CC BY
14
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
Полученные данные свидетельствуют об интенсификации макрофагальной реакции в коже при субдермаль-ном введении ВКМ в форме порошка.
ПЕРСПЕКТИВЫ РЕКОМБИНАНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ИММУНОПРОФИЛАКТИКИ ИНФЕКЦИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ PSEUDOMONAS AERUGINOSA
Калошин А.А., Солдатенкова А.В., Зимина Е.М., Михайлова Н.А.
ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова», Москва, Россия
Одним из наиболее серьезных возбудителей оппортунистических инфекций является синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa). Этот микроорганизм характеризуется высокой способностью к быстрому развитию резистентности к антибиотикам, что делает неэффективными общепринятые методы лечения. Поэтому актуальным является разработка иммунобиологических препаратов для борьбы с синегнойными инфекциями. Создание вакцин на основе протективных антигенов возбудителя пока не увенчалось положительными результатами из-за технологических трудностей выделения целевых антигенов, что преодолимо с использованием генно-инженерных методов.
Ранее показано, что рекомбинантный белок F наружной мембраны (OprF) P. aeruginosa и делеционная форма экзотоксина А (анатоксин) P. aeruginosa способствовали защите иммунизированных мышей от экспериментальной внутрибрюшинной синегнойной инфекции. При этом комплексное введение обоих белков приводило к увеличению защитных свойств. Поэтому представляло интерес получение слитного рекомбинантного белка, включающего аминокислотные последовательности OprF и анатоксина. С этой целью ген, кодирующий белок OprF, встраивали в рекомбинантную конструкцию на базе плазмиды рЕТ28Ь+, несущей ген анатоксина. В результате экспрессии в клетках E. coli штамма BL21(DE3) созданной конструкции был синтезирован слитый рекомби-нантный белок OprF-анатоксин, который хроматогра-фически очищали на никель-активированном сорбенте. В иммуноблоттинге этот белок специфично реагировал с иммунными сыворотками к отдельным рекомбинант-ным белкам (OprF и анатоксину). Далее с целью увеличения спектра антигенных детерминант в плазмидную конструкцию был встроен ген еще одного мембранного белка P. aeruginosa (OprI). В результате получен слитый рекомбинантный белок OprF-анатоксин-Орг! с молекулярной массой 107,2 кДа, специфично реагирующий в имму-ноблоттинге с сыворотками к рекомбинантным белкам OprF, OprI и анатоксину. Содержание целевого рекомби-нантного продукта в очищенном препарате, составляло 96,4%, что подтверждено капиллярным электрофорезом.
Оценку защитных свойств полученных слитых реком-бинантных белков проводили при двукратном, с двухнедельным интервалом, внутрибрюшинном введении мышам в дозах 50 и 100 мкг на животное. В качестве препарата сравнения использовали комплекс из отдельных рекомбинантных белков: OprF и анатоксина.
Через две недели после курса иммунизации мышей заражали живой вирулентной культурой P. aeruginosa штамма РА103 и далее в течение недели проводили подсчет погибших особей. Для животных, иммунизированных слитым белком OprF-анатоксин в дозе 50 мкг, ЛД50 составила 40,61 млн м.к. (млн микробных клеток), а в дозе 100 мкг —
32,99 млн м.к. В группах животных, иммунизированных слитым белком Ор^-анатоксин-Орг1 в дозе 50 мкг, ЛД50 составила 53,59 млн м.к., а в дозе 100 мкг — 35,36 млн м.к. Для мышей, иммунизированных комплексом двух ре-комбинантных белков, значение ЛД50 соответствовало 46,65 млн м.к., а для контрольных животных ЛД50 соответствовала 15,39 млн м.к.
Таким образом, полученные результаты открывают перспективы для создания иммунобиологических препаратов на основе рекомбинантных белков. В дальнейшем для выбора наиболее эффективной вакцины целесообразно более глубокое изучение влияния рекомбинант-ных препаратов на индукцию специфического иммунного ответа.
КРАТКОСРОЧНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МОНОНУКЛЕАРНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ С РЕЛЬЕФНЫМ КАЛЬЦИЙ-ФОСФАТНЫМ ВЛИЯНИЕМ ОПСОНИЗАЦИИ НА ФАГОЦИТОЗ МИКРОБАКТЕРИЙ МАКРОФАГАМИ У МЫШЕЙ С РАЗНОЙ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬЮ К ТУБЕРКУЛЕЗУ
Капина М.А., Рубакова Э.И., Логунова Н.Н., Майоров К.Б., Апт А.С.
ФГБНУ «Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза», Москва, Россия
Опсонизация — это биологический процесс прикрепления опсонинов, которыми являются белки плазмы крови или их фрагменты, к поверхности бактерий или вирусов, что обусловливает более легкое распознавание и захват их фагоцитами. К опсонинам, в частности, относятся молекулы антител (преимущественно, IgG и IgM), фрагменты компонентов комплемента, С-реактивный белок. Важность опсонизации при фагоцитозе микобак-терий была показана в работах с антителами к арабино-маннану: инкубация микобактерий с антителами перед заражением животных снижала тяжесть течения инфекции (Hamasur B. et.al., 2004).
В нашей работе мы исследовали влияния опсонинов крови мышей генетически чувствительных и резистентных к туберкулезу (ТБ) линий на способность макрофагов фагоцитировать M. tuberculosis H37Rv. При отработке методов сыворотку крови здоровых и зараженных микобак-териями H37Rv мышей резистентной линии B6 в разных процентных соотношениях (от 20 до 1,25 %) добавляли к микобактериям и инкубировали в течение 30 минут при 4 °С. После инкубации микобактерии добавляли к культуре выделенных из брюшной полости макрофагов в соотношении 1:5 (одна бактерия на 5 макрофагов) и оценивали фагоцитарную активность под микроскопом по окраске аурамином микобактерий, захваченных макрофагами. Результат оценивали по подсчету фагоцитарного числа (процент инфицированных клеток) и фагоцитарного индекса (среднее число микобактерий на инфицированный макрофаг). Наивысшие значения были получены при содержании сыворотки 1,5 — 5%, как от здоровых, так и от инфицированных мышей. В последующих экспериментах для опсонизации использовали 3-процентное содержание сыворотки. Помимо этого, мы оценили влияние опсонизации на жизнеспособность фагоцитированных бактерий по включению радиоактивного ура-цила микобактериями. При опсонизации 3-процентной сывороткой включение урацила было самым низким, что подтверждает благоприятное значение опсонизации для
