодов, на следующем этапе работы была проведена количественная оценка диагностической ценности этих пара-
метров в раннем выявлении внутриутробной инфекции. С этой целью в подгруппе здоровых женщин сначала определили медианные значения выделенных параметров иммунитета плода, которые составили 0,13 расч.ед. для НЛИ; 0,15 г/л для ^М; 11870 имп/мин для СопА- и 8470 имп/мин для анти-СБЗ-стимулированного пролиферативного ответа. Затем было предложено следующее диагностическое правило: увеличение НЛИ или ^М и снижение СопА- или анти-СБЗ-индуцированной
Табл. 3. ПОКАЗАТЕЛИ ГЕМОГРАММЫ БЕРЕМЕННЫХ ЖЕНЩИН И ПЛОДОВ В ИССЛЕДУЕМЫХ ГРУППАХ
Показатель Женщины Плоды
Группа 1 (п=8) Группа 2 (п=18) Группа 1 (п=8) Группа 2 (п=18)
Эритроциты (х 1012/л) 3,8 ± 0,20 3,8 ± 0,14 4,0 ± 0,25 4,1 ± 0,15
Гемоглобин (г/л) 123 ± 6 116 ± 7 131 ± 8 132 ± 5
Лейкоциты (х 109/л) 8,3 ± 0,61 8,2 + 0,56 4,1 ± 0,40 5,1 ± 0,63
П. нейтрофилы (%) 4 ± 0,7 5 ± 0,7 1,3 ± 0,3 2,6 ± 0,3**
С. нейтрофилы (%) 61 ± 2,0 65 ± 2,7 16 ± 3,5 25 ± 3,0*
Лимфоциты (%) 31 + 1,6 26 ± 2,8 78 ± 3,5 66 ± 3,3**
Лимфоциты (х 109/л) 2,5 ± 0,22 2,0 ± 0,17 3,3 + 0,5 3,2 ± 0,3
Моноциты (%) 3,0 ± 0,8 2,5 ± 0,3 3,6 ± 0,5 4,0 ± 0,6
НЛИа| (расч. ед.) - - 0,25 ± 0,07 0,50 ± 0,09*
Примечание: а) НЛИ - нейтрофильно-лимфоцитарный индекс, отражающий соотношение в крови плода относительного количества нейтрофилов (палочкоядерных и сегментоядерных) и лимфоцитов.
* рц <0,05 и ** ри<0,01 - достоверность различий показателей гемограммы плодов в оппозитных группах (и - непараметрический критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).
Табл. 4. ПОКАЗАТЕЛИ ИММУНИТЕТА ПЛОДОВ ЗДОРОВЫХ (ГРУППА 1) И ИНФИЦИРОВАННЫХ (ГРУППА 2) БЕРЕМЕННЫХ ЖЕНЩИН
Показатель Группа 1 (п=8) Группа 2 (п=18)
СйЗ Т-лимфоциты (%) 57 ± 3,0 57 ± 2,0
С04 Т-лимфоциты (%) 37 ± 4,0 35 ± 2,0
С08 Т-лимфоциты (%) 17 ± 1,6 21 + 1,4
С04/С08 индекс 2,2 ± 0,3 1,9 + 0,3
Сй20 В-лимфоциты (%) 22,0 ± 2,5 27,6 ± 2,7
СР16 М-клетки (%) 8,0 ± 1,4 7,9 ± 1,8
Н1А-0Р лимфоциты (%) 24,5 ± 3,1 25,4 ± 2,7
Н1А-0НЫв'1 моноциты (%) 25,5 + 1,2 25,1 + 2,5
ДО (г/л) 2,0 ± 0,4 2,96 ± 0,4
1дМ (г/л) 0,11 ± 0,02 0,29 ± 0,06*
1дА (г/л) 0,33 ± 0,1 0,41 + 0,09
Спонтанная пролиферация (имп/мин) 1730 + 330 1780 + 170
СопА-индуцированная пролиферация 27480 ± 9400 8410 + 1470**
(имп/мин)
ИВСопА 22,6 ± 9,6 4,9 + 0,7**
Анти-СИЗ-индуцированная 10570 ± 3870 4090 + 1220*
пролиферация (имп/мин)
ивантй.соз 9,0 + 2,1 2,4 + 0,5*
Примечание: * ри<0,05 и ** ри<0,01 - достоверность различий показателей (и - непараметрический критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).
Табл. 5. ИНФОРМАТИВНОСТЬ ЛАБОРАТОРНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ДЛЯ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ ВНУТРИУТРОБНОГО ИНФИЦИРОВАНИЯ ПЛОДА
Признак Частота ІМ(Хі/Ак) Частота Р(Хі/Ак) ДК БМ (%) ЭР (%) •ДБИ)
^2 Аг А, Аг
1. Увеличение НЛИ > 0,13 расч.ед. 4 17 50 94,4* 2,8 94,4 50 0,92 17
2. Снижение СопА-индуцированной пролиферации < 10370 имп/мин 3 14 37,5 78* 3,2 78 62,5 1,05 5,8
3. Снижение анти-СОЗ-индуцированной пролиферации <8130 имп/мин 2 12 40 92* 3,6 92 60 1,21 18 3,5
4. Увеличение 1дМ >0,15 г/л 4 14 50 78 1,9 78 50 0,64
Комбинации признаков 1 + 2 1 13 12,5 72** 7,6 72 87,5 2,53 18,2
1 + 4 2 14 25 78* 4,9 78 75 1,64 10,5
2 + 4 1 11 12,5 61* 6,9 61 87,5 2,29 9,4
1+2 + 4 0 11 0 61** 10,2 61 100 3,4 26
Примечание: ДК - диагностический коэффициент; БМ - чувствительность и ЭР - специфичность признака; .ЦЭИ) - информативность по К .Шеннону; ИИ - показатель относительного риска. Достоверность различий частот рассчитана точным методом Фишера и маркирована звездочкой (* и ** при уровне Ртмф < 0,05 и Ртмф < 0,01 соответственно).
Останин А.А. и др. Медицинская иммунология
Табл. 6. ДАННЫЕ КАТАМНЕЗА БЕРЕМЕННЫХ ЖЕНЩИН В ИССЛВДУЕМЫХ ГРУППАХ
Исход беременности Группа 1 (п=8) Группа 2 (п=18)
Вынашивают; под наблюдением 3 6
Срочные роды; здоровые доношенные новорожденные 1 1
Срочные роды; доношенные новорожденные с инфекционной патологией (везикопустулез; пневмонит, ателектазы, ДН II) - 5
Преждевременные роды; недоношенные новорожденные с инфекционной патологией (в/у пневмония) - 4
Прерывание беременности по социальным и медицинским показаниям 4 2
(наличие морфологических признаков инфекционно-воспалительного процесса в плаценте по результатам гистологического исследования последа) (0/4) 0% (2/2) 100%
пролиферации соответственно выше или ниже медианных значений, характерных для здоровых плодов, может являться одним из возможных иммунологических маркеров развития внутриутробной инфекции. Далее проанализировали частоту встречаемости изменений НЛИ, ^М, митогенной реактивности по отдельности и в сочетании друг с другом в группе, в которой у беременных женщин обнаруживалась инфекционная патология (класс А ; п=18) и в группе относительно здоровых женщин (класс А2; п=8). Для оценки прогностической значимости параметров вычислялась информативность каждого признака по соотношению двух вероятностей Р(Х1/А1) и Р(Х1/А,2), где А^ и А, - классы прогноза; XI - номер признака, а Р(Х1/Ак) - вероятность (частость) события. Диагностический коэффициент (ДК) вычислялся по формуле:
ДК = 10 1д х Р(Х!/А,) / Р(Х!/А2)
Информативность по К.Шеннону |(8Ь) по формуле:
М= Р(Х!/А,) / 10 1д Р(Х(/Аг) Г [Р(Х1/А1) - Р(Х!/А2)]
Из данных табл. 5 видно, что по отдельности все анализируемые параметры в отношении ранней диагностики внутриутробной инфекции пло-
да обладают достаточно высокой чувствительностью (БЫ варьирует от 78 до 94,4%) в сочетании с относительно низкой специфичностью (БР варьирует от 50 до 62,5%). Изменение уровня имело наименьший диагностический коэффициент (ДК=1,9), информативность которого составляла 0,64. Далее в порядке увеличения значений ДК следовали показатели НЛИ, СопА- и анти-СБЗ-индуцированной пролиферации, но и в этом случае их информативность варьировала от 0,92 до 1,21. Использование различных комбинаций парных признаков сопровождалось некоторым снижением чувствительности до 61-78%, но одновременно существенным возрастанием их специфичности (до 75-87,5%). Объединение анализируемых параметров в парные комбинации приводило к увеличению их диагностических коэффициентов до 4,9-7,6 и примерно в 1,6-2,5 раза повышало их информативность.
Диагностический комплекс, состоящий из трех признаков (ДК= 10,2), характеризовался максимальной специфичностью и информативностью 0=3,4) без дополнительного снижения чувствительности. Кроме того, показатель относительного риска (1111=26) четко показывает, что обнаружение данного набора иммунологических признаков в крови плода с высокой вероятностью (26:1) свидетельствует о возможном внутриутробном инфицировании.
Из данных катамнеза обследованных женщин видно (табл. 6), что во второй группе из 12 известных на настоящий момент исходов только одна беременность (8,3%) завершилась срочными родами здорового ребенка. В 9 случаях у новорожденных отмечалась ка-кая-либо инфекционная патология, включая внутриутробную пневмонию у 4 недоношенных детей. И, наконец, у двух женщин, у которых по медицинским и социальным показаниям беременность была прервана, при гистологическом исследовании последа в обоих случаях обнаруживались морфологические признаки инфекционно-воспалительного процесса в плаценте. Характерно, что в оппозитной группе относительно здоровых женщин во всех 4 случаях прерывания беременности морфологическая структура последа была нормальной.
Во время написания статьи у 9 из 26 женщин, включенных в исследование, гестационный период еще не завершился. После того, как катамнестичес-кие данные в сформированных группах будут представлены в полном объеме, планируется провести последовательную процедуру Вальда [2] и более точно определить, какие лабораторные тесты, в каких комбинациях и в каких диапазонах значений наиболее эффективны в ранней диагностике внутриутробной инфекции.
Обсуждение
В результате проведенных исследований нами было установлено, что иммунная система ребенка в антенатальном периоде (во втором триместре беременности) отличается от иммунитета взрослого человека, во-первых, количественными диспропорциями и, во-вторых, функциональной незрелостью иммунокомпетентных клеток. Состояние физиологической незрелости иммунной системы плода и/ или новорожденных документировано во многих работах. Так, ЫеиЬеЛ 11.Т. и др. [17], а также О’Агепа С. и др. [11] провели сравнительные фенотипические исследования и показали, что среди лимфоцитов пуповинной крови новорожденных в отличие от периферической крови взрослых доноров преобладают “наивные” С04+СВ45И0'
СВ4511А+СВ29|о"Т-клетки и практически полностью отсутствуют СВ4+СВ451Ю+СВ45КА-С029ык||Т-клетки памяти. Кроме того, свидетельством незрелости фетальных клеток считают более низкий уровень экспрессии на них рецепторов к 1Ь-2 (СБ25) [26, 21], молекул Баэ (С095) и ИаБ-Ь [13], а также снижение относительного содержания общей популяции СОЗ+Т-лимфоцитов в сочетании с повышенным количеством СВ19+В-клеток [И, 22, 25]. При этом все исследователи, так же как и мы, отмечают, что, несмотря на диспропорции в относительном содержании различных субпопуляций лимфоцитов, их абсолютное количество в пуповинной крови зна-
чительно выше, чем у здоровых доноров. Возможным механизмом увеличения количества фетальных клеток, вероятно, является их повышенная устойчивость к апоптозу, обусловленная как снижением экспрессии Раз-рецептора и Баз-лиганда [13], так и более высоким уровнем экспрессии апоптоз-протек-тивных ВСЬ-2 генов [25].
К проявлениям функциональной незрелости лимфоцитов плода относят более низкое содержание в пуповинной крови цитокин-продуцирующих клеток (СБ4+ и СБ8+Т-лимфоцитов, ЫК-клеток, моноцитов) [16, 9], отсутствие в сыворотке пуповинной крови ростовых факторов, необходимых для усиления митогенной реактивности Т-клеток [10], низкий уровень естественной цитотоксической активности лимфоцитов [18, 20], неэффективное межклеточное взаимодействие, обусловленное низкой экспрессией НЬА-011 и СБ40 молекул на антиген-пре-зентирующих клетках и В-лимфоцитах соответственно [8]. Нами также показано снижение относительного содержания НЬА-ВК'момоцитов в крови плода. Кроме того, было установлено, что фетальные клетки в отличие от МНК взрослых доноров характеризуются низким уровнем пролиферативного ответа в культурах, стимулированных СопА и/или анти-СБЗ-мАТ. При этом наиболее глубокое угнетение функциональной активности МНК плодов регистрировалось в группе беременных женщин с признаками инфекционной патологии. Талаев В.Ю. с соавт. описывают аналогичные нарушения анти-СОЗ и СопА-индуцированного пролиферативного ответа МНК пуповинной крови в группе новорожденных, общее состояние которых в 70% случаев оценивалось, как тяжелое или среднетяжелое, что было обусловлено недоношенностью, последствиями внутриутробного инфицирования или гипоксии плода [7].
Показатели иммунитета плодов в сформированных нами группах относительно здоровых и инфицированных женщин достоверно различались между собой не только по интенсивности пролиферативного ответа фетальных клеток, но и по соотношению полиморфноядерных нейтрофилов и лимфоцитов, а также по уровню ^М в пуповинной крови. Повышение концентрации ^М в качестве диагностического маркера внутриутробной инфекции в настоящее время является общепризнанным фактом [6, 19]. Тем не менее проведенными нами исследованиями было установлено, что, несмотря на высокую чувствительность (БЫ 78%), данный показатель имеет низкую специфичность (БР 50%) и информативность, т.е. в случае изолированной оценки уровня ^М точность диагностики ВУИ составляет 50/50.
Активный поиск и разработка новых подходов к выявлению внутриутробной инфекции продолжаются и в настоящее время. Так, Боппег С. и др.
показали, что использование во втором триместре беременности амниоцентеза с целью диагностики цитомегаловирусной инфекции характеризуется 100%-й специфичностью, но очень низкой (на уровне 45%) чувствительностью, которая, тем не менее, может быть повышена до 81-100% если данную диагностическую процедуру проводить в третьем триместре беременности [12]. Отдельными исследованиями было установлено, что, начиная с 21 недели гестационного периода, в крови плодов с документированной бактериемией обнаруживается нейтрофилия, тогда как развитие вирусной инфекции сопряжено с тромбоцитопени-ей и увеличением ЫК-клеток [23].
Среди обследованных нами женщин, как правило, определялись различные комбинации бактериальной и протозойной инфекции, или бактери-ально-вирусные ассоциации. По этой причине, а также из-за малого числа наблюдений в группе инфицированных женщин нам не удалось провести качественного анализа особенностей иммунитета плода в зависимости от природы (вирусной то бактериальной) возбудителя. Тем не менее, сам факт наличия внутриутробной инфекции достаточно четко, на наш взгляд, отражается в изменении параметров иммунитета плода в виде увеличения НЛИ, уровня и снижения СопА и анти-СОЗ-стимулированной пролиферации фетальных клеток. Проведенная оценка специфичности (БР 87,5 - 100%) и чувствительности (БЫ 61 - 72%) комбинаций выделенных нами параметров показала высокую диагностическую ценность предложенного подхода в раннем выявлении внутриутробной инфекции.
Список литературы
1. Василевская Л.Н., Грищенко В.И., Кобзева
Н.В., Юровская В.П. Гинекология.- М.: Медицина, 1985.
2. Гублер Е.В., Лаврушин А.А. Распознавание патологических процессов // Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов,- Л.: Медицина, 1978,- С. 126-172.
3. Кузнецов М.И., Белковская М.Э., Бабаева О.И. Эхографическая картина “инфицированной" плаценты - наиболее вероятные признаки. // Ультразвук. Диагн. Акуш. Гинек. Педиат.- 2000.- Т. 8, N 2.- С. 284 - 288.
4. Медведев М.В., Юдина Е.В. Дифференциальная ультразвуковая диагностика в акушерстве.- М.: Видар, 1997.
5. Самсыгина Г.А., Левшин И.Б., Непокульчиц-кая Н.В., Бородина Т.М. Иммунологическая характеристика внутриутробного хламидиоза и микоплаз-моза. Вопросы терапии и иммунореабилитации. //
Intern. J. Immunorehabilitation.- 1997, N 6,- С. 123-127.
6. Таболин В.А., Володин Н.Н., Дегтярева М.В., Дегтярев Д.Н., Бахтикян К.К. Актуальные вопросы перинатальной иммунологии // Intern. J. Immunorehabilitation.- 1997, N 6.- С. 112-122.
7. Талаев В.Ю., Лебедева И.Е., Талаева Е.Б., Тагиров О.Т. Пролиферативный ответ на форболми-ристата ацетат, конканавалин А и активацию по альтернативному пути мононуклеарных клеток пуповинной крови новорожденных с различным характером их ответа на антитела к CD3. // Иммунология,- 1999,- N 4,- С. 33-35.
8. Bona С., Bot A. Neonatal immunoresponsiveness. // Immunologist.- 1997.- Vol. 5, N 5,- P. 5-9
9. Chalmers I.M.H., Janossy G., Contreras М., Na-varrete C. Intracellular cytokine profile of cord and adult blood lymphocytes. // Blood.- 1998.- Vol. 92, N
1,- p. 11-18.
10. Cohen S.B., Morgan C.L., Perez-Cruz I., Peran-din F., Martinez B., Madrigal J.A. Cord blood serum does not increase lymphocyte responses in comparison to adult serum. // Hum. Immunol.- 2000.- Vol. 61, N
2,- P. 111-114.
11. D’Arena G., Musto P., Cascavilla N., Di Giorgio G., Fussilli S., Zendoli F„ Carotenuto M. Flow cytometric characterization of human umbilical cord blood lymphocytes: immunophenotypic features. // Haema-tologica.- 1998,- Vol. 83, N 3,- P. 197-203.
12. Donner C., Liesnard C., Brancart F., Rodesch F. Accuracy of amniotic fluid testing before 21 weeks’ gestation in prenatal diagnosis of congenital cytomegalovirus infection. // Prenat. Diagn.- 1994,- Vol. 14, N
11,- P. 1055-1059.
13. Drenou B., Choqueux C., Ghalbzouri A., Blancheteau V., Toubert A., Charron D., Mooney N. Characterization of the roles of CD95 and CD95 ligand in cord blood. // Bone Marrow Transplant.- 1998.-Vol. 22, Suppl. 1,- S 44-47.
14. Gerdts V., Babiuk L.A., van Drunen H., Griebel P.J. Fetal immunization by a DNA vaccine delivered into the oral cavity. // Nat. Med.- 2000,- Vol. 6, N S.-Р. 929-932
15. Greenough A. Neonatal infections. // Curr. Opin. Pediatr.- 1996,- Vol. 8, N 1,- P. 6-10.
16. Krampera М., Tavecchia L., Benedetti F., Nad-ali G., Pizzolo G. Intracellular cytokine profile of cord blood T-, and NK- cells and monocytes. Haematologi-ca.- 2000,- Vol. 85, N7,- P. 675-679.
17. Neubert R.T., Delgado I., Webb J.R., Brauer М., Dudenhausen J.W., Helge H., Neubert D. Assessing lymphocyte functions in neonates for revealing abnormal prenatal development of the immune system. // Teratog. Carcinog. Mutagen.- 2000,- Vol. 20, N4. - P. 171-93
18. Nguyen Q.H., Roberts R.L., Ank B.J., Lin S.J., Lau C.K., Stiehm E.R. Enhancement of antibody-dependent cellular cytotoxicity of neonatal cells by in-
terleukin-2 (IL-2) and IL-12. // Clin. Diagn. Lab. Immunol.- 1998,- Vol. 5, N 1,- P. 98-104.
19. Pratlong F., Boulot P., Villena I., Issert E., Tam-by I., Cazenave J., Dedet J.P. Antenatal diagnosis of congenital toxoplasmosis: evaluation of the biological parameters in a cohort of 286 patients. // Br. J. Ob-stet. Gynaecol.- 1996.- Vol. 103, N 6.- P. 552-557.
20. Risdon G., Gaddy J., Stehman F.B., Broxmeyer H.E. Proliferative and cytotoxic responses of human cord blood T lymphocytes following allogeneic stimulation. // Cell. Immunol.- 1994.- Vol. 154, N 1.- P. 14-
24.
21. Saito S., Morii T., Umekage H., Makita K., Nish-ikawa K., Narita N., Ichijo M., Morikawa H., Ishii N., Nakamura M., Sugamura M. Expression of the inter-leukin-2 receptor gamma chain on cord blood mononuclear cells. // Blood.- 1996.- Vol. 87, N 8.- P. 3344-3350.
22. Series I.M., Pichette J., Carrier C., Masson M., Badard P.M., Beaudoin J., Hebert J. Quantitative analysis of T- and B-cell subsets in healthy and sick prema-
ture infants. // Early Hum. Dev.- 1994,- Vol. 26, N 2,-P. 143-154.
23. Thilaganathan B., Carroll S.G., Plachouras N., Makrydimas G., Nicolaides K.H. Fetal immunological and haematological changes in intrauterine infection. // Br. J. Obstet. Gynaecol.- 1994,- Vol. 101, N 5.- P. 418-421.
24. Valente P., Sever J.L. In utero diagnosis of congenital infections by direct fetal sampling. Isr. J. Med. Sci.- 1994,- Vol. 30, N 5-6,- P. 414-420.
25. Villasenor-Bustamante S., Alvarado-De La Barrera C., Richaud-Patin Y., Martinez-Ayala H., Llrente L. Possible role of interleukin-10 in autoantibody production and in the fate of human cord blood CD5+ В lymphocytes. // Scand. J. Immunol.- 1999.- Vol. 49, N
6,- P. 629-632.
26. Zola H., Ridings J., Elliott S., Nobbs S., Weedon H., Wheatland L., Haslam R., Roberton D., Macardle P.J. Interleukin 2 receptor regulation and IL-2 function in the human infant. // Hum. Immunol- 1998.-Vol. 59, N 10,- P. 615-624.
поступила в редакцию 23.02.2001 принята к печати 05.07.2001
