CC BY
255
© ЖИРНОВ О.П., МАНЫКИН А.А., 2014 УДК 578.832.1.083.2
Жирнов О.П., Маныкин А.А.
рН-зависимые перестройки в структуре вируса гриппа А
ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России, 123098, Москва
Вирус гриппа имеет два структурных модуля: внутренний рибонуклеопротеид (РНП), содержащий вирусную геномную РнК, и наружную липидную оболочку, в которую встроены трансмембранный белок ионных каналов М2 и вирусные гликопротеиды гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (NA), формирующие шипы (спайки) на поверхности вирионов. Оба модуля связаны в вирионе посредством матриксного белка М1. Изучено влияние кислой среды с рН 4,2-4,5 на вирус гриппа, выращенный в культуре клеток почки собаки (линия MDCK). Вирус A/Aichi/2/68 (H3N2), синтезированный в MDCK, содержал нерасщепленную форму гемагглютинина НА0 (мол. масса 78 кД). Такие вирионы были резистентными к кислой среде и непроницаемыми для фосфорно-вольфрамовой кислоты (ФВК), используемой в качестве контрастирующего красителя для электронной микроскопии, и не снижали своих инфекционных свойств после кислотной обработки. После расщепления поверхностного гемагглютинина нАо на НА1+НА2 трипсином вирус приобретал чувствительность к кислой среде и после кислотной обработки становился проницаемым для ФВК, а также терял инфекционную активность и имел более жесткую связь вирусного РНП с белковым матриксом М1. Эти данные указывают на то, что структурная форма расщепленного гемагглютинина на поверхности вириона координирует трансмембранное взаимодействие между внешними и внутренними компонентами вируса гриппа.
Ключевые слова: вирус гриппа; структура; кислый pH.
pH-dependent rearrangements in the influenza A virus
Zhirnov O. P., Manykin A. A.
D.I. Ivanovsky Institute of Virology of Ministry of Health of the Russian Federation, 123098, Moscow, Russia
The influenza virus possesses two modules: internal ribonucleoprotein (RNP) containing the viral genome RNA and external lipid envelope with transmembrane ionic channel protein M2 and embedded glycoproteins hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) forming surface spike ends. These modules are combined in a whole virion by the matrix protein M1. The effect of the acidic pH 4,2-4,5 on the influenza virus grown in MDCK-H cells was tested. The A/Aichi/68 (H3N2) virus synthesized in MDCK-H cells was shown to contain uncleaved HA0 (m.w. 78 kD) and provide low infectivity. This virus was resistant to acidic medium and non-permeable to the phosphotungsten acid (PTA) used in electron microscopy as a contrast stain, and did not reduce infectious potential after acidic treatment. The trypsin-activated virus containing cleaved HA1 (56 kD)+HA2 (22 kD) was sensitive to acidic exposition resulting in the appearance of permeability to PTA, reduction of infectivity, enhancement of the M1-RNP interlink. These data indicate that the structural form of the cleaved HA1+HA2 surface hemagglutinin coordinates a transmembrane interaction between surface and internal virus components.
Key words: influenza virus; structure; acidic pH.
Вступление
Вирус гриппа А относится к оболочечным вирусам. Этот вирус имеет два структурных модуля: внутренний рибонуклеопротеид (РНП), содержащий вирусную геномную РНК, и наружную двуслойную липидную оболочку, в которую встроены вирусные гликопротеиды гемагглютинин (HA) и нейраминидаза (NA), формирующие шипы (спайки) на поверхности вирионов, и трансмембранный белок ионных каналов М2 [8]. Оба указанных модуля соединены в вирионе так называемым матриксным белком М1, который частично погружен во внутренний липидный листок мембраны и дополнительно взаимодействует с внутренним РНП [1, 10]. Для выполнения этой функции М1 содержится в вирионе в количестве около 1000 молекул, достаточном для формирования белковой сети по всей внутренней сфере вирусной частицы, имеющей диаметр около 100 нм [12].
Природа межмолекулярных взаимодействий внутри вирусной частицы и их трансмембранные контакты и чувствительность к внешней среде остаются малопонятными. В частности, известно, что связь вирусного РНП с матриксом М1 внутри вириона чувствительна к кислым рН в диапазоне 4-5,5 [12]. При таком рН матриксный белок М1 теряет связь с РНП и становится легкорастворимым, несмотря на свои высокогидрофобные свойства
[13]. Этот механизм имеет критическое значение при внедрении вируса в клетку-мишень, когда в кислой среде клеточной эндосомы происходят последовательное слияние липидных мембран вируса и эндосомы, диссоциация белка М1 из вириона и внутриклеточный выход из вириона свободного вирусного РНП. Этот процесс получил название вирусного раздевания [7]. Процесс раздевания критически зависит от структурной формы поверхностного НА. Этот белок синтезируется в форме предшественника НА0 (мол. масса 75 кД) и затем расщепляется клеточной протеазой трипсиновой специфичности на два фрагмента - НА1 (56 кД) и НА2 (22 кД), которые сохраняют дисульфидную связь. В вирио-нах могут присутствовать обе формы, НА0 и НА1/НА2, но при этом вирионы с НА0 не способны выполнять функцию слияния липидных мембран вируса и клеточной эндосомы и поэтому оказываются неинфекционными из-за неспособности внедряться в клетку-мишень, а вирионы, содержащие хотя бы часть молекул в расщепленной форме НА1/НА2, имеют высокую сливающую мембраны активность и высокую инфекционность для клеток-мишеней [16].
В настоящей работе предпринята попытка изучить влияние кислого рН наружной среды на внутривирион-ные контакты молекул и биологические свойства вирио-
Для корреспонденции: Жирнов Олег Петрович. проф.; [email protected]
41
нов и определить участие наружных гликопротеидов в передаче внешнего воздействия кислой среды на внутреннюю структуру вириона. Обнаружено, что короткая экспозиция вирионов в слабокислой среде приводит к усилению внутривирионного взаимодействия между матриксом М1 и РНП, которое, по всей вероятности, затрудняет выход свободного РНП после растворения липидной оболочки вируса. Медиатором влияния кислого рН служил HA, поскольку только его расщепленная форма НА1+НА2 вызывала проницаемость вириона для кислой среды и проникновение контрастного красителя внутрь вириона при электронной микроскопии. Вирионы с нерасщепленным гемагглютинином НА0 оказывались устойчивыми к влиянию кислого рН и непротекаемыми для кислой среды и контрастного вещества при электронно-микроскопическом исследовании. Полученные данные указывают на то, что расщепление поверхностного гликопротеида НА0 вызывает трансмембранную перестройку внутренней структуры вириона, в результате которой вирус становится чувствительным к внешнему воздействию кислым рН. Таким образом, можно заключить, что в вирусе гриппа существует трансмембранный механизм кооперативного взаимодействия внутренних структур с наружными гликопротеидами и ионными каналами липидной оболочки вируса.
Материалы и методы
Вирус и клетки. Культуры эпителиальных клеток почки собаки (МДСК-Н) культивировали в минимальной среде Дульбеко (DMEM) с добавлением 10% фетальной сыворотки коров (Gibco BRL) и антибиотиков (гентамицин, 25 мкг/мл; пенициллин - 50 ED/мл; стрептомицин - 50 мкг/ мл). Культура клеток получена из коллекции клеточных культур Института вирусологии г. Марбурга (Германия).
Выращивание и фракционирование вируса. Вирус гриппа штамм A/Aichi/2/68 (H3N2) выращивали в культуре МДСК-Н в среде ДМЕМ без сыворотки в течение 15 ч. Вируссодержащую культуральную жидкость осветляли центрифугированием при 8500 об/мин в течение 20 мин и далее осаждали через раствор глицерола, содержащего неионный детергент NP-40 [12]. Образцы культуральной жидкости центрифугировали через 2 мл 35% раствора глицерола, приготовленного на фосфатном буфере (ФБ) (10 мМ Na2HPO4/NaH2PO4, pH 7,2; 2,7 мМ KCl; 137 мМ NaCl) при 20 000 об/мин в течение 90 мин в роторе SW-55.1 (Spinko L7). Полученные вирусные осадки суспендировали в ФБ и подвергали обработке различными рН в течение 30 мин. Далее вирусные образцы в объеме 3 мл помещали в пробирку для ротора SW-55.1 и подслаивали 2,7 мл 30% раствора глицерола, содержащего 100 мМ NaCl, 2,5 мМ Na-ацетатного буфера (рН 4,2), 0,3% NP-40 либо глицерол аналогичного состава, но содержащий 20 мМ трис-НС1 (рН 8,0) вместо NA-ацетатного буфера. Сформированные пробирки центрифугировали в роторе SW-55.1 при 27 000 об/мин в течение 3 ч при 10°С для осаждения субвирусных структур вируса. Осадки (фракция субвирусных частиц) после центрифугирования растворяли в 0,5% растворе додецилсульфата натрия (ДСН) и анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПАГ).
Очистка вирусов. Культуральную жидкость в объеме 2,5 мл центрифугировали при 8000 об/мин в течение 20 мин (5°С) для удаления клеточных обломков. Полученный супернатант наслаивали на 2,5 мл 20% сахарозы, приготовленной на ФБ, и центрифугировали в роторе SW 55.1 (Spinko L7) при 25 000 об/мин в течение 2 ч (10°С). Полученные вирусные осадки суспендировали в 1% ДСН и исследовали с помощью электрофореза в ПАГ.
Электрофорез в ПАГ и вестерн-блот (ВБ) анализ. Полипептиды вирусных препаратов и субвирусных фракций фракционировали в ПАГ, содержащем ДСН, и из геля белки переносили на нитроцеллюлозную бумагу Protran 0,45 мк (Schleicher & Schull, Германия) полусухим методом [14]. Мембрану промывали в ФБ, инкубировали 2 ч в 3% обезжиренном молоке и далее в течение 2 ч в ФБ, содержащем 0,5% бычьего сывороточного альбумина (Sigma, США) и специфические антитела к вирусным белкам NP и М1. Затем мембрану обрабатывали видоспецифическим конъюгатом пероксидазы хрена (Dako, ) с последующей усиленной идентификацией позитивных компонентов с помощью усиленной хемилюминесценции (ECL) с суперсубстратом (Pierce, ) [14].
Метод вирусных центров в клеточной культуре. 2-Дневную культуру клеток МDCК-Н инкубировали в течение 1 ч при 37°С с разведениями вирусов, приготовленными на среде DMEM. Через 7-8 ч клеточные культуры фиксировали 4% пара-формальдегидом и последовательно инкубировали с вирусными анти-Н3-антителами и антивидовым конъюгатом пероксидазы хрена. Единичные инфицированные клетки (вирусные центры) окрашивали тетраметилбензидиновым субстратом "True Blue" (KPL). Центры инфекции (ЦОЕ - центробразующие единицы) подсчитывали на 1 мл исследуемой суспензии в световом микроскопе при 75-кратном увеличении [15].
Электронная микроскопия. Культуральную жидкость, содержащую вирус, осветляли при 8500 об/мин в течение 15 мин и наносили на медные электронномикроскопические сетки, на которых монтировали формвар-углеродные пленки. Перед нанесением материала пленки выдерживали в газовом разряде в вакуумной установке в течение 30 с для обеспечения гидрофильно-сти подложек. Подложки промывали 3 раза в ФБ и 1 раз деионизированной водой для удаления неадсорбированного на подложке материала и солей. Затем нанесенный материал контрастировали 1% раствором ФВК с pH 7 в течение 2 мин. Полученные вирусные препараты исследовали в электронном микроскопе JOEL-100S (Япония) при увеличении 20 000.
Результаты
Вирус A/Aichi/2/68 (H3N2) размножали в культуре клеток МDСК (линия Н) и анализировали форму его ге-магглютинина. Установили, что вирус, продуцируемый этими клетками, содержал только нерасщепленный ге-магглютинин НА0 (мол. масса 75 кД). В результате обработки вируса трипсином происходил переход НА0 в расщепленное состояние НА1+НА2 (мол. масса 50 и 25 кД соответственно) (рис. 1). При определении инфекционной активности полученных вирусных препаратов выявили более чем 1000-кратное усиление инфекцион-ности вируса после обработки трипсином (табл. 1).
Полученные образцы вируса с НА0 и НА1/НА2 испытывали на чувствительность к кислой среде. С этой целью вирус инкубировали в течение 30 мин в среде ДМЕМ, разведенной в 2 раза водой и содержащей 3 мМ Na-ацетатного буфера с рН 4,2. После инкубации для нормализации рН добавляли 1 М трис-HCl (рН 8,0) до конечной концентрации 100 мМ. В контрольных образцах к вирусу добавляли одномоментно 1 М трис-HCl и Na-ацетатный буфер до аналогичных конечных концентраций. Полученные образцы контрольного и обработанного кислым рН вируса исследовали: инфекционность методом образования инфекционных центров; структуру вируса с помощью электронной микроскопии; устойчивость связи внутреннего РНП с белковым матриксом М1 методом фракционирования субвирусных структур
42
Рис. 1. Профиль HA у вируса гриппа A/Aichi/2/68 в культуре клеток МОСК-H.
Клеточную культуру МЭСК-Н заражали вирусом A/Aichi/2/68 (H3N2) с множественностью инфекции 1 и инкубировали 15 ч в среде ДМЕМ без сыворотки. Культуральную жидкость делили на две части, одну из которых обрабатывали трипсином 10 мкг/мл в течение 1 ч (дор.2), а другую оставляли без обработки (дор. 1). Вирус осаждали через раствор глице-рола и подвергали электрофорезу в ПАГ с последующим ВБ-анализом. Белки НА0 и НА1/НА2 идентифицировали с помощью анти-Н3-антител и антивидового пероксидазного конъюгата методом усиленной хемилюминесценции.
после растворения наружной липидной мембраны неионным детергентом.
Инфекционность вирусных препаратов определяли методом инфекционных центров в клеточной культуре MDCK-H. Для того чтобы определить реальную и потенциально возможную инфекционность, каждый вирусный образец исследовали в двух вариантах: без и с обработкой препарата трипсином соответственно. Предобработка трипсином позволяла установить потенциальную инфекционность препарата после ее активации в результате расщепления НА0 на НА1/НА2. В табл. 2 приведены результаты типичного эксперимента. Вирус, содержащий НА0, имел низкий уровень инфекционно-сти, который возрастал более чем в 1000 раз после обработки трипсином (препарат №1 в табл. 1). Обработка такого вируса кислым рН не изменяла его инфекционных свойств (препарат №2 в табл. 1). Вполне очевидно, что вирус, содержащий расщепленный НА1/НА2, имел сходный высокий уровень реальной и потенциальной
Таблица 1
Инфекционная активность вируса A/Aichi/2/68 после обработки трипсином и кислым рН
Вирус* № препарата Обработка кислым рН Повторная обработка трипсином Инфекционный титр, ЦОЕ/мл
Неактиви- 1 - - 0,25 • 104
рованный + 0,73-107
вирус с
НА0 2 + - 0,11104
+ + 0,56107
Активи- 3 - - 0,43 • 107
рованный + 0,78-107
вирус с
НА1+НА2 4 + - 0,21-104
+ + 0,11104
Примечание. * - вирус гриппа A/Aichi/2/68 выращивали в культуре MDCK-Н (препарат № 1, 2), обрабатывали трипсином (препарат № 3, 4), экспонировали в кислой среде с рН 4,2 и затем повторно обрабытвали трипсином, как описано в «Материалах и методах». Инфекционую активность полученных образцов культуральной жидкости определяли методом инфекционных центров в монослое MDCK-Н в ЦОЕ на 1 мл исходной культуральной жидкости.
инфекционности (препарат №3 в табл. 1). Однако после обработки такого вируса кислым рН отметили заметное снижение его инфекционных свойств практически до эндогенного уровня (препарат №4 в табл. 1). Важно указать, что при определении гемагглютинирующей и ней-раминидазной активности вируса до и после обработки кислым рН наблюдали отсутствие изменений обеих активностей в результате кратковременного действия кислого рН (не показано). Полученные данные свидетельствуют, что кислый рН вызывает изменение внутренней структуры вируса и передача такого воздействия внутрь вируса специфически зависит от расщепленной формы гемагглютинина НА1/НА2.
Для исследования структуры вирионов применили метод электронной микроскопии с контрастированием ФВК в нейтральной среде. В препарате нативного вируса с НА0 обнаруживали типичные вирусные частицы преимущественно округлой формы диаметром около 90 нм, на поверхности которых выявляли характерные шипы размером около 10 ± 2,1 нм, представляющие собой структуры из HA и NA (см. табл. 2, рис. 2, а). При инкубации суспензии нативного вируса гриппа с НА0 при кислых pH не отмечали заметных изменений размера и формы частиц и также наблюдали округлые частицы с шипами по периферии липидной оболочки. Лишь на некоторых частицах отметили слабое локальное разрушение шипов оболочки (рис. 2, б).
При инкубации нативного вируса гриппа с трипсином мы наблюдали преимущественно округлые вирионы обычного размера с хорошо выявляемыми шипами на поверхности частиц (см. табл. 2, рис. 2, в). На рис. 2, г—ж представлены вирионы, активированные трипсином и дополнтельно обработанные кислым рН. На этих микрофотографиях выявляли уменьшение количества шипов на поверхности частиц; на некоторых вирионах обнаружили зоны с полным отсутствием шипов (частичное отсутствие шипов показано толстой стрелкой на рис. 2, г). В вирионах с частичным отсутствием шипов определяли структуры грибовидных шипов, типичных для NA, в то время как гемагглютининовые столбикообразные шипы различить не удавалось. Вполне вероятно, что шипы HA теряли свою структуру в результате кислотной трансформации, тогда как нейраминидазные шипы сохраняли свою структуру.
В активированных вирионах с НА1/НА2, экспонированных в кислой среде, удавалось различить внутреннюю структуру в результате протекания ФВК внутрь вирио-на (см. рис. 2, г—ж). Центральная зона таких вирионов
Таблица 2
Размер частиц вируса гриппа до и после экспозиции в кислой
среде
Препарат вируса
Экспозиция в кислой среде
Диаметр вирионов, нм
Неактивирован- - 91,7 ± 16,8
ный вирус с НА0
+
88,3 ± 14,5
Активированный - 79,8 ± 17,9
вирус с НА1/НА2
+ 84,6 ± 19,5
Примечание. * - вирус A/Aichi/2/68 (H3N2) выращивали в культуре клеток МЭСК-Н, обрабатывали трипсином и далее экспонировали в кислой среде с рН 4,2, как описано в «Материалах и методах». Обработанные образцы культуральной жидкости исследовали в электронном микроскопе без предварительной очистки ультрацентрифугированием. Приведены средние величины диаметра вирусных частиц без учета поверхностных шипов и стандартное отклонение значений.
43
Рис. 2. Электронная микроскопия вируса гриппа А после обработки кислым рН.
Образцы культуральной жидкости, полученной в MDCK-Н, осветляли для удаления клеточных обломков, делили на две части, одну из которых обрабатывали трипсином для расщепления НА0^НА1+НА2. Затем образцы б и г-ж обрабатывали при рН 4,2 в течение 30 мин и нейтрализовали до рН 8,0. Препарат а - интактный вирус с НА0; б - интактный вирус с НА0, обработанный рН 4,2; в - активированный вирус с НА1/НА2; г-ж - активированный вирус с НА1/НА2, обработанный рН 4,2 (г и д - при обычном увеличении, е и ж - при высоком).
44
представляла собой гетерогенное по плотности поле, при этом электронно-плотные зоны занимали практически большую часть вириона. На некоторых вирионах можно различать протяженные структуры, напоминающие по размеру и форме вирусный нуклеопротеид. На рис. 2, г в поле зрения можно видеть свободнолежащие спиралевидные сегменты РНП, вышедшие из разрушенных клеток, которые по форме напоминали структуры внутри вирио-на (показано тонкой стрелкой на рис. 2, г). На рис. 2, е, ж представлены два вириона вируса гриппа, в которых лучше визуализирована внутренняя структура вириона и его РНП. Внутри вириона можно различать светлую зону (мембрану), отделяющую сердцевину вириона от гемаг-глютининовой структуры оболочки, которая обычно трактуется как матрикс М1. Можно отметить ее разрушение на протяженных участках внутри вириона (показано длинными стрелками на рис. 2, е, ж). Кроме того, на периферии сердцевины вириона удавалось выявить протяженные спиральной формы образования, граничащие с липидной мембраной, которые можно идентифицировать как РНП вируса (показано толстой стрелкой на рис. 2, е). Такая периферическая локализация РНП являлась характерным признаком внутренней перестройки вириона после экспозиции в кислой среде, что выявляли ранее и другие авторы [5]. В вирионах после обработки кислой средой наблюдали также разрыхление и деструкцию матрикса М1, что показано длинной стрелкой на рис. 2, е, ж.
Таким образом, можно заключить, что важной особенностью вирусных частиц с НА0 и обработанных и необработанных кислым рН (препараты а и б соответственно) и с НА1/НА2, необработанных кислым рН (препарат 2в), состояла в недоступности их внутренней структуры для контрастирующего агента, в результате чего в препарате доминировали светлые неконтрастированные частицы. Напротив, в образцах вируса с НА1/НА2 после кислотной обработки доминировали темные частицы с контрастированной сердцевиной (препарата г—ж). Последнее наблюдение указывало на то, что обработка кислым рН вируса с расщепленным НА1/НА2 изменяла проницаемость его липидной мембраны и делала его проницаемым для ФВК и кислой среды. Эти данные говорят о том, что сочетание двух факторов, а именно кислой среды и расщепленной формы HA, приводило к структурной перестройке вируса, в результате которой вирионы становились проницаемыми для кислой среды и теряли способность заражать клетки-мишени.
Возникает вопрос, изменялась ли внутренняя структура вируса после его обработки кислой средой. Для ответа на него применяли описанный нами раннее метод фракционирования внутренних субвирусных структур после разрушения его наружной липидной мембраны неионным детергентом [12, 13]. При этой процедуре растворение липидной мембраны проводили в ходе седиментации вируса через 25% глицерол, содержащий детергент NP-40, приводящей к осаждению субвирусных структур РНП, которые связаны с матриксом М1. Соотношение белка М1 и NP (главного компонента РНП) в полученных фракциях позволяло судить о связи матрикса М1 и РНП в вирионе. На рис. 3 показаны результаты типичного эксперимента. Как видно, при фракционировании вируса с НА0, необработанного и обработанного кислой средой, выделялись субвирусные структуры с содержанием белка М1, составляющим около 10% такового в цельном вирусе. После инкубации в кислой среде вируса с НА1/НА2 содержание Ml в субвирусной фракции повышалось до 80-90% от такового в составе интактного вируса. Эти результаты указывали на то, что обработка кислой средой вируса с расщепленным НА1/НА2 усиливала связь белкового матрикса Ml
с вирионным РНП и делала ее более устойчивой к сочетанному воздействию неионного детергента и ионной силы раствора хлористого натрия.
Обсуждение
В работе установлено, что вирус гриппа A/Aichi/2/68 c нерасщепленным НА0 и вирус с расщепленным гемаг-глютинином НА1/НА2 имеют типичную округлую форму диаметром около 100 нм, но различаются по чувствительности к кислой среде. Неинфекционные вирионы с НА0 устойчивы к кислому рН 4,2-4,5, не изменяют свою внутреннюю структуру и сохраняют инфекционные свойства после экспозиции с кислой средой. Инфекционные ви-рионы с НА1/НА2 чувствительны к кислому рН и после непродолжительного контакта с кислой средой изменяют свою внутреннюю структуру в результате проницаемости наружной липидной мембраны и воздействия кислой среды на внутренние компоненты вирусной частицы. В результате структурных перестроек под влиянием кислого рН вирус терял способность заражать клетки-мишени. Обнаруженная структурная кислотная перестройка вириона, в котором HA имеет функциональную НА1/НА2 форму, вероятно, связана с внутривирионной конформационной трансформацией матриксного белка М1 и РНП, которая приводит к усилению их связи и затруднению (или даже полной невозможности) процесса раздевания вирионов при внедрении в клетки-мишени.
С высказанным предположением о перестройке вируса согласуются прежние наблюдения о том, что белок М1, имеющий выраженные гидрофобные свойства, имеет повышенную чувствительноть к кислой среде и приобретает хорошую растворимость в водных растворах с кислым рН в диапазоне рН 4-5, заметно изменяя при этом свою конформацию [6, 8]. Переход матрикса М1 из подмембранного слоя с упорядочной спиральной организацией в аморфное внутривирионное распределение наблюдали ранее с помощью криоэлектронной микроскопии в филамен-тозных вирусных частицах вируса A/Udorn/72 (H3N2) при бработке кислым рН 4,9 [4]. В другой недавней работе по криоэлектронной микроскопии, посвященной изучению влияния кислого рН на инфекционный вирус гриппа А, авторы также пришли к выводу о перераспределении матрикса М1 из мембранно-связанного в ассоциированное с РНП состояние в вирионе после кислотной обработки [5].
Рис. 3. Фракционирование вируса гриппа А в глицероле с неионным детергентом.
Образцы вируса A/Aichi/2/68 (H3N2) необработанные (1, 2) и обработанные (3, 4) трипсином экспонировали с рН 4,2 в течение 30 мин (2, 4) и нейтрализовали рН до 8,0. Полученные образцы культуральной жидкости наслаивали на слой глицерола, содержащего 0,2% неионного детергента NP-40 и 2,5 мМ ацетатного буфера с рН 4,2, и центрифугировали при 27 500 об/мин в течение 3 ч для осаждения субвирусных структур. Осадки (фракция субвирусных частиц) подвергали электрофорезу в ПАГ с последующим ВБ-анализом. Для идентификации вирусных белков использовали анти-NP- и анти-М1-антитела и пероксидазный антивидовой конъюгат по методу усиленной хемилюминесценции. Дорожка 5 - препарат исходного вируса.
45
Эти наблюдения хорошо согласуются с нашими данными об избирательности действия кислого рН на инфекционный вирус гриппа, содержащий расщепленный НА1/НА2, и перестройке его внутренней структуры и потери инфек-ционности в отличие от неактивированного вируса с НА0, который проявлял устойчивость к кислому рН и сохранял свои нативные свойства после кислотной экспозиции.
Хорошо известно, что расщепление белка НА0^- НА1/ НА2 приводит к высвобождению КН2-терминального фузионного пептида в субъединице НА2, которое активирует его функцию по слиянию липидных мембран, присущую HA вирусов гриппа [16]. Наши данные по электронной микроскопии показали, что при обработке кислым рН у вируса с расщепленным НА1/НА2 возрастала проницаемость липидной мембраны и, напротив, отсутствовал такой эффект у вируса с нерасщепленным НА0. Эти наблюдения, по всей вероятности, объяснялись тем, что расщепление НА0 ^ИА1/НА2 приводило к перестройке липопротеидного комплекса, в результате которой ионные каналы, сформированные белком М2, приобретали способность активироваться кислым рН и транспортировать протоны Н+ внутрь вирусных частиц и закислять его внутренний объем. Таким образом, на основании полученных данных можно заключить, что расщепление поверхностного гемагглютинина НА0 ^НА1/НА2 имеет двоякий эффект, который складывается не только из активации его собственной функции липидного слияния, но и его опосредованного влияния на структуру других компонентов липопротеидной мембраны, в частности ионных каналов М2, способствуя их активации в кислой среде.
Полученные данные о влиянии НА1/НА2 на проте-каемость протонов через вирионную мембрану указывают на возможную кооперацию гемагглютинина НА1/ НА2 и белка ионных каналов М2 в ходе рецепторного эндоцитоза вируса в клетке-мишени [7]. Так, при прохождении через клеточные эндосомы вирус оказывается в кислой среде с рН в диапазоне 4,5—5,5, инициирующей многовекторное действие НА1/НА по слиянию липидных мембран вируса и клетки и содействию канальной активности М2 и солюбилизации М1, кооперативный эффект которых ведет к физиологичному раздеванию вируса с выходом свободного РНП и началу вирусных синтезов. При воздействии кислого рН in vitro на вирус, содержащий расщепленный НА1/НА2, происходит кислотная активация компонентов липопротеидного комплекса вируса без его контакта и слияния с клеточными мембранами. Такое разъединение процессов и асинхронная активация вирусных компонентов приводят к аномальным взаимодействиям внутри вирусной частицы и нарушению запрограммированной синхронизации перечисленных процессов. Возникшая асинхронная перестройка в вирусе при последующем заражении клеток препятствует воспроизведению его полноценного внутриклеточного раздевания.
Дифференцированное действие кислой среды на инфекционный вирус с НА1/НА2 и неактивированный с НА0 позволяет объяснить раннее наблюдение о различной стабильности вирусов гриппа А в кислой среде в зависимости от расщепления их НА [9]. Наши данные показывают, что присутствие НА0 обеспечивает большую стабильность неинфекционных вирионов в среде с кислым рН из-за его более ригидной и устойчивой к протеканию ионов структуры липопротеидного комплекса по сравнению с более лабильной и протекаемой мембраной у инфекционных вирионов с НА1/НА2. Быстрая инактивация инфекционных вирионов и более продолжительное сохранение неинфекционных вирионов могут происходить у вирусов гриппа водоплавающих птиц в открытых водоемах, вода которых имеет обычно кис-
лые значения рН [3]. Другой физиологической кислой средой, в которой оказывается вирус гриппа, служит полость желудка, куда попадает основная масса вируса из респираторного тракта с проглатываемым бронхиальным секретом со слюной у больных гриппом людей. Следовательно, в желудке будет происходить инактивация инфекционного вируса, тогда как эту полость может успешно проходить, сохраняя свой инфекционный потенциал, неинфекционный вирус с НА0, который может активироваться и становиться инфекционным уже в кишечнике под действием кишечных трипсино-подобных протеаз, которые, как известно, присутствуют в кишечном эпителии [2, 14]. Интересно, что по нашим оценкам, выполненным in vivo, популяция вируса гриппа H1N1 и H3N2, продуцируемая в респираторном тракте инфицированных мышей, лишь на 30-60 и 40-70% состоит из инфекционных вирионов с НА1/НА2 и неактивированных вирионов с НА0 соответственно (неопубликованные данные). Сходный смешанный состав популяции из инфекционного и неактивированного вируса гриппа в респираторном тракте и его прохождение в кишечный тракт можно ожидать у людей, больных гриппом.
Работа выполнена при финансовой поддержке по грантам РФФИ и программы 293 Научного немецкого общества (DFG).
ЛИТЕРАТУРА (REFERENCES)
1. Baudin F., Petit I., Weissenhorn W., Ruigrok R.W. In vitro dissection of the membrane and RNP binding activities of influenza virus Ml protein. Virology. 2001; 281(1): 102-8.
2. Bertram S., Glowacka I., Blazejewska P. et al. TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. J. Virol. 2010; 84(19): 10016-25.
3. Brown J.D., Goekjian G., Poulson R., Valeika S., Stallknecht D.E. Avian influenza virus in water: infectivity is dependent on pH, salinity and temperature. Vet. Microbiol. 2009; 36(1-2): 20-6.
4. Calder L.J., Wasilewski S., Berriman J.A., Rosenthal P.B. Structural organization of a filamentous influenza A virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010; 107(23). 10685-90.
5. Fontana J., Cardone G., Heymann J.B., Winkler D.C., Steven A.C. Structural changes in Influenza virus at low pH characterized by cryo-electron tomography. J. Virol. 2012; 86(6): 2919-29.
6. Harris A., Forouhar F., Qiu S., Sha B., Luo M. The crystal structure of theinfluenza matrix protein M1 at neutral pH: M1-M1 protein interfaces can rotate inthe oligomeric structures of M1. Virology. 2001; 289(1): 34-44.
7. Luo M. Influenza virus entry. Adv. Exp. Med. Biol. 2012; 726: 201-21.
8. McHardy A.C., Adams B. The role of genomics in tracking the evolution of influenza A virus. PLoS Pathog. 2009; 5(10): e1000566.
9. Scholtissek C. Stability of infectious influenza A viruses to treatment at low pH and heating. Arch. Virol. 1985; 85(1-2): 1-11.
10. Sishkov A.V., Goldanskii V.I., Baratova L.A., Fedorova N.V. et al. The in situ spatial arrangement of the influenza A virus matrix protein M1 assessed by tritium bombardment. Proc. Natl. Acad/ Sci. USA. 1999; 96(14): 7827-30.
11. Zhang K., Wang Z., Liu X. et al. Dissection of influenza A virus M1 protein: pH-dependent oligomerization of N-terminal domain and dimerization of C-terminal domain. PLoS One. 2012; 7(5): e37786.
12. Zhirnov O.P. Solubilization of matrix protein M1/M from virions occurs at different pH for orthomyxo- and paramyxoviruses. Virology. 1990; 176(1): 274-9.
13. Zhirnov O.P. Isolation of matrix protein M1 from influenza viruses by acid-dependent extraction with nonionic detergent. Virology. 1992; 186(1): 324-30.
14. Zhirnov O.P., Klenk H.D. Human influenza viruses are proteolyti-cally activated and do not induce apoptosis in CACO-2 cells. Virology.. 2003; 313: 198-212.
15. Zhirnov O.P., Matrosovich T.Y., Matrosovich M.N., Klenk H.D. Aprotinin, a protease inhibitor, suppresses proteolytic activation of pandemic H1N1v influenza virus. Antivir. Chem. Chemother. 2011; 21: 169-74.
16. Zhirnov O.P., Klenk H.D., Wright P.F. Aprotinin and similar protease inhibitors as drugs against influenza. Antivir. Res. 2011; 92(1): 27-36.
Поступила 24.01.13
46
