CC BY
5УДК 691.175.5/.8
DOI: 10.21779/2542-0321-2023-38-4-89-97
А.А. Рабаданова, К.Э. Рамазанова, З.А. Омарова, Ф.Ф. Оруджев
Пьезоэлектрически индуцированные антибактериальные свойства пористой мембраны из поливинилиденфторида (ПВДФ)
Дагестанский государственный университет; Россия, 367000, г. Махачкала, ул. М. Гаджиева, 43а; [email protected]
Аннотация. Совмещенным методом термоиндуцированной инверсии фаз и инверсии фаз из нерастворителя (NIPS-TIPS) с помощью техники ракельного ножа была получена пористая мембрана на основе сегнетоэлектрического полимера ПВДФ. Мембрана была охарактеризована методами сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), Ик-спектроскопии с Фурье преобразованием (Ик-Фурье) и были исследованы пьезосвойства. Доля электроактивной фазы составила 93 %. Антибактериальную активность исследовали на культуре кишечной палочки штамма М-17 (B-2929 Escherichia coli М-17) в ходе УЗ-стимуляции. Значение антимикробной активности составило 64 и 62 % в сравнении с контрольными экспериментами. Показано, что наиболее вероятными механизмами инактивации бактерий являются электростимуляция и генерация гидроксильных и супероксидных анионных радикалов.
Ключевые слова: пьезопотенциал, поливинилиденфторид (ПВДФ), ультразвуковая стимуляция, антибактериальные свойства.
Введение
Бактериальные инфекции являются серьезной проблемой в медицине, особенно при лечении ран и ожогов: бактерии могут проникать в рану и вызывать воспаление, задерживая процесс заживления и увеличивая риск осложнений. Одним из известных подходов к лечению инфекционных заболеваний является лечение антибиотиками. Однако частое их использование может способствовать повышению устойчивости бактерий к ним, что в дальнейшем повлечет за собой возможные проблемы со здоровьем [1]. Весьма интересным является подход в изучении пьезоэлектрических композиционных биоматериалов, за счет своих функциональных возможностей. Пьезоэлектрические материалы могут быть органическими (в основном полимерами), генерирующими электрический заряд в ответ на приложенное механическое напряжение. Сонопьезоэлектри-ческий эффект, который относится конкретно к пьезоэлектрическому эффекту, активируемый механическим напряжением, возникающим под действием ультразвуковых частот, проявляется в неорганических и органических наноматериалах [2]. Материал наделяется функцией мостового соединения между механическим напряжением и электрической энергией [3]. Локализованный электрический заряд накапливается на поверхности и тем самым влияет на потенциал клеточной оболочки.
Бактерии могут чувствовать окружающую среду и изменять свой фенотип в ответ на нее за счет влияния механической вибрации на поверхностную адгезию, пролиферацию и вирулентность. Однако о влиянии на поведение бактерий электрических сигналов, создаваемых электроактивным материалом, а не акустомеханических волн, почти не сообщалось. Разработка такого рода материалов [4], а именно обладающих пьезоэлектрической активностью, широко изучается в регенеративной медицине, главным образом для заживления ран посредством биопленок.
В многочисленных исследованиях [5; 6] сообщалось об инактивации бактерий посредством пьезокатализа с использованием пьезоэлектрической керамики. Однако известно, что пьезоэлектрическая керамика хрупкая, и это ограничивает ее применение по сравнению с полимерными материалами. Поливинилиденфторид (ПВДФ) - полукристаллический пьезоэлектрик, обладающий спонтанной поляризацией и высоким пьезоэлектрическим откликом [7]. Кроме того, полимер имеет левостороннюю ориентацию спирали, как и естественные пьезоэлектрики в организме человека (коллаген, хитин и эластин) [8]. Он характеризуется пьезоэлектричеством в сдвиговой моде и электрической дипольной составляющей, распределенной по всей молекуле. Скручивание полимерной пленки приводит к ориентации молекулярных диполей и генерации электрического заряда [9], что может обеспечить противомикробный эффект. Было продемонстрировано [10], что низкое напряжение, вырабатывающееся вследствие пьезо-стимуляции, способствует пролиферации и восстановлению тканей. Мембрана на основе ПВДФ была использована в качестве раневой повязки, благодаря своим антибактериальным свойствам, способствующим заживлению ран [11; 12].
В статье представлены результаты синтеза пористой мембраны ПВДФ с высокой долей полярной электроактивной фазы. Также была изучена зависимость воздействия ультразвуковой стимуляции на пьезоотклик мембраны и ее антибактериальная активность на грамположительных бактериях.
Материалы и методы
В исследовании использовалась полимерная мембрана ПВДФ толщиной 100 мкм, полученная методом термоиндуцированной инверсии фаз из нерастворителя (NIPS-TIPS). Раствор полимера ПВДФ («ГАЛОПОЛИМЕР», Пермь, РФ) с концентрацией 20 мас. % был приготовлен в растворителе диметилсульфоксида (DMSO). Полученную смесь перемешивали в шейкере (Vortex) в течение 10 минут до однородной консистенции. Затем обрабатывали в нагретой ультразвуковой ванне до образования гомогенного раствора. Суспензию переносили на стеклянную пластину и с помощью ракеля толщиной 100 мкм проводили до однородного растекания по всей области пластинки. Затем полученную пленку погружали в ванну с водой на 10 минут для формирования фаз. Затем отправляли в сушильную камеру при 80 °C на 24 часа для удаления оставшегося растворителя.
Пьезоэлектрическую постоянную d33 измеряли на приборе YE2730A d33 METER. Измерения образца проводили по 5 раз и результат усредняли. Измерения методом ИК-спектроскопии с Фурье-преобразованием (ИК-Фурье) проводили на приборе Vertex70v (Bruker, Billerica, MA, USA) в режиме пропускания с 512 итерациями и разрешением 1 см-1. Спектры флуоресценции раствора регистрировались на спектрофотометре Hitachi F-4500 при длине оптического пути 1.0 см при возбуждении длиной волны 310 нм и регистрации пика эмиссии флуоресценции при 430 нм через фиксированные промежутки времени. Спектры поглощения в УФ-видимой области регистрировались на спектрофотометре СФ-2000. Ультразвуковая обработка производилась в ванне мощностью 120 Вт при частоте 40 кГц. Мембрана 3*1 см. Морфология образцов была охарактеризована с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ, Aspex Express). Для оценки антибактериальной активности образцов мембран ПВДФ в качестве тест-объекта использовали культуру кишечной палочки штамма М-17 (B-2929 Escherichia coli М-17) из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур («ГКПМ - Оболенск» ФБУН ГНЦ ПМБ).
Результаты и обсуждение
Для проведения комплексного анализа морфологии была использована сканирующая электронная микроскопия. На рис. 1 представлены СЭМ-изображения мембраны ПВДФ при различных увеличениях.
10 15 20 25 30 Размер пор (мкм)
Рис. 1. а) СЭМ-изображения мембраны ПВДФ при различных увеличениях; б) Гистограмма
распределения пор
Из снимков СЭМ можно увидеть, что мембрана имеет пористую структуру. Поры равномерно распределены по всей мембране и имеют квазисферическую форму. Образование пор или макропустот связано с вытеснением растворителя водой в процессе фазовой инверсии [13]. Также СЭМ-изображения были проанализированы с использованием программного обеспечения ImageJ для определения распределения пор по размерам. Из гистограммы распределения пор в мембране (рис. 1б) следует, что средний диаметр пор составляет порядка 20 мкм.
ПВДФ характеризуется 5 полиморфами (а, в, У, д, с), среди которых в является наиболее электроактивной фазой, обладающей спонтанной поляризацией [14; 15]. В связи с этим необходимо было дать количественную оценку содержания полярных и неполярных фаз. Для расчетов количественных соотношений электроактивной и неполярных фаз использовали метод ИК-Фурье спектроскопии.
ПВДФ
400 600 800 1000 1200 1400 Волновое число(см )
Рис. 2. ИК-Фурье спектр мембраны ПВДФ
На рис. 2 показаны ИК-Фурье спектры в диапазоне (от 400 до 1400) см-1. Полосы поглощения, наблюдаемые при 976, 763, и 611 см-1, соответствуют неполярной а-фазе ПВДФ, тогда как характерные пики при 1276, 1233 и 840 см-1 соответствуют электроактивным в- и у-фазам [16, 17]. Интенсивность всех полос поглощения, характеризующих неполярную а-фазу, очень низкая, и спектр в основном описывается характеристическими полосами как в-, так и у-фаз ПВДФ [18, 19].
Долю электроактивной фазы оценивали с помощью формулы:
Ь
'ЕА
Fea = JK-:-* 100
I ~
L763
(fe9* '763 +lEA
где, IEA и I763 - абсорбция при 840* и 763 см-1 соответственно; K840* и K763 - коэффициенты поглощения при соответствующих волновых числах, значения которых составляют 7.7*104 и 6.1х104 см2 моль-1 соответственно. Согласно уравнению, было оценено содержание электроактивной фазы в ПВДФ и установлено, что она составила 93.4 %.
Антибактериальный эффект воздействия импульсов пьезоэлектрического поля, генерируемого мембраной ПВДФ в отношении культуры бактерий E. coli
М-17
В качестве механического воздействия на мембраны ПВДФ для формирования импульсов пьезоэлектрического поля использовалась ультразвуковая стимуляция (УЗ). Культуральные свойства тест-объекта при росте на плотной питательной среде - круглые колонии кремоватого цвета с матовой поверхностью и ровными краями, морфологические и тинкториальные свойства - небольшие грамотрицательные палочки с закругленными концами. Суспензию бактерий тест-объекта получили из суточной культуры E. coli М-17 путем разведения (1:1000) стерильным физраствором (0.9 % NaCl) и разделили на 3 варианта обработки (по 10 мл):
I вариант - отрицательный контроль, в котором на протяжении эксперимента суспензия бактерий не имела контакта с мембранами ПВДФ и не была подвержена воздействию УЗ (контроль), необходим для определения исходного количества колониеоб-разующих единиц (КОЕ) в 1 мл суспензии;
II вариант - суспензия бактерий подверженная воздействию УЗ в отсутствии контакта с мембранами ПВДФ (УЗ),
III вариант - суспензия бактерий, подверженная воздействию УЗ в присутствии мембраны ПВДФ (УЗ + ПВДФ).
После обработки УЗ (15 мин) по 1 мл суспензии микроорганизмов из каждого варианта инокулировали методом горячей заливки в 20 мл стерильного, расплавленного и остуженного до t ~ 40-42 °C питательного агара (МПА). Инкубировали полученные образцы в чашках Петри при 37 °C в течение 36 часов. Полученные микроорганизмы по культуральным, тинкториальным и морфологическим свойствам соответствуют тест-культуре. Результаты эксперимента представлены на рисунках 3 и 4.
Рис. 3. Изображение чашек с колониями E. coli через 36 часов после инокуляции. Обозначение а) соответствует суспензии E. coli М-17 без контакта с ПВДФ и воздействия УЗ, b) - без ПВДФ и подверженная УЗ, с) подверженная УЗ в присутствии ПВДФ
Оценку антибактериальных свойств импульсов пьезоэлектрического поля осуществляли по количеству жизнеспособных бактерий E. coli в единице объема суспензии после контакта с мембранами ПВДФ в сравнении с исходным их количеством. Уровень антимикробной активности (AR, %) рассчитывали по формуле:
Лй = 100-
КОЕ,
эксперимент
КОЕк,
х 100 %.
^контроль
Для подсчета колоний использовали метод определения колониеобразующих единиц (КОЕ) посредством программ Image J и DLgram (Nanoparticles).
В 1 мл полученной нами суспензии (контроль) количество бактерий соответствовало 443 КОЕ (рис. 4, I). Обработка УЗ в течение 15 мин (вариант II) на количество жизнеспособных бактерий существенно не повлияла, величина АК составила 6 % (рис. 4, II). В противоположность этому, воздействие импульсов пьезоэлектрического поля, генерируемых мембранами ПВДФ при УЗ стимуляции, оказало значительное влияние на жизнеспособность бактерий E. тН (рис. 4, III). Значение АК в этом варианте составило 64 % при сравнении с контролем и 62 % в сравнении с вариантом УЗ без кон-
такта с мембраной ПВДФ. Полученные результаты подтверждают, что пьезоэлектрические мембраны ПВДФ проявляют уникальные свойства, которые могут быть использованы для ингибирования роста и уничтожения бактерий. Пьезоэлектрические мембраны обладают способностью генерировать электрическое поле под воздействием механических напряжений. Это означает, что при деформации мембран возникают электрические заряды и поля, которые могут воздействовать на бактерии. Изучение природы этого воздействия - отдельная и интересная задача для исследования. Электрическое поле, возможно, негативно влияет на целостность клеточных мембран бактерий, что в свою очередь влияет на метаболизм и приводит к нарушению физико-химического равновесия, и, как следствие, к их гибели [20].
Известно, что пьезоэлектрические материалы могут воздействовать на бактерии посредством различных процессов, таких, как электропорация [8], индуцированная трансмембранным током, и генерация активных форм кислорода (АФК) [21]. Для определения возможного механизма было проведено измерение пьезоэлектрической постоянной d33 мембраны с помощью квазистатического пьезоэлектрического тестера YE2730A d33 METER. Результат показал, что величина d33 составляет порядка 1.5 пКл/Н.
Для подтверждения возникновения пьезоэлектрического потенциала при ультразвуковом воздействии был создан пьезоэлектрический наногенератор. На рисунке 5 изображены сигналы, полученные с помощью наногенератора. Механическое воздействие производилось с использованием УЗ ванны мощностью 120 Вт и частотой 40 кГц, которая также использовалась для антибактериальных экспериментов. Продолжительность и задержка между стимуляциями составляли 5 секунд. Как видим, максимальный пьезопотенциал, генерируемый при этом, составляет порядка 3.5 В. Однако при этом не исключена и генерация АФК в процессе УЗ стимуляции.
В наших предыдущих работах было показано, что основным АФК являются гид-роксильные и супероксидные анионные радикалы [22; 23]. Для обнаружения возможных АФК СОН и О2-) в процессе УЗ стимуляции была использована флуоресцентная и УФ-видимая спектроскопия с использованием терефталевой кислоты и хлорид нитро-синего тетразолия (КВТ) в качестве молекулярных зондов соответственно. Результаты представлены на рисунке 6. Отсутствие явного пика в начале эксперимента (рис. 6а)
указывает на то, что ОН нет в реакционном растворе. Однако после 15 минут УЗ стимуляции характерный пик флуоресценции при длине волны 425 нм повышается из-за реакции молекул терефталевой кислоты с ОН с образованием флуоресцентного 2-гидрокситерефталевой кислоты.
На рис. 6б характерный пик поглощения на длине волны 259 нм непрерывно уменьшается по ходу эксперимента из-за образования формазана в результате реакции между КВТ и О2-. Учитывая то, что пиковая интенсивность на длине волны 259 нм медленно уменьшается со временем реакции, генерацию О2- также нельзя игнорировать. Таким образом, эти результаты подтверждают, что оба радикала ^ОН и ^О2- образуются в процессе УЗ стимуляции.
ф о
о о
Z
ш s
о
Z
ф
ф ф
S
X
ф
о
Е
о с
360 380 400 420 440 460 480 500 200 220 240 260 280
Длина волны (нм) Длина волны (нм)
а) б) ^
Рис. 6. а) Спектры флуоресценции 2-гидрокситерефталевой кислоты для обнаружения ОН. б) УФ-видимые спектры поглощения раствора хлоридом нитросинего тетразолия для обнару-жения^О2-
Выводы
Таким образом мы продемонстрировали, что совмещением методов термоинду-цированной инверсии фаз и инверсии фаз из нерастворителя (NIPS-TIPS) с помощью техники ракельного ножа можно получить высокопористую мембрану ПВДФ с очень высокой долей электроактивной фазы (более 90 %). Показали, что воздействие импульсов пьезоэлектрического поля, генерируемых мембраной ПВДФ при УЗ стимуляции, оказало значительное влияние на жизнеспособность бактерий E. Coli. Значение антимикробной активности составило 64 и 62 % в сравнении с контрольными экспериментами. Данные о генерации пьезопотенциала в условиях УЗ стимуляции и эксперименты по регистрации с помощью молекулярных зондов АФК продемонстрировали, что наиболее вероятными механизмами инактивации бактерий являются электростимуляция и генерация гидроксильных и супероксидных анионных радикалов. Полученные результаты подтверждают, что пьезоэлектрические мембраны ПВДФ проявляют уникальные свойства, которые могут быть использованы для ингибирования роста и уничтожения бактерий.
Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта РНФ, проект № 22-73-10091.
Литература
1. Labricciosa F.M. et al. Emergency surgeons' perceptions and attitudes towards antibiotic prescribing and resistance: a worldwide cross-sectional survey // World journal of emergency surgery. 2018. Vol. 13, no. 1. - Pp. 1-9.
2. Marino A. et al. Piezoelectric effects of materials on bio-interfaces // ACS applied materials & interfaces. 2017. Vol. 9, no. 21. - Pp. 17663-17680.
3. Chen D. et al. Recent development and perspectives of optimization design methods for piezoelectric ultrasonic transducers // Micromachines. 2021. Vol. 12, no. 7. - P. 779.
4. Orudzhev F. et al. Ultrasound and water flow driven piezophototronic effect in self-polarized flexible a-Fe2O3 containing PVDF nanofibers film for enhanced catalytic oxidation // Nano Energy. 2021. Vol. 90. - P. 106586.
5. Feng J. et al. Significant improvement and mechanism of ultrasonic inactivation to escherichia coli with piezoelectric effect of hydrothermally synthesized t-BaTiO3 // ACS Sustainable Chemistry & Engineering. 2018. Vol. 6, no. 5. - Pp. 6032-6041.
6. Masimukku S. et al. High efficient degradation of dye molecules by PDMS embedded abundant single-layer tungsten disulfide and their antibacterial performance // Nano Energy. 2018. Vol. 46. - Pp. 338-346.
7. Orudzhev F. et al. 1D/2D Electrospun Polyvinylidene Fluoride Nanofibers/Carbon Flakes Hybrid Nonmetal Polymeric Photo- and Piezocatalyst // ChemistrySelect. 2023. Vol. 8, no. 43. - P. e202303318.
8. Ando M. et al. Piezoelectric antibacterial fabric comprised of poly (l-lactic acid) yarn // Japanese Journal of Applied Physics. 2017. Vol. 56, no. 10. - P. 10PG01.
9. Wang X., Dai X., Chen Y. Sonopiezoelectric Nanomedicine and Materdicine // Small. 2023. - P. 2301693.
10. Song X. et al. Nanomedicine-Enabled Sonomechanical, Sonopiezoelectric, Sono-dynamic and Sonothermal Therapy // Advanced Materials. 2023. - P. 2212259.
11. Shuai C. et al. Functionalized BaTiO3 enhances piezoelectric effect towards cell response of bone scaffold // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2020. Vol. 185. -P. 110587.
12. Tong W. et al. A highly sensitive hybridized soft piezophotocatalyst driven by gentle mechanical disturbances in water // Nano Energy. 2018. Vol. 53. - Pp. 513-523.
13. Magomedova A.G. et al. Combination NIPS/TIPS Synthesis of a-Fe2O3 and a/y-Fe2O3 Doped PVDF Composite for Efficient Piezocatalytic Degradation of Rhodamine B // Molecules. 2023. Vol. 28, no. 19. - P. 6932.
14. Orudzhev F. et al. Porous Hybrid PVDF/BiFeO3 Smart Composite with Magnetic, Piezophotocatalytic, and Light-Emission Properties // Catalysts. 2023. Vol. 13, no. 5. - P. 874.
15. Orudzhev F.F. et al. Hydrogen Bond-Induced Activation of Photocatalytic and Piezophotocatalytic Properties in Calcium Nitrate Doped Electrospun PVDF Fibers // Polymers. 2023. Vol. 15, no. 15. - P. 3252.
16. Kanik M. et al. Spontaneous high piezoelectricity in poly (vinylidene fluoride) nanoribbons produced by iterative thermal size reduction technique // ACS nano. 2014. Vol. 8, no. 9. - Pp. 9311-9323.
17. Cai X. et al. A critical analysis of the a, ß and у phases in poly (vinylidene fluoride) using FTIR // RSC advances. 2017. Vol. 7, no. 25. - Pp. 15382-15389.
18. Rabadanova A. et al. Piezo-, photo-and piezophotocatalytic activity of electrospun fibrous PVDF/CTAB membrane // Chimica Techno Acta. 2022. Vol. 9, № 4. - P. 20229420.
19. Tewatia K. et al. Enhanced optical properties of recycled Fe2O3 reinforced in PVDF nanocomposite thin films for energy harvesting // Materials Today: proceedings, 2023.
20. Khalil A. M. et al. Innovative antibacterial electrospun nanofibers mats depending on piezoelectric generation // Scientific Reports. 2022. Vol. 12, no. 1. - P. 21788.
21. Tan G. et al. Surface-selective preferential production of reactive oxygen species on piezoelectric ceramics for bacterial killing // ACS applied materials & interfaces. 2016. Vol. 8, no. 37. - Pp. 24306-24309.
22. Edge R., Truscott T.G. The reactive oxygen species singlet oxygen, hydroxy radicals, and the superoxide radical anion-examples of their roles in biology and medicine // Oxygen. 2021. Vol. 1, no. 2. - Pp. 77-95.
23. Campos Chiste R. et al. Superoxide anion radical: generation and detection in cellular and non-cellular systems // Current medicinal chemistry. 2015. Vol. 22, no. 37. -Pp. 4234-4256.
Поступила в редакцию 23 ноября 2023 г.
Принята 7 декабря 2023 г.
UDC 691.175.5/.8
DOI: 10.21779/2542-0321-2023-38-4-89-97
Piezoelectrically-Induced Antibacterial Properties of Porous Polyvinylidene Fluoride
(PVDF) Membrane
А.А. Rabadanova, K.E. Ramazanova, Z.A. Omarova, F.F. Orudzhev
Dagestan State University; Russia, 367000, Makhachkala, M. Gadzhiev st., 43а; [email protected]
Abstract. Using the doctor blade technique, a porous membrane made of PVDF polymer was prepared through a combination of thermally induced phase inversion and non-solvent phase inversion method (NIPS-TIPS). The membrane underwent characterization via scanning electron microscopy (SEM) and Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR). Additionally, its piezoelectric properties were investigated. The electroactive phase was found to be 93 %. The antibacterial activity was investigated on the culture of Escherichia coli strain M-17 (B-2929 Escherichia coli M-17) during ultrasonic stimulation. The antimicrobial activity was found to be 64 % and 62 % compared to control experiments. The study suggests that bacterial inactivation is most likely due to electrostimulation and the generation of hydroxyl and superoxide anion radicals.
Keywords: piezopotential, polyvinylidene fluoride (PVDF), ultrasonic stimulation, antibacterial properties.
Received 23 November, 2023 Accepted 7 December, 2023
