Подбор условий для получения антигена вируса лейкоза птиц подгруппы j (alv-j) Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

УДК 619:578.828.3:57.082.26

Ключевые слова: вирус лейкоза птиц подгруппы J, культура клеток фибробластов куриных эмбрионов, антиген

Key words: Avian leukosis virus subgroup J, cell culture of chicken embryonic fibroblasts, antigen

Лазарева С. П., Мудрак Н. С., Чвала И. А.

ПОДБОР УСЛОВИЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ВИРУСА ЛЕЙКОЗА ПТИЦ ПОДГРУППЫ J (ALV-J)

SELECTION OF CONDITIONS FOR PREPARATION OF AN AVIAN LEUKOSIS VIRUS SUBGROUP J ALV-J ANTIGEN

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ») Адрес: 600901, Россия, Владимирская область, г. Владимир, микрорайон Юрьевец

Federal Centre for Animal Health, Federal State-Financed Institution (FGBIARRIAH) Address: 600901, Russia, Vladimir region, Vladimir, Yur'evets

Лазарева Светлана Петровна, вед. биолог референтной лаборатории вирусных болезней птиц

Lazareva Svetlana P., Leading Biologist of Referential Laboratory of Viral Avian Diseases Мудрак Наталья Станиславовна, д. б. н., гл. научн. сотр. референтной лаборатории вирусных болезней птиц Mudrak Natalia S., Doctor of Biological Sciences, Major Researcher of Referential Laboratory of Viral Avian Diseases Чвала Илья Александрович, к. в. н., зав. референтной лабораторией вирусных болезней птиц

Chvala Ilya A., Ph.D. in Veterinary Science, Head of Referential Laboratory of Viral Avian Diseases

Аннотация. Подобраны условия получения изолята вируса лейкоза птиц подгруппы J ALV-J/CLB-908U для производства антигена. Максимальное накопление вируса происходило при инкубации в культуре клеток фибробластов эмбрионов кур (ФЭК) в течение 12 суток и концентрации антигена р27 в исходном материале не менее 5 000 пкг/см3. Полученный антиген вируса, нанесенный на иммунологические планшеты, сохранял активность в течение 12 месяцев при 4 °С.

Summary. The conditions for cultivation of an avian leukosis virus subgroup J isolate ALV-J/CLB-908U usedfor antigen preparation are selected. The highest rate ofvirus yield was the result of inoculation of the primary cell culture of chicken embryonic fibroblasts (CEF) with the virus material containing p27 antigen no less than 5 000 pcg/ml and incubation it for 12 days. The preparated, adsorped on the immunology plates and stored at 4 °C viral antigen kept its activity during 12 months.

Введение

Вирус лейкоза птиц подгруппы J (АЬУ^) является возбудителем миелоидного лейкоза, а также других заболеваний миелоидной природы, таких как эритробластоз и геман-гиомы [5, 7, 9].

АЬУ^ распространен в птицеводческих хозяйствах во всем мире, в том числе и в Российской Федерации [5]. Антитела против АЬУ^ периодически выявляют в сыворотках крови кур птицефабрик различных регионов РФ [2].

На сегодняшний день наиболее распространенными методами борьбы с инфекцией являются регулярный серологический мониторинг поголовья птицы с последующей выбраковкой и уничтожением больных стад птицы [5, 7].

Для проведения серологического мониторинга и диагностики инфекции широко при-

меняется метод иммуноферментного анализа (ИФА). Основным компонентом тест-систем на основе непрямого варианта ИФА для выявления антител является антиген. С целью получения активного и стабильного препарата антигена необходимо подобрать условия, позволяющие получить вирус в максимально высоких концентрациях.

Для культивирования АЬУ^ применяют первичную культуру клеток (КК) фибробластов эмбрионов кур (ФЭК), перевиваемую КК фибробластов эмбрионов кур DF-1, КК моноцитов, полученных из костного мозга цыплят [5, 6, 7, 8]. Наиболее часто для работы с АЬУ^ используется КК ФЭК.

Целью нашей работы являлось определение оптимальных условий культивирования АЬУ^ на КК ФЭК, а также тестирование активности и стабильности препарата антигена, полученного на основе данного изолята.

Материалы и методы

Вирусы. В работе использовали культу-ральную вируссодержащую жидкость 2 и 3 пассажа, содержащую изолят ALV-J/CLB-908U, выделенный в 2009 г. из патологического материала, поступившего из птицефабрики Челябинской области.

Культивирование вируса. Культивирование ВЛП-J проводили на первичной культуре клеток ФЭК, приготовленной из 12-су-точных SPF-эмбрионов кур (фирма Valo Biomedia, Германия). Для получения монослоя КК ФЭК применяли флаконы емкостью 25 см2 (Corning, США). В качестве ростовой среды использовали смесь сред Лейбови-ца (Sigma, США) и Маккоя (Sigma, США) в соотношении 2 : 1 c содержанием 10 % фе-тальной сыворотки КРС (Bioclot, Бразилия). В качестве поддерживающей среды применяли смесь сред Лейбовица (Sigma, США) и Маккоя (Sigma, США) в соотношении 2 : 1 c содержанием 2 % фетальной сыворотки КРС (Bioclot, Бразилия). После формирования монослоя КК ФЭК проводили замену ростовой среды на поддерживающую в объеме 10 см3 на флакон, вносили вирусный материал, инкубировали при 37 °С. Вирусный материал снимали с флакона путем замораживания-оттаивания. Незараженную КК ФЭК проверяли на наличие эндогенных ALV путем выявления типоспецифического антигена p27 методом сэндвич-ИФА с применением коммерческого набора Avian leukosis virus antigen test kit (Synbiotics, США).

Определение оптимального срока инкубации ALV-J. Культуру клеток заражали изо-лятом ALV-J/CLB-908U 2 пассажа в объеме 0,2 см3 и инкубировали при 37 °С. Ежедневно снимали монослой с 3 флаконов и измеряли концентрацию антигена p27 в полученной вируссодержащей суспензии. Согласно наставлению к набору, величина порогового значения равна 900 пкг/см3. Продолжительность эксперимента составила 14 сут. Статистическую обработку результатов проводили с помощью компьютерной программы Microsoft Excel 2007.

Определение оптимальной инфицирующей концентрации ALV-J. Препарат культу-ральной жидкости 3 пассажа, показавший

наиболее высокий результат по содержанию типоспецифического антигена, разводили в 10, 100, 1 000 раз. Каждым вариантом разведения, а также цельным препаратом заражали по 3 культуральных флакона в объеме 1 см3. Продолжительность инкубации при 37 °С определялась предыдущим экспериментом. По истечении срока инкубации в каждом образце измеряли концентрацию антигена. Статистическую обработку результатов проводили с помощью компьютерной программы Microsoft Excel 2007.

Получение антигена ALV-J. Получение очищенного препарата антигена осуществляли согласно разработанной ранее методике [1].

Определение рабочего разведения антигена ALV-J. Рабочее разведение полученного препарата антигена определяли в непрямом варианте ИФА с использованием референтных сывороток (Synbiotics, США) [1].

Изучение длительности хранения препарата антигена ALV-J. Препарат антигена ALV-J разводили в карбонатно-бикарбо-натном буфере (КББ) (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), наносили на планшеты (Nunc, Дания) и хранили при 4 °С. Стабильность антигена тестировали методом непрямого ИФА с использованием панели сывороток, состоящей из референтных сывороток (Synbiotics, США), гипериммунной сыворотки после двукратного заражения 40-суточных цыплят-бройлеров изолятом ALV-J/CLB-908U, а также сывороток крови кур, имеющих разный иммунный статус к ALV-J, полученных из птицефабрик РФ. Работу проводили в течение 12 месяцев с интервалом в 1, 3, 6, 9, 12 месяцев. Статистическую обработку результатов проводили с помощью компьютерной программы Microsoft Excel 2007.

Результаты и обсуждение

ALV-J не вызывают видимого цитопатиче-ского действия (ЦПД) на КК ФЭК, что делает невозможным применение микроскопического метода для оценки накопления данного вируса в КК ФЭК. Исходя из этого, количество вирусного материала определяли с помощью метода сэндвич-ИФА, позволяющего измерить концентрацию типоспецифическо-

го антигена p27. Известно также, что АЬУ^ являются медленнодействующими [8, 9], однако продолжительное время инкубации КК, зараженных вирусом, может приводить к дегенерации монослоя и частичной потере вирусного материала. Поэтому для получения более точных данных по инфекционной активности АЬУ^ и последующего проведения исследований по изучению изолятов необходимо было оптимизировать время инкубации вируса на КК ФЭК.

Согласно проведенным ранее исследованиям, период репродукции для разных изо-лятов АЬУ^ на КК ФЭК может длиться от 7 до 14 суток [6, 7, 8, 9]. Для проведения работы по определению оптимального срока инкубации вируса был выбран максимально известный срок инкубации планшет, составивший 14 суток.

Заражение КК ФЭК изолятом АЬУ^/СЬВ-908и проводили по стандартной методике. Концентрация р27 в исходном материале составила 3 999 пкг/см3. Результаты определения концентрации типоспецифического антигена представлены на диаграмме (рис. 1).

На основании полученных данных была построена кривая накопления вируса в КК ФЭК. С 1 по 7 сутки инкубации концентрация типоспецифического антигена была ниже порогового значения (менее 900 пкг/см3). С 8 по 12 сутки происходило постепенное накопление антигена, максимальное значение концентрации которого было отмечено на 12 сутки инкубации. На 14 сутки инкубации концентрация антигена была ниже порогового значения. С учетом данных результатов была проведена работа по определению титра инфекционной активности изолятов АЬУ^ при инкубации в течение 12 суток, однако результаты были аналогичны данным, полученным ранее [3].

Известно, что уровень накопления вируса зависит от концентрации вируса в исходном

Рис. 1. Динамика накопления АЬУ^ в КК ФЭК в зависимости от времени инкубации (п = 3).

материале. Поэтому следующим этапом работы было определение концентрации изо-лята АЬУ^/СЬВ-908и, заражение которой приводит к наибольшему накоплению вируса в КК ФЭК. В качестве исходного материала для заражения культуры клеток был выбран препарат с наиболее высокой концентрацией типоспецифического антигена (5 328 пкг/см3), полученный в предыдущем эксперименте. Время культивирования составило 12 суток. Результаты показаны в табл. 1.

Из приведенных результатов видно, что накопление типоспецифического белка вируса было прямо пропорционально его концентрации в исходном материале. Наибольшая концентрация типоспецифического антигена, составившая (14 237±12) пкг/см3, наблюдалась на 12 сутки в пробе, зараженной цельным материалом с концентрацией антигена р27 5 328 пкг/см3.

По результатам работы, проведенной ранее, для получения препарат антигена применялся вирусный материал, содержащий изолят АЬУ-Г/СЬВ-908и с концентрацией вирусного белка р27 (3 363±24) пкг/см3, активность которого составила 1 : 200 [1]. Применение препарата антигена с малой активностью приводит к повышенному его расходу при изготовлении раствора для сенсибилизации планшет.

Таблица 1.

Накопление ALV-J в зависимости от концентрации антигена вируса в исходном материале (п = 3)

Концентрация антигена вируса в исходном материале, пкг/см3 5,328 53,28 2,8 5328

Накопление антигена вируса, пкг/см3 1877±23 5449±17 6622±31 14237±12

Примечания: № 1 - Synbiotics, нормальная сыворотка; № 2 - Synbiotics, гипериммунная сыворотка; № 3 - сыворотка, полученная на 40-суточных цыплятах-бройлерах, двукратно зараженных изолятом АЦУ^/СЬВ-908и (60 суток после заражения); №№ 4-10 - сыворотки крови кур с птицефабрик; №№ 4-6 - не имеющие антител к ALV-J; №№ 7-10 - бройлеры в возрасте 270-335 сут. с разным уровнем антител к АЬ^; отр - отрицательный результат.

Таблица 2.

Титры сывороток с антигеном в разные сроки хранения, log2T

^\^Сроки сыво-^^^^ ротки № до хранения 1 месяц 3 месяца 6 месяцев 9 месяцев 12 месяцев

1 отр отр отр отр отр отр

2 10,144±0,71 10,644 10,644±0,58 10,98±0,58 10,644 10,644±0,9

3 13,144±0,71 12,98±0,58 12,98±0,58 12,644 13,31±0,58 9,98±0,58

4 отр отр отр отр отр отр

5 отр отр отр отр отр отр

6 отр отр отр отр отр отр

7 10,644 9,644±0,9 9,644 9,98±0,58 9,98±0,58 10,31±0,58

8 11,644 9,98±0,58 9,98±0,58 10,31±0,58 9,98±0,58 10,31±0,58

9 9,644 8,31±0,58 8,31±0,58 8,31±0,58 8,644 9,98±0,58

10 11,644 11,31±0,58 11,98±0,58 12,31±0,58 11,98±0,58 11,98±0,6

Активность препарата антигена, полученного из материала с наиболее высокой концентрацией р27, равной (1 4237±12) пкг/см3, составила 1 : 500. Далее необходимо было проверить способность данного антигена храниться при температуре 4 °С после нанесения на планшеты. Срок хранения сенсибилизированного антигена должен составлять не менее 12 мес., что равно сроку годности наборов для проведения ИФА-диагностики. В связи с этим был проведен эксперимент по проверке стабильности антигена, полученного из более концентрированного вирус-содержащего материала. Результаты данной работы приведены в таблице 2.

В результате проведенной работы было отмечено, что в процессе хранения антиген, сенсибилизированный на планшеты, не связывался с отрицательными сыворотками. Значения титров референтной гипериммунной сыворотки и контрольной гипериммунной сыворотки не снижались и изменялись в пределах одного разведения, что является допустимым отклонением. Значения титров сывороток крови кур из птицефабрик варьировали в аналогичном диапазоне. Таким образом, наличие вирусного материала с более высокой концентрацией типоспецифическо-го антигена позволило получить активный

препарат антигена, стабильность которого сохранялась в течение 12 месяцев.

При исследовании проб незараженной КК ФЭК на наличие антигена р27 с помощью сэндвич-ИФА были получены отрицательные результаты. Это доказывает отсутствие в КК эндогенных АЬУ

Заключение

В ходе проведенной работы было показано, что для изготовления активного препарата антигена для ИФА-диагностики на основе изолята АЬ^Г/СЬВ-908и необходимо заражать КК ФЭК материалом с исходной концентрацией типоспецифического антигена р27 не менее 5 000 пкг/см3 и инкубировать в течение 12 суток. Соблюдение данных условий позволило получить вируссодержа-щий материал с концентрацией р27, равной (14 237±12) пкг/см3, на основе которого был изготовлен препарат антигена активностью 1 : 500, сохранявший стабильность в течение 12 месяцев хранения при 4 °С.

Список литературы

1. Лазарева, С. П. Получение иммуноспецифи-ческих компонентов для диагностики лейкоза птиц подгруппы J [Текст] / С. П. Лазарева, Н. С. Мудрак, И. А. Чвала // Инновационные процессы в АПК: сб. статей 6-й Междунар. научно-практ. конф. препода-

вателей, молодых ученых, аспирантов и студентов. -Москва, 2014. - С. 156-159.

2. Лазарева, С. П. Серологический мониторинг лейкоза птиц подгруппы J в птицеводческих хозяйствах России за 2008-2012 гг. [Текст] / С. П. Лазарева, А. Э. Меньщикова, Н. С. Мудрак // Инновационное развитие науки в обеспечении биологической безопасности: материалы Междунар. науч. конф. молодых ученых. - Гвардейский, Респ. Казахстан, 2013. -С. 124-129.

3. Лазарева, С. П. Особенности лейкоза птиц при экспериментальном заражении 40-суточных цыплят-бройлеров [Текст] / С. П. Лазарева, Т. И. Ерошина, Н. С. Мудрак, И. А. Чвала // Ветеринария сегодня. -2014. - № 2. - С. 34-39.

4. Плотников, В. А. Молекулярно-генетический анализ и биологическая характеристика полевых изо-лятов вируса лейкоза птиц, циркулирующих на территории Российской Федерации : дис. ... канд. биол. наук [Текст] / Плотников Вадим Алексеевич. - Москва, 2014. - 145 с.

5. Тимофеева, Т. А. Распространение вируса лейкоза птиц среди птицеводческих хозяйств Российской Федерации [Текст] / Т. А. Тимофеева, Т. И. Алипер, Е. К. Дудникова, О. А. Верховский // Материалы

Международной юбилейной научно-практической конференции «Новое в эпизоотологии, диагностике и профилактике инфекционных и незаразных болезней птиц в промышленном птицеводстве». - СПб., 2004. - С. 68-69.

6. Fadly, A. M. Avian leukosis virus subgroup J envelope gene product for diagnosis and immunogenic composition: patent US6146641 A, USA [Текст] / A. M. Fadly, H. D. Hunt, L. F. Lee. - IPC US 09/160,065 № W02000004921A9, declared 24-09-1998, published 14-11-2000.

7. Kim, Y. Comparison and verification of quantitative competitive reverse transcription polymerase chain reaction (QC-RT-PCR) and real time RT-PCR for avian leukosis virus subgroup J [Текст] / Y. Kim [et al] // J. Virol. Meth. - 2002. - Vol. 102, N 1-2. - P. 1-8.

8. Maas, R. Replacement of primary chicken embryonic fibroblasts (CEF) by the DF-1 cell line for detection of avian leucosis viruses [Текст] / R. Maas, D. van Zoelen, H. Oei, I. Claassen // Biologicals. -

2006. - Vol. 34, N 3. - P. 177-181.

9. Sun, S. Epidemiological and pathological studies of subgroup J avian leukosis virus infections in Chinese local "yellow" chickens / S. Sun, Z. Cui // Avian Pathology. -

2007. - Vol. 36, N 3. - P. 221-226.