CC BY
24
механизмы
модификационной изменчивости
© С. Е. Москаленко 12,
О. А. Мурина 1, О. Л. Аскинази
Г. А. Журавлева 1
1 Кафедра генетики и биотехнологии Санкт-Петербургского государственного университета;
2 Санкт-Петербургский филиал Института общей генетики
им. Н. И. Вавилова РАН
' Для поиска белков, взаимодействующих с фактором терминации трансляции eRF1, кодируемых у дрожжей Saccharomyces сerevisiae геном SUP45, проводили скрининг библиотеки дрожжевых генов на мультикопийной плазмиде. Этот подход позволил выявить ген ECM23, увеличение экспрессии которого приводило к понижению жизнеспособности нонсенс-мутантов sup45. Сверхэкспрессия этого гена приводила также к антисупрессорному эффекту, не влияя при этом на количество белка eRF1 в клетке. Обсуждаются возможные механизмы влияния гена ECM23 на жизнеспособность нонсенс-мутантов по гену SUP45.
' Ключевые слова: терминация трансляции; дрожжи; нонсенс-супрессия; SUP45; eRF1; eRF3.
Поступила в редакцию 06.11.2012 Принята к публикации 10.01.2012
УДК 575.2:582.282.23
Поиск новых факторов, влияющих на процесс терминации трансляции у дрожжей
SACCHAROMYCES CEREVISIAE
ВВЕДЕНИЕ
Изучение путей регуляции различных клеточных процессов является ключевым направлением современной молекулярной биологии. Для поиска белковых факторов-регуляторов, оказывающих прямое или опосредованное влияние на работу других белков, в настоящее время используются различные подходы.
Терминация трансляции является заключительным этапом биосинтеза белка. Ключевым моментом при терминации трансляции является попадание стоп-кодона мРНК в А-участок рибосомы, в результате чего происходит гидролиз связи между тРНК и полипептидом и освобождение белка. Белковыми компонентами данного процесса являются факторы терминации I и II класса. Факторы терминации трансляции I класса узнают стоп-кодон в А-участке рибосомы. К ним относятся RF1 и RF2 у прокариот, а также eRF1 у эукариот. Факторы терминации II класса, к которым относятся RF3 у прокариот и eRF3 у эукариот, при участии ГТФ активизируют процесс терминации трансляции (см. обзоры: Inge-Vechtomov et al., 2003; Kisselev et al., 2003).
Фактор eRF1 распознает любой из трех стоп-кодонов (UAA, UAG или UGA) при его попадании в А-сайт рибосомы, что приводит к гидролизу связи пептидил-тРНК (Frolova et al., 1994). Фактор eRF3 является ГТФазой и стимулирует активность фактора eRF1, таким образом обеспечивая высвобождение новосинтезированной полипептидной цепи с рибосомы (Zhouravleva et al., 1995; Frolova et al., 1996). Для осуществления процесса терминации трансляции необходимо взаимодействие белков eRF1 и eRF3 (Stansfield et al., 1995; Zhouravleva et al., 1995). У дрожжей Saccharomyces cerevisiae фактор терминации трансляции eRF1 кодируется геном SUP45 (Himmelfarb et al., 1985; Breining et al., 1986), а фактор eRF3 — геном SUP35 (Kushnirov et al., 1988). Несмотря на то, что SUP35 и SUP45 являются жизненно важными для клетки, была показана возможность возникновения нонсенс-мутаций в этих генах (Stansfield et al., 1996; Moskalenko et al., 2003; Chabelskaya et al., 2004). Такие мутации, не являясь летальными, приводят к нарушению терминации трансляции.
За последние несколько лет значительный прогресс произошел в области изучения неканонических функций белков eRF1 и eRF3. Использование биохимических, генетических и молекулярно-биологических методов позволило идентифицировать ряд белков, взаимодействующих с факторами терминации трансляции. Посредством таких взаимодействий возможна координация терминации трансляции с другими клеточными процессами. Высокий уровень сходства аминокислотных последовательностей как eRF1, так и eRF3, в различных систематических группах эукариот предполагает сходство механизмов терминации трансляции. Целью данной работы является поиск новых факторов, влияющих на процесс терминации трансляции у дрожжей S. cerevisiae.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы. В работе использовали штамм дрожжей S. cerevisiae 31B-D1656 (МАТа adel-14 trp—289 ura3—52 leu2—3,112 sup45-105 [pRS316/SUP45]), штамм 1B-D1606 (МАТа adel-14 his7-1 lys9-A21 А trp1-289 ura3-52 leu2-3,112) и его производные, содержащие нонсенс-мутантные аллели sup45-104, sup45-105 и sup45-107, а также штамм 1A-D1628 (MATa ade1-14 his3 lys2 trp1-289 ura3-52 leu2-3, 112 SUP45:: HIS3 [pRS315/SUP45]) (Mos-kalenko et al., 2003). Аллели ade1-14, his7-1, lys9-A21 и trp1-289 несут нонсенс-мутации UGA, UAA, UAA и UAG соответственно. В работе использовали штаммы Escherichia coli DH5a и С600 (Sambrook et al., 1989).
Плазмиды. Использовали центромерную плазмиду pRS316/SUP45, содержащую фрагмент дрожжевой ДНК с полноразмерным аллелем гена SUP45 под контролем собственного промотора (Moskalenko et al., 2003), и мультикопийный вектор рRS425 (Sikorski et al., 1989). В работе был использован коммерческий банк генов дрожжей S. cerevisiae в мультикопийном векторе YEp13 (American Type Culture Collection, ATCC № 37323; http://www.lgcstandards-atcc.org). Банк состоял из набора плазмид, несущих фрагменты геномной ДНК дрожжей (5—20 т. п. н.), полученные при обработке генома рестриктазой Sau3AI и клонированные в вектор YEp13 по сайту рестрикции BamHI. Также была использованы плазмида YGPM15l11 из коммерческого банка дрожжевых генов Yeast Genomic Tiling Collection YSC № 4613, созданного на основе мультикопийного вектора pGP564.
Среды и условия культивирования. В работе использовали стандартные культуральные среды, применяемые при работе с дрожжами: полную среду (YAPD), минимальную среду (MD), синтетическую среду (SC) и селективные среды, не содержащие отдельных компонентов среды (Guthrie and Fink, 1991). Для отбора трансформантов, потерявших плазмиду pRS316 c маркером URA3 использовали среду с 5-фтороротовой кислотой («Sigma», 5-FOA) в концентрации 1 г/л. Бактерии растили на полной среде (LB). Бактериальные трансформанты, содержащие плаз-миду YEp13, несущую участок геномной ДНК, выявляли с использованием минимальной среды (М9) (Maniatis et al., 1982). Устойчивые к ампициллину трансформанты отбирали на средах LB и М9, содержащих ампициллин в концентрации 100 мкг/мл. Штаммы дрожжей выращивали при температуре 26 °С, штаммы бактерий — при 37 °С. Использованы стандартные генетические и молекулярные методы работы с дрожжами-сахаромицетами (Sherman et al., 1986; Rose et al., 1990). Высокоэффективную трансформацию дрожжей и выделение плазмид-ной ДНК из дрожжей проводили согласно ранее описанным методикам (Kaiser et al., 1994; Gietz et al., 1995).
Секвенирование концевых областей вставок в векторе YEp 13 проводили в Центре методов молекулярной систематики животных ЗИН РАН «Таксон» на секве-наторе ABI PRISM с применением набора ABI PRISM BigDye Terminator v3.1 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit.
Содержание белка. Получение клеточных лизатов, электорофоретическое разделение белков в полиакри-ламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия и вестерн-гибридизацию с поликлональными антителами к eRF1 и моноклональными антителами T6074 к тубули-ну («Sigma») проводили согласно методике Moskalenko et al. (2003). Фотопленку сканировали и количественно оценивали интенсивность сигнала в программном пакете TotalLab.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Идентификация гена ECM23, как влияющего на жизнеспособность мутаций sup45
Для поиска факторов, изменяющих жизнеспособность нонсенс-мутантов по гену SUP45, штамм 31B-D1656, несущий нонсенс-мутацию sup45 — l05 в хромосоме и центромерную плазмиду pRS316/SUP45, трансформировали банком генов дрожжей в мультикопийном векторе YEp13. В ходе скрининга банка, детально описанного ранее (Murina et al., 2010), было идентифицировано шесть трансформантов, у которых наблюдалось уменьшение частоты потери плазмиды pRS316/SUP45 по сравнению с контролем.
У части проанализированных трансформантов наблюдался нестабильный характер роста на среде с 5-FOA даже после нескольких проверок и повторной трансформации штамма 31B-D1656 [pRS316/SUP45] плаз-мидами, изолированными из дрожжевого банка генов. В связи с этим для дальнейшей работы были выбраны обладающие стабильным фенотипом трансформанты, содержащие плазмиду 14-Yep13.
В плазмиде 14-Yep13 идентифицирован ген ECM23 и ген RAD1, у которого отсутствует 5'-конце-вая часть открытой рамки считывания. Продуктом гена RAD1 является эндонуклеаза, специфичная к одноце-почечной ДНК, и участвующая в процессах репарации и рекомбинации в клетке (Schiestl et al., 1988). Точная функция продукта гена ECM23 неизвестна. Предполагают, что белок Ecm23p является негативным регулятором псевдогифального роста дрожжей (Canizarez et al., 2002). Также сообщается, что он может быть вовлечен в процесс биосинтеза клеточной стенки (Lussier et al., 1997). Данные о связи гена ECM23 с процессом терминации трансляции отсутствуют. Поэтому было решено изучить влияние сверхэкспрессии этого гена на частоту потери плазмиды pRS316/SUP45 у штамма 31B-D1656 и жизнеспособность нонсенс-мутантов по гену SUP45.
ЭС-ига^еи 5-РОА
pRS315 pRS425
рк3315/ЕСМ23 pRS4251ЕСМ23
Рис. 1. Сверхэкспрессия гена ЕСМ23 снижает жизнеспособность мутанта sup45-105. Штамм 31В^1656 ^ир45-105 [pRS316/SUP45]) трансформировали плазмидами pRS315/ECM23, pRS425/ECM23, pRS315 или pRS425, рост трансформантов оценивали на средах SC-Ura-Leu и на 5^0А. В каждом случае было проанализировано по 12 независимых трансформантов, представлены типичные данные для четырех из них
Оценка влияния сверхэкспрессии гена ECM23 на частоту потери потери плазмиды pRS316/SUP45 у штамма 31B-D1656
Для анализа влияния сверхэкспрессии гена ECM23 на частоту потери плазмиды pRS316/SUP45 у штамма 31B-D1656 была использована мультикопийная плазмида pRS425/ECM23. Для оценки влияния данного гена на характер роста трансформантов на среде с 5-FOA также была использована центромерная плазмида pRS315/ECM23. Штамм 31B-D1656 [pRS316/SUP45] трансформировали плазмидами pRS315/ECM23 или pRS425/ECM23. Затем у трансформантов оценивали частоту потери плазмиды pRS316/SUP45 по характеру роста на среде с 5-FOA без лейцина (рис. 1). Контролем являлся штамм 31B-D1656 [pRS316/SUP45], трансформированный вектором pRS315 или pRS425.
У трансформантов штамма 31B-D1656, содержащих плазмиду pRS425/ECM23, наблюдалось снижение частоты потери плазмиды pRS316/SUP45 по сравнению с контролем. Таким образом, сверхэкспрессия гена ECM23 снижает частоту потери плазмиды pRS316/SUP45, также как и в случае мультикопийной плазмиды 14-Yep13, несущей данный ген. Можно предполагать, что влияние плазмиды 14-Yep13 на характер роста трансформантов на среде с 5-FOA обусловлено присутствием в ней именно гена ECM23.
Также была проведена дополнительная проверка влияния участков геномной дрожжевой ДНК, содержащих исследуемые гены, на частоту потери плазмиды с геном SUP45 дикого типа. Для этого было использован коммерческий банк дрожжевых генов Yeast Genomic Tiling Collection, созданный на основе мультикопийного вектора pGP564 (см. Материалы и методы). Бактериальные
трансформанты, содержащие плазмиды из коммерческого банка дрожжевых генов, были отсеяны из —70 °С на среду LB с добавлением канамицина, а затем из них была выделена плазмидная ДНК, по два трансформанта для каждой из анализируемых плазмид. Далее штамм 3Ш-Ш656 трансформировали выделенными плазмидами. Трансформантов отбирали на среде БС-ига^еи. Затем трансформантов перепечатывали на среду с 5^0А и оценивали влияние плазмид, изолированных из банка, на частоту потери плазмиды pRS316/SUP45. В качестве контроля были использованы трансформанты, несущие вектор pGP564. Были подтверждены данные о том, что сверхэкспрессия гена ЕСМ23 снижает частоту потери плазмиды pRS316/SUP45 (рис. 2)
Анализ влияния дизрупции гена ЕСМ23 на частоту потери плазмиды pRS316/SUP45 на фоне му-тантной аллели зир45-105
Согласно нашему предположению, у трансформантов штамма 3Ш-Ш656, содержащих плазмиду pRS425/'ЕСМ23, для которых наблюдается уменьшение частоты потери плазмиды pRS316/SUP45, происходит снижение жизнеспособности. В связи с этим, вероятно, что дизрупция генов ЕСМ23 будет приводить к повышению частоты потери плазмиды pRS316/SUP45 на фоне мутантной аллели зир45—105 и увеличению жизнеспособности штаммов.
Для проверки данного предположения были использованы штаммы 21А-Ш670, содержащий диз-рупцию генов SUP45 и ЕСМ23, и 17С-Ш670, несущий дизрупцию гена SUP45. Все штаммы содержали плазмиду pRS316/SUP45 для поддержания жизнеспособности. Эти штаммы трансформировали цен-тромерной плазмидой pRS315/sup45—105. Затем у трансформантов оценивали частоту потери плазмиды
SC-U га-Leu
5-FOA
гззжя^шт
Рис. 2. Плазмида, несущая вставку с генами ЖЕ4, МЕТ12, RAD1, ЕСМ23, ULP1, УТС3 («банк»), приводит к пониженной жизнеспособности штамма 31В-В1656 ^ир45-105 [pRS316/SUP45]) по сравнению с контролем («вектор»)
SUP45A
ЕСМ23А SUP45L
количество клеток в 1мл
ф ч* $ «р *
10® 105 -IQ4 юз
Рис. 3. Сверхэкспрессия гена ЕСМ23 приводит к антисупрессорному эффекту. Характер роста штаммов 102-1В^1606 (зир45-102) и 107-1В^1606 (зир45-107), трансформированных плазмидой pRS425/ECM23 на серии селективных сред. В каждом случае было проанализировано по 12 независимых трансформантов, представлены типичные данные для одного из них в виде серии последовательных десятикратных разведений. Все штаммы, используемые в работе, несут нонсенс-мутантные аллели, содержащие стоп-кодоны трех типов (айв1-14, his7-1, lys9-A21 и trp1-289 несут нонсенс-мутации UGA, иАА, иАА и UAG соответственно)
pRS316/SUP45 по характеру роста на среде с 5^0А без лейцина (рис. 3). Отличий в характере роста транс-
формантов выявлено не было. Таким образом, частота потери плазмиды рН3316^иР45 на фоне дизрупции гена ЕСМ23 не изменяется по сравнению с контролем.
Влияние гена ЕСМ23 на фенотипическое проявление мутаций зир45-п
Для анализа влияния гена ЕСМ23, находящегося на плазмиде рНБ425/ЕСМ23, на уровень нонсенс-супрессии использовали штаммы 102—1В-Ш606; 104—1В-Ш606; 105— 1В-Ш606; 107-1В-Ш606, несущие нонсенс мутации зир45. Также фенотипи-ческий анализ был проведен у штамма 1В-Ш606, несущего ген SUP45 дикого типа. Штаммы трансформировали плазмидой рНБ425/ЕСМ23. В качестве контроля использовались трансформанты, несущие вектор рНБ425. Сегрегантов отбирали на селективной среде БС—Ьеи и далее перепечатывали на серию селективных сред для оценки уровня нонсенс-супрессии. Также проводили оценку характера роста трансформантов на средах YAPD, YAPD в 37 °С и СПГ.
При анализе характера роста трансформантов выяснилось, что трансформанты штамма, несущего ген SUP45 дикого типа, и штаммов, несущих нонсенс-мутации зир45—104 и зир45—105 (штаммы 1В^1606, 104-1В^1606 и 105-1В^1606 соответственно), демонстрируют сходный с контролем характер роста на всех средах независимо от присутствия плазми-ды рНБ425/ЕСМ23 (данные не представлены). Трансформанты, несущие нонсенс-мутации зир45 — 102 и зир45 — 107 и плазмиду рНБ425/ЕСМ23 (штаммы 102-1В^1606 и 107-1В^1606 соответственно), характеризуются ослабленным по сравнению с контролем ростом на селективной среде SC-HisLeu (рис. 4). Также трансформанты демонстрируют термочувствительный фенотип и дыхательную некомпетентность, характерные для нонсенс-мутантов по гену SUP45 (данные не представлены). Было отмечено снижение уровня супрессии мутации Ыз7—1 при сверхэкспрессии гена ЕСМ23 у штаммов, несущих нонсенс-мутации зир45 — 102 и зир45 — 107.
Ген ЕСМ23 не влияет на содержание белка eR.F1 у штаммов, несущих ген SUP45 дикого типа или нонсенс-мутантные аллели зир45—104 и зир45—105.
Рис. 4. Дизрупция гена ЕСМ23 не приводит к увеличению жизнеспособности мутантов зир45. Рост штаммов 17С^1670 (SUP45A) и 21А^1670 (ЕСМ23А SUP45A), несущих плазмиду pRS315/зиp45-105, на средах SC-Ura-Leu и с 5^0А без лейцина. В каждом случае было проанализировано по 12 независимых трансформантов, представлены типичные данные для одного из них в виде серии последовательных десятикратных разведений
Рис. 5. Сверхэкспрессия гена ЕСМ23 не влияет на содержание белка eRF1. Анализ количества белка eRF1 у штаммов 1В^1606, 1В^1606-104 и 1В^1606-105, трансформированных плазмидами pRS425 или pRS425/ECM23. Представлены результаты иммуноблотинга с использованием поликлональных антител к белку eRF1. (*) обозначена полоса, образованная в результате связывания антител с неизвестным белком, по которой контролировали количество нанесенных образцов
Согласно нашему предположению штаммы, несущие плазмиду pRS425,/ECM23, характеризуются сниженной жизнеспособностью. Одним из возможных объяснений может быть снижение количество полноразмерного белка eRF1 в клетке.
Для анализа количества белка использовался штамм 1B-D1606, несущий ген SUP45 дикого типа и штаммы 104-1B-D1606 и 105—1B-D1606, несущие нонсенс-мутантные аллели sup45—l04 и sup45—l05. Штаммы трансформировали плазмидой pRS425/ECM23. В качестве контроля использовали трансформантов, несущих плазмиды pRS425 и pRS315. Сегрегантов отбирали на селективной среде SC—Leu. Для оценки количества белка eRF1 был применен стандартный метод имму-ноблотинга с использованием поликлональных антител против белка eRF1 (рис. 5).
В результате проведенного анализа было отмечено снижение количества полноразмерной формы белка eRF1 у нонсенс-мутантов по отношению к штамму с геном SUP45 дикого типа, что уже было показано ранее (Moskalenko et al., 2003) Различий в количестве белка между штаммами, трансформированными плазмидой pRS425/ECM23 и контролем, обнаружено не было.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
В данной работе мы выявили, что сверхэкспрессия гена ECM23 снижает частоту потери плазмиды с геном SUP45 на фоне аллели sup45 — l05.
В настоящее время точная функция Ecm23p, также известного как Srd2p, не определена. Первоначально, ген ECM23 был идентифицирован при поиске генов, участвующих в процессе морфогенеза клеточной стенки дрожжей S. cerevisiae (Lussier et al., 1997). Также было обнаружено, что белок Ecm23p обладает достаточно высоким уровнем сходства с белком Srdlp в С-конце-вой области. Точная функция Srdlp не известна, однако показано, белок Srdlp S. cerevisiae участвует в процес-синге пре-рРНК (Fabian et al., 1990). Мутации в гене SRD1 супрессируют мутацию rrpl — 1, которая приводит к чувствительности к повышенной температуре и нару-
шению в процессе созревания 27S пре-рРНК до 25S и 5.8S рРНК. В то же время мутации в SRD1 не могут супрессировать делецию гена rrpl. Белок Srdlp содержит ДНК-связывающий мотив «цинковые пальцы», что позволяет отнести его к транскрипционным факторам. Однако было показано, что Srdlp не является транскрипционным регулятором гена RRPl (Hess et al., 1994). Авторы предполагают, что Srdlp может регулировать экспрессию генов, участвующих в процессинге рРНК, например генов, кодирующих белки, которые взаимодействует с Rrplp. Присутствие мотива «цинковые пальцы» характерно не только для белков, связывающихся с ДНК. Известно, что фактор инициации трансляции eIF2-ß тоже содержит данный мотив, с помощью которого он, по-вцдимому, взаимодействуют с мРНК (Donahue et al., 1988; Laurino et al., 1999). В связи с этим, существует гипотеза, что Srdlp регулирует экспрессию гена RRPl на уровне трансляции (Hess et al., 1994). Также, вероятно, что Srd1p может связываться с пре-рРНК и стимулировать ее процессинг.
Сходство Ecm23p с Srd1p и другими белками, содержащими мотив «цинковые пальцы», позволяет предположить регуляторную функцию белка Ecm23p в клетке. Показано, что Ecm23p является негативным регулятором псевдогифального роста дрожжей, однако неизвестно каким образом осуществляется данная регуляция (Canizarez et al., 2002). В нашей работе выявлено, что сверхэкспрессия гена ECM23 снижает частоту потери плазмиды pRS316/SUP45 на фоне аллели sup45 — 105, и, по-видимому, жизнеспособность мутантного штамма. Мы предполагаем, что снижение частоты потери плазмиды pRS316/SUP45 связано с увеличением эффективности терминации трансляции в клетке. В частности, наши данные об антисупрессорном эффекте сверхэкспрессии гена ECM23, по крайней мере в отношении стоп-кодона UGA, согласуются с этой гипотезой. Отсутствие антисуп-рессорного эффекта в случае стоп-кодонов UAG и UAA может быть связано с нуклеотидным окружением данных стоп-кодонов в аллелях trp 1—289, his7—1 и lys9-A21, которое, как известно, имеет большое значение в процессе узнавания терминирующего сигнала (см. обзор
МЕХАНИЗМЫ модиФикационной изменчивости
47
Bertram et al., 2001). Возможно, что Ecm23p участвует в регуляции генов, кодирующих компоненты аппарата трансляции, и таким образом влияет на эффективность данного процесса.
Мы не обнаружили влияния дизрупции гена ECM23 на частоту потери плазмиды pRS316/SUP45 на фоне мутантной аллели sup45 — 105. Вероятно, что в клетке присутствуют белки со схожими функциями, которые компенсируют отсутствие продуктов данных генов. Дизрупция гена ECM23, возможно, компенсируется геном SRD1, который кодирует Srdlp, имеющий сходство с белком Ecm23p в С-концевой области (Lussier et al., 1997).
Согласно нашему предположению, трансформанты, несущие плазмиду pRS425/ECM23, характеризуются сниженной жизнеспособностью. В связи с этим мы предполагали, что у таких трансформантов может быть снижено количество полноразмерного белка eRF1 в клетке. Однако нам не удалось обнаружить влияния дополнительной экспрессии гена ECM23 на количество белка eRF 1.
Известно, что мутации в генах SUP45 и SUP35 S. cerevisiae обладают рядом плейотропных эффектов, таких как нарушения сегрегации хромосом в митозе, нарушения клеточного цикла, изменения цитоскелета (см. обзор von der Haar et al., 2007). Показано, что, например, eRF1 может взаимодействовать с белком легкой цепи миозина Mlclp и участвовать в процессе ци-токенеза (Valouev et al., 2004). В связи с этим считают, что у факторов терминации могут быть дополнительные функции в клетке помимо терминации трансляции. В настоящее время связь Ecm23p с фактором терминации eRF1 не изучена. Возможно, что eRF1 способен к взаимодействию с Ecm23p напрямую или опосредованно через другие белки для выполнения дополнительных функций вне процесса терминации трансляции. Однако данный вопрос нуждается в дальнейшем исследовании.
Работа получила финансовую поддержку Российского фонда фундаментальных исследований (10-04-00237-а; 11-04-01905-а), программы Президиума РАН «Проблемы происхождения жизни и становления биосферы», ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009—2013 годы (государственный контракт 16.740.11.0351).
ЛИТЕРАТУРА
1. Bertram G., Innes S., Minella O. et al., 2001. Endless possibilities: translation termination and stop codon recognition // Microbiology. Vol. 147. P. 255—269.
2. Bradley M.E, Bagriantsev S., VishveshwaraN, Lie-bman S. W., 2003. Guanidine reduces stop codon read-through caused by missense mutations in SUP35 or SUP45 // Yeast. Vol. 20. P. 625-632.
3. BreiningP., Piepersberg W., 1986. Yeast omnipotent supressor SUP1 (SUP45): nucleotide sequence of the wildtype and a mutant gene // Nucleic Acids Res. Vol. 14. P. 5187-5197.
4. Canizares J. V., Pallotti C., Sainz-Pardo I. et al.,
2002. The SRD2 gene is involved in Saccharomyces cerevisiae morphogenesis // Arch. Microbiol. Vol. 177. P. 352-357.
5. ChabelskayaS., KiktevD., Inge-VechtomovS., et al., 2004. Nonsense mutations in the essential gene SUP35 of Saccharomyces cerevisiae are non-lethal //Mol. Genet. Genomics. Vol. 272. P 297-307.
6. Donahue T.F, Cigan A.M, PabichE.K., Valavi-cius B. C, 1988. Mutations at a Zn (II) finger motif in the yeast eIF-2 beta gene alter ribosomal start-site selection during the scanning process // Cell. Vol. 54. P 621-632.
7. Fabian G. R, Hess S. M., Hopper A. K, 1990. Srd1, a Saccharomyces cerevisiae suppressor of the temperature-sensitive pre-rRNA processing defect of rrp1 — 1 //Genetics. Vol. 124. P. 497-504.
8. Frolova L., Le Goff X., Rasmussen H. et al., 1994. A highly conserved eukaryotic protein family possessing properties of polypeptide chain release factor // Nature. Vol. 372. P. 701-703.
9. Frolova L., Le Goff X., Zhouravleva G. et al., 1996. Eukaryotic polypeptide chain release factor eRF3 is an eRF1-and ribosome-dependent guanosine triphosphatase // RNA. Vol. 2. P. 334-341.
10. GietzR.D., SchiestlR.H., WillemsA.R., WoodsR.A., 1995. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure // Yeast. Vol. 11. P. 355-360.
11. Guthrie C., Fink G. R., 1991. Guide to yeast genetics and molecular biology. // San Diego: Academic Press.
12. Himmelfarb H. J., Maicas E., Friesen JD, 1985. Isolation of the SUP45 omnipotent suppressor gene of Saccharomyces cerevisiae and characterization of its gene product // Mol. Cell Biol. Vol. 5. P. 816-822.
13. Hess S. M., Stanford D. R., Hopper A. K, 1994. SRD1, a S. cerevisiae gene affecting pre-rRNA processing contains a C2/C2 zinc finger motif // Nucleic Acids Res. Vol. 22. P. 1265-1271.
14. Inge-Vechtomov S., Zhouravleva G., Philippe M.,
2003. Eukaryotic release factors (eRFs) history // Biol. Cell. Vol. 95. P. 195-209.
15. Kaiser C, Michaelis S, Mitchell A., 1994. Methods in yeast genetics. // Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
16. Kikuchi Y., Shimatake H., Kikuchi A., 1988. A yeast gene required for the G1-to-S transition encodes a protein containing an A-kinase target site and GTPase domain // EMBO J. Vol. 7. P. 1175-1182.
17. Kisselev L., EhrenbergM., Frolova L., 2003. Termination of translation: interplay of mRNA, rRNAs and release factors?//EMBO J. Vol. 22. P. 175-182.
48
МЕХАНИЗМЫ модиФикационной изменчивости
18. Kushnirov V. V., TerAvanesyanM.D., TelckovM. V. et al., 1988. Nucleotide sequence of the SUP2 (SUP35) gene of Saccharomyces cerevisiae // Gene. Vol. 66. P 45-54.
19. Laurino J. P., Thompson G.M, Pacheco E, Castil-ho B. A., 1999. The beta Subunit of Eukaryotic Translation Initiation Factor 2 Binds mRNA through the Lysine Repeats and a Region Comprising the C2-C2 Motif // Mol. and Cell. Biol. Vol. 19. P. 173-181.
20. Lussier M, White A.M., Sheraton J. et al., 1997. Large scale identification of genes involved in cell surface biosynthesis and architecture in Saccharomyces cerevisiae // Genetics. Vol. 147. P. 435-450.
21. Maniatis T, Fritsch E. F, Sambrook J., 1982. Molecular cloning a laboratory manual // Cold Spring Harbor, N.Y: Cold Spring Harbor Laboratory.
22. Moskalenko S.E, Chabelskaya S. V., Inge-Vechto-mov S. G. et al., 2003. Viable nonsense mutants for the essential gene SUP45 of Saccharomyces cerevisiae // BMC Mol. Biol. Vol. 4: 2.
23. Murina O. A., Moskalenko S.E., Zhouravleva G. A., 2010. Overexpression of genes encoding tRNA (Tyr) AND tRNA (Gln) improves viability of nonsense mutants in SUP45 gene in yeast Saccharomyces cerevisiae // Mol.Biol. Vol. 44. P. 301-310.
24. Rose M. D., Winston F. M., Hieter P., Sherman F., 1990. Methods in yeast genetics a laboratory course manual // Cold Spring Harbor, N.Y: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
25. Sherman F., Fink G. R., Hicks J. B., 1986. Laboratory course manual for methods in yeast genetics. // N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory.
26. SchiestlR.H., Prakash S., 1988. RAD1, an excision repair gene of Saccharomyces cerevisiae, is also involved in recombination // Mol. Cell Biol. Vol. 8. P. 3619-3626.
27. Stansfield I., JonesK.M., Kushnirov V. V. et al., 1995. The products of the SUP45 (eRF1) and SUP35 genes interact to mediate translation termination in Saccharomyces cerevisiae // EMBO J. Vol. 14. P. 4365-4373.
28. Stansfield I., EurwilaichitrL., Akhmaloka, Tu-ite M. F., 1996. Depletion in the levels of the release
factor eRF1 causes a reduction in the efficiency of translation termination in yeast // Mol. Microbiol. Vol. 20. P. 1135-1143.
29. Valouev ¡.A., Urakov V.N., Kochneva-Pervukho-va N. V., et al., 2004. Translation termination factors function outside of translation: yeast eRF1 interacts with myosin light chain, Mlc1p, to effect cytokinesis // Mol. Microbiol. Vol. 53. P. 687-696.
30. Von der Haar T, Tuite M. F., 2007. Regulated transla-tional bypass of stop codons in yeast // Trends Micro-biol. Vol.15. P. 78-86.
31. Wilson P. G, Culbertson M.R, 1988. SUF12 suppressor protein of yeast. A fusion protein related to the EF-1 family of elongation factors//J. Mol. Biol. Vol. 199. P. 559-573.
32. Zhouravleva G, Frolova L, Le Goff X. et al., 1995. Termination of translation in eukaryotes is governed by two interacting polypeptide chain release factors, eRF1 and eRF3 // EMBO J. Vol. 14. P. 4065-4072.
SEARCHING FOR NEW FACTORS WHICH INFLUENCE TRANSLATION TERMINATION IN YEAST SACCHAROMYCES CEREVISIAE
Moskalenko S. Ye., Murina O.A., Askinazi O. L., Zhuravleva G. A.
Ф SUMMARY: In the yeast Saccharomyces cerevisiae translation termination factor eRF! is encoded by the essential gene SUP45. Here we applied multicopy yeast library to identify a new factor which interacts with the release factor eRF! in yeast Saccharomyces cerevisiae. We identified ECM23 gene whose overexpression decreased viability of sup45 nonsense mutants. We also showed that ECM23 overexpression had antisuppressor effect but the level of eRF! protein was the same as that in the wild-type cells. The mechanisms by which ECM23 influence viability of sup45 mutants are discussed.
Ф KEY WORDS: translation termination; yeast; nonsense suppression; SUP45, eRFl, eRF3.
Ф Информация об авторах
Москаленко Светлана Евгеньевна — к. б. н., с. н. с. Санкт-Петербургский филиал Института общей генетики им. Н. И. Вавилова. Доцент кафедры генетики и биотехнологии. СПбГУ. 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9. E-mail: [email protected].
Мурина Ольга Анатольевна — студент. Кафедра генетики и биотехнологии. СПбГУ. 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9. E-mail: [email protected]. Аскинази Ольга Леонидовна — студент. Кафедра генетики и биотехнологии. СПбГУ. 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9.
Журавлева Галина Анатольевна — д. б. н. Профессор кафедры генетики и биотехнологии. СПбГУ. 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9. E-mail: [email protected].
Moskalenko Svetlana Yevgenyevna — Ph. D., Senior Researcher, St. Petersburg Branch Vavilov Institute of General Genetics (RAS), Assoc. Prof. Dept. of Genetics and Biotechnology. St.-Petersburg State University. 199034, St.-Petersburg, Universitetskaya nab, 7/9. Russia. E-mail: [email protected].
Murina Olga Anatolyevna — student. Dept. of Genetics and Biotechnology. St.-Petersurg State University. 199034, St.-Petersburg, Universitetskaya nab, 7/9. Russia. E-mail: [email protected]. Askinazi Olga Leonidovna — student. Dept. of Genetics and Biotechnology. St.-Petersurg State University. 199034, St.-Petersburg, Universitetskaya nab, 7/9. Russia.
Zhuravleva Galina Anatolyevna — Ph.D., Professor of the Dept. of Genetics and Biotechnology. St.-Petersurg State University. 199034, St.-Peters-burg, Universitetskaya nab, 7/9. Russia. E-mail: [email protected].
