CC BY
132
ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
IVh
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
УДК 576.8
ПОДХОДЫ К КОНСТРУИРОВАНИЮ ПОЛИМЕРНЫХ РАНЕВЫХ ПОКРЫТИЙ С БАКТЕРИОФАГАМИ
Н.А. Ковязина1, П.С. Лукин2, Е.В. Функнер1, М.Ф. Заривчацкий2,
А.М. Николаева1, М.Г. Ефимова1, А.В. Казьянин1,
1ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия»,
2ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия»
Ковязина Наталья Анатольевна - e-mail: [email protected]
Статья посвящена конструированию дифференцированных раневых покрытий с бактериофагами,
которые обуславливают комплексное воздействие на инфицированную поверхность. Определена микробная флора гнойно-воспалительных ран. Изучено влияние природы пленкообразователей и технологических факторов сушки на стабильность бактериофагов и биофармацевтические свойства раневых покрытий. В результате исследований выявлено, что раневые покрытия
рационально получать путем иммобилизации стафилококкового и синегнойного бактериофагов на композиционной полимерной основе с последующей лиофилизацией.
Ключевые слова: бактериофаг, гнойно-воспалительные заболевания, литическая активность, микробная флора, раневые покрытия.
The article is devoted to differentiated wound construction of coverings with bacteriophages, which cause a complex impact on infected surfaces. We studied the influence of the biofilmformers nature and drying technological factors on the stability of bacteriophages and biopharmaceutical properties of wound coverings. As a result of research it was found out that the wound coating rationally received by immobilization of staphylococci and blue pus bacteriophages on compositional polymeric basis with the subsequent lyophilization.
Key words: bacteriophage, purulent-inflammatory diseases, lytic activity, microbial flora, wound coverings.
Введение
В настоящее время пациенты с гнойно-воспалительными
заболеваниями мягких тканей составляют 40-45% больных хирургического профиля. Гнойные процессы - одно из наиболее часто встречающихся послеоперационных осложнений [1, 2]. Эти данные свидетельствуют об актуальности и нерешенности проблемы лечения длительно незаживающих ран, приобретающей все большую социальную и экономическую значимость.
Одним из основных методов лечения гнойновоспалительных заболеваний является использование раневых покрытий. Современная хирургия обосновывает целесообразность полимерных покрытий с их комплексным и дифференцированным воздействием на различных стадиях раневого процесса [2, 3]. В первой фазе эффективна вульне-росорбционная (сорбция экссудата и эндотоксинов с поверхности гнойных ран) и антибактериальная терапия. Во второй фазе рационально использование биодеградируемых покрытий, стимулирующих регенеративные процессы в ране и обладающих противомикробным действием. В третьей фазе необходимо способствовать эпителизации и косметическому заживлению ран. Высокий показатель гнойновоспалительных заболеваний и послеоперационных осложнений связан с генерализацией инфекции и лекарственной полирезистентностью штаммов микроорганизмов, достигающей 39,9-96,9% [4, 5]. В связи с этим альтернативным методом лечения является фаготерапия [6]. Бактериофаги -это вирусы, паразитирующие на бактериальных клетках. Антибактериальный эффект, оказываемый фагопрепарата-ми, обусловлен специфическим лизисом патогенных бактерий в очаге воспаления [5]. Бактериофаги постоянно адаптируют к современным возбудителям за счет ежегодного
обновления фаговых рас и введения в производственную коллекцию свежевыделенных бактериальных штаммов [7].
Цель исследования: конструирование дифференцированной высокоактивной полимерной лекарственной формы с бактериофагом для лечения гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей.
Материалы и методы
Изучение микробной флоры проводили на базе МУЗ «Городская поликлиника № 2» г. Пермь. Группа обследованных состояла из 70 пациентов (44 мужчины и 26 женщин) в возрасте от 21 года до 92 лет с ранами (травмами), абцесса-ми и послеоперационными осложнениями. Влияние природы полимеров и вида высушивания раневых композиций на литическую активность бактериофагов оценивали по методу Аппельмана [8] в разведениях 102^104. Сопоставляя суммарное количество баллов в опытной и контрольной пробах вычисляли процент сохранения активности бактериофагов. Контролем служил исходный препарат [10]. Биологическую доступность (высвобождение) бактериофагов из полимерных матриц определяли на газонах культур тест-штаммов (S. aureus, S. epidermidis, Ps. aeruginosa) с последующим наложением образцов раневых покрытий площадью 1 см2. После выдерживания в течение суток при температуре 37±1°С визуально оценивали результаты по наличию или отсутствию зон лизиса.
Результаты и их обсуждение
Первоначальным этапом при конструировании рациональных раневых покрытий с бактериофагами явилось изучение микробной флоры гнойно-воспалительных ран (рис. 1). Выявлено, что основными возбудителями инфекции в ране являются разновидности рода Staphylococcus spp. -67,61% (S. aureus - 32,39%, S. haemolyticus - 18,31%,
S. epidermidis - 16,90%, S. saprophyticus 1,41%) и Pseudomonas aeruginosa - 19,72%. Единичные случаи представлены Streptococcus spp. - 3,22% (St. haemolyticus - 1,41%, St. faecies - 1,41%, Ent. durans - 1,41%) и E. coli - 1,41%. В 7% случаях возбудители инфекций не обнаружены. В 22,86% случаях определилось две разновидности микроорганизмов и в 1,43% - три. В связи с этим рационально разрабатывать полимерные раневые покрытия на основе комплексных поливалентных препаратов бактериофагов, содержащих стафилококковый и синегнойный фаг.
Эффективность лечения ран основана на комплексном воздействии субстанции (бактериофаг) и матрицы-носителя. Бактериофаги отличаются высокой лабильностью по отношению к вспомогательным веществам и технологическим факторам производства. В связи с этим при конструировании полимерных композиций необходим комплексный подход.
Важным этапом является подбор матрицы-носителя, которая выполняет функции иммобилизации фага и терапевтического компонента. В качестве матрицы производители используют материалы на основе природных и синтетических полимеров различной химической природы и структуры, что существенно отличает механизм биологического действия различных раневых покрытий на этапе регенерации. Особое внимание уделяется изучению влияния пленко-образователей на стабильность поливалентных бактериофагов. Для подбора в композиции составов полимерных покрытий были использованы 9 высокомолекулярных веществ различного происхождения: из природных биоде-градируемых - желатин, коллаген коротковолокнистый, натрия альгинат, пектин цитрусовый и пектин яблочный; из синтетических - биодеструктируемый полимер полиэфира-
мида (БДП), метилцеллюлоза, натрий карбоксиметилцел-люлоза, поливиниловый спирт (ПВС). На рисунке 2 представлено влияние природы полимерной матрицы на стабильность бактериофагов в виде 3% геля. Полное сохранение литической активности установлено для природных полимеров - желатина и коллагена, для синтетических - у метилцеллюлозы. Наименьшая - у натрия альгината, пектина цитрусового и яблочного, при этом у гелей на основе пектина наблюдали полную инактивацию стафилококкового фага, что возможно связано с его сорбцией. Стафилококковый фаг наиболее лабилен к воздействию полимеров натрия альгината, натрий карбоксиметилцеллюлозы, пектина яблочного, пектина цитрусового и поливинилового спирта, чем синегнойный бактериофаг.
Сушка является важным технологическим фактором, влияющим на стабильность бактериофагов [9] и технологические свойства лекарственной формы. С целью получения раневых покрытий апробировано воздушное, вакуумное и сублимационное высушивание фармацевтических композиций с бактериофагами. Полимерная композиция, высушенная на воздухе при температуре 28±2°С по органолептическим свойствам соответствовала лекарственным пленкам, что не физиологично для дифференцированных раневых покрытий (рис. 3А). Литическая активность данных композиций вне зависимости от вида полимера составляла менее 10-3. Вакуумное высушивание показало сохранение активности бактериофагов на уровне 10-3 и выше, однако пленки вздувались и расслаивались (рис. 3Б), что говорит о нетех-нологичности данного высушивания раневых покрытий. Сублимационное высушивание полимерной фармацевтической композиции с бактериофагом придает оптимальные полифункциональные свойства раневого покрытия - типа
□Staphylococcus spp. .Pseudomonas aeruginosa □Streptococcus spp.
■E. coli
□He обнаружено
РИС. 1.
Микробный пейзаж инфицированной раневой поверхности (%).
Коллаген Натрия Пектин
альгинат ябл
Желатин Метил- Натрий Пектин
целлюлоза КМЦ цитр
□ Синегнойный ■ Стафилококковый
РИС. 2.
Влияние природы полимерной матрицы на стабильность бактериофагов в гелях.
А Б В
РИС. 3. Полимерные раневые покрытия с бактериофагом (А - воздушное высушивание; Б - вакуумное высушивание; В - сублимационное высушивание).
ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
альгинат ябл
Желатин Метил- Натрий Пектин
целлюлоза КМЦ цитр
□ Синегнойный ■ Стафилококковый
РИС. 4.
Влияние сублимационного высушивания полимерной матрицы на стабильность бактериофагов в раневых покрытиях.
лекарственной губки (рис. 3В). На рисунке 4 приведена стабильность бактерифагов в полимерной матрице после сублимационного высушивания. Выявлено, что биодеструк-тируемый полимер полиэфир амида, желатин и коллаген при сублимационном высушивании композиций обеспечивают сохранение специфической активности бактериофагов (титр 10-3 и выше), при этом пектины вызывают их полную инактивацию. Лиофильное высушивание гелей инактивирует бактериофаги в полимерных матричных системах на основе метилцеллюлозы, натрий карбоксиметилцеллюлозы и поливиниловом спирте (рис. 2, 4). Особенностью лио-фильного высушивания является структурирование лекарственной формы. Раневые фармацевтические композиции на основе биодеструктируемого полимера полиэфирамида, коллагена, натрия альгината и поливинилового спирта обладали хрупкостью (расслаивались, порошковались), что не соответствует технологическим свойствам раневых покрытий. В связи с этим, рационально получать раневые покрытия на поликомпозиционной матрице с предварительной стабилизацией бактериофагов.
Для придания пластичности в состав композиции добавляли глицерин в количестве до 0-50%. При концентрации глицерина более 20% лекарственные губки имели повышенную липкость, расслоения или пористую, непрочную структуру. Композиции, содержащие 0-10% пластификатора, в зависимости от природы матрицы, соответствовали по физиологическим свойствам эластичности раневых покрытий.
Природа матрицы-носителя, пластификатора и их количество влияют на биологическую доступность иммобилизованных бактериофагов из раневых покрытий. В значитель-
ной степени зону угнетения роста штаммов наблюдали у поливинилового спирта и коллагена. Лекарственные губки, полученные на полимерной основе с концентрацией 0,5-5%, обладали наибольшей биодоступностью бактериофагов, чем губки на 10% и более. Покрытия на биодегради-руемой основе растворялись в питательной среде, образуя отчетливую зону лизиса.
Заключение
Таким образом, с целью получения раневых покрытий с бактериофагов, обладающих дифференцированным терапевтическим эффектом в лечении гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей, рационально иммобилизовы-вать стафилококковый и синегнойный фаги на композиционной полимерной биодеградируемой основе с последующей лиофилизацией.
ЛИТЕРАТУРА
1. Засорина М.А. Профилактика абсцедирования воспалительных инфильтратов мягких тканей в амбулаторной хирургии. Лечащий врач. 2007. № 5. С. 83-85.
2. Привольнев В.В., Каракулина Е.В. Основные принципы местного лечения ран и раневой инфекции. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2011. Т. 13. № 3. С. 214-222.
3. Новые разработки в терапии раневого процесса. Современные препараты на основе альгината натрия и коллаген-хитозанового комплекса. Досье. 2002. № 12. С. 36-38.
4. Потапов А.Ф., Матвеев А.С., Петрова К.М. и др. Внутрибольничная раневая инфекция в отделении реанимации и интенсивной терапии многопрофильного стационара республики Саха (Якутия). Российский медицинский журнал. 2008. № 1. С. 16-18.
5. Казьянин А.В., Орлова Е.В., Ефимова М.Г. и др. Бактериофаги: опыт производства и применения. Фармация. 2010. № 3. С. 36-37.
6. Заривчацкий М.Ф., Мугатаров И.Н., Швецова Ю.А. Использование препаратов бактериофагов для лечения гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей. Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических препаратов: материалы Всерос. научно-практической конференции. Пермь. 2008. С. 104-106.
7. Дарбеева О.С., Майская Л.М., Парфенюк Р.Л. и др. Фагочувствительность возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний к моно- и комбинированным препаратам бактериофагов. Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических препаратов: материалы Всерос. научнопрактической конференции. Пермь. 2008. С. 94-96.
8. Адамс М. Бактериофаги. М. 1961. 527 с.
9. Решетников В.И., Ефимова Н.П., Каменева М.А. Влияние наполнителей и условий сушки на сохранение литической активности бактериофагов. Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке: Матер. конф. Пермь. 2003. С. 244-247.
