CC BY
104
Перспективы
противофиброзной терапии
хронических заболеваний печени
УДК 616.36+616.36-002+615.2.244
Ключевые эффекторы в патогенезе фиброза - звездчатые клетки печени (ЗКП), локализованные в субэндотелиальном пространстве Диссе (рис. 1). В норме эти клетки находятся в состоянии покоя, однако ряд патогенных факторов (вирусная инфекция, холестаз, воспалительные процессы в печени, токсины, механический стресс и др.) превращают их в активную форму - миофибро-бласты. Механизм активации ЗКП сложен и включает различные изменения клеточного метаболизма. Так, например, паренхи-мальные клетки печени и клетки Купфера способствуют активации ЗКП, индуцируя окислительный стресс и усиливая наработку различных цитокинов, в том числе фактора роста опухолей - бета (ТОР-в), фактора роста образуемого тромбоцитами (РБОР) эндоте-лина-1 [3]. Будучи регуляторами передачи внутриклеточных сигналов, эти цитокины играют важную роль в активации ЗКП. Следует отметить, что существуют и антифиброгенные цитокины, например интерлейкин-10, являющийся антагонистом основного провоспалительного цитокина ТОТа и угнетающий воспалительный процесс печени.
Активированные ЗКП проли-ферируют, нарабатывая компоненты внеклеточного матрикса, главным образом интерстициаль-ный коллаген типа I и II, коллаген типа IV базальной мембраны, а также фибронектин, ламинин и протеогликаны. Активная форма ЗКП, миофибробласты, а также макрофаги и клетки Купфера секретируют ферменты, деградирующие внеклеточный матрикс,
Успехи, достигнутые за последние 25 лет в изучении клеточных и молекулярных механизмов фиброгенеза в печени, открывают новые возможности для лечения фиброза и цирроза данного органа. Понимание тонких химических и молекулярно-биологических механизмов развития фиброза и его деградации позволяют применять целенаправленное фармакологическое воздействие на отдельные звенья патогенетической цепи этого заболевания. Настоящая публикация является фрагментом работы «Фундаментальные подходы к фармакологической коррекции патологии печени», удостоенной Международной премии Хорезми (Khwarizmi International Award, Тегеран, 2013 г.).
о
X X
5
X
Фиброз и его последствия (цирроз, портальная гипертензия, нарушение паренхимальной функции) развиваются в результате хронических заболеваний печени, в частности вирусных гепатитов, алкогольных и неалкогольных стеатогепатитов, гемохроматоза, иммунных поражений. При прогрессировании фиброза развивается цирроз, завершающая стадия этого процесса, которая расценивается как предраковое состояние, способное трансформироваться в гепатокарциному.
Фиброз и цирроз печени -одна из важнейших проблем здравоохранения в мировом масштабе. По данным ВОЗ, начиная с 2000 г. смертность от цирроза в Европе составляла 1,8% от всех случаев и в абсолютных цифрах достигала 170 тыс. смертей в год [1]. В юго-восточных регионах Европы (Венгрия, Молдавия, Словакия, Словения и Румыния), а также в северо-восточной ее части (Прибалтика, Польша, Чехия) в последнее десятилетие наблю-
дается невиданный ранее всплеск смертности от данного недуга, достигающий в Венгрии уровня 103 случаев на 100 тыс. населения. Такая же ситуация складывается и в западноевропейских странах (Великобритания, Ирландия). По данным Минздрава Беларуси, в нашей стране к 2012 г. смертность от болезней органов пищеварения увеличилась и составила 28,2 случая на 100 тыс. населения, при этом от заболеваний печени, подавляющую часть которых составляют циррозы, умерли примерно 17 чел. на 100 тыс. населения.
Фиброз развивается вследствие избыточного накопления в печени внеклеточного матрикса, важнейшим компонентом которого является коллаген, образующий его механическую основу и подверженный протеолитическо-му разрушению специфическими матриксными металпротеиназа-ми в процессе фибролиза. При циррозе печени относительное содержание коллагена может увеличиваться в десятки раз [2].
Вячеслав Буко,
заведующий
отделом
биохимической
фармакологии
Института биохимии
биологически
активных
соединений
НАН Беларуси,
доктор
биологических наук, профессор
Оксана Лукивская,
ведущий научный
сотрудник отдела
биохимической
фармакологии
Института биохимии
биологически
активных
соединений
НАН Беларуси,
кандидат
биологических наук
Елена
Белоновская,
научный
сотрудник отдела биохимической фармакологии Института биохимии биологически активных соединений НАН Беларуси
матриксные металлопротеиназы (ММР). При острых поражениях печени вирусной и токсической природы фиброгенез сбалансирован процессом фибролиза, то есть удалением избытка матрикса посредством ММР. При повторяющихся патогенных воздействиях фиброз превалирует вследствие подавления секреции и активности ММР тканевыми ингибиторами ММР (TIMP).
В качестве одного из существенных факторов фиброгенеза в последнее время определен ангио-генез, то есть образование новых кровеносных сосудов в печени. Ранее было известно, что ангио-генез предшествует развитию опухоли и появлению метастазов, а именно: перед развитием опухолевого очага вначале развивается сосудистая сеть, обеспечивающая его васкуляризацию. В последующем появились данные об усиленном ангиогенезе, предшествующем развитию цирротиче-ских узлов в печени [4]. Доказана его взаимосвязь с фиброгенезом и продемонстрирован противо-фиброзный эффект соединений, обладающих антиангиогенными свойствами. В процессе ангиоге-неза ключевую роль играет сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), стимулирующий процесс роста сосудов и нарабатываемый активированными ЗКП. Поскольку коллаген, ММР, TIMP и VEGF секретируются главным образом активированными ЗКП, миофибробластами и портальными фибробластами, эти клетки являются наиболее предпочтительной мишенью для противофиброзной терапии.
Последние исследования нашей лаборатории позволили обнаружить новый регуляторный фактор для фиброза печени - ген трансформации опухолей гипофиза (pituitary tumor transforming gene; PTTG) [5]. Опыт проводили на нокаутных мышах с отсутствием PTTG (PTTG -/-) и контрольных мышах (PTTG +/+). Фиброз печени у мышей вызывали иньекциями ге-патотоксина тиоацетамида (ТАА). Через 3 месяца введения ТАА у животных PTTG +/+, в отличие
Рис. 1. Современные представления о процессах фиброгенеза и фибролиза в печени
от группы РТТО -/-, печень имела бугристую поверхность с образованием небольших узелков (рис. 2). Гистологическое исследование показало присутствие тяжей соединительной ткани различной толщины и протяженности, отходящих от портальных трактов вглубь паренхимы, и узловой перестройки в обеих группах мышей, получавших ТАА, однако признаки этой патологии были значительно более выраженными у РТТО +/+ животных (рис. 2). Мор-фометрическая оценка отложения экстрацеллюлярного матрикса в паренхиме печени указывает на значительное увеличение площади соединительной ткани на срезах печени крыс, получавших
ТАА: в 3,4 раза для РТТО +/+ и 2,6 раза для РТТО -/- (рис. 3). Содержание оксипролина печени, используемое в качестве так называемого «золотого стандарта» для оценки фиброза, достоверно повышалось у РТТО +/+, получавших ТАА, тогда как в аналогичной группе РТТО -/мышей этот показатель существенно не отличался от контроля. Сывороточное содержание ТОТа, а также экспрессия мРНК факторов, определяющих воспаление, фиброгенез и ангиогенез (ТОТа, ТОБр и УБОБ), были значительно ниже у мышей РТТО -/-, получавших ТАА, по сравнению с животными соответствующей РТТО +/+ группы (рис. 3). Таким образом, в отсутствии РТТО у мышей разви-
Рис. 2. Макроморфологическая и гистохимическая характеристика печени мышей с тиоацетамидным фиброзом. Бугристая поверхность и сглаженные края печени у PTTG +/+ мышей (а) и единичные фиброзные узелки на поверхности печени у PTTG -/- животных (б). Окраска соединительной ткани методом Азан-Маллори значительно более выражена на срезах печени у PTTG +/+ мышей (в) по сравнению с PTTG -/- животными (г)
о
X X
5
X
ï 3
1 2
* **
**
PTTG+/+ PTTG+/+ &TAA
PTTG-/-
PTTG-/-&TAA
1
z 0,8
s
1 0,6 £
É 0,4
CÛ
о
Е5
0,2 0
Э
100
э
** I
PTTG+/+
PTTG-/-
**
z 80
и 60
40
20
PTTG-/-&TAA
**
X
PTTG+/+ PTTG+/+ &TAA
PTTG-/-
PTTG-/-&TAA
PTTG+/+ PTTG+/+ &TAA
PTTG-/-
PTTG-/-&TAA
А. Площадь соединительной ткани; Б. Экспрессия мРНК Т№а; В. Экспрессия мРНК МР; Г. Экспрессия мРНК УЕСР * Р < 0,05 по сравнению с соответствующей группой, не получавшей ТАА ** Р < 0,05 по сравнению с группой РТТС +/+, получавшей ТАА
Рис. 3. Показатели компьютеризированного морфо-метрического измерения площади соединительной ткани
(в % к общей площади среза) и экспрессии мРНК факторов (в условных единицах), определяющих развитие фиброза в печени РТТС +/+ и РТТС -/- мышей, получавших тиоацетамид (ТАА)
тие фиброза печени значительно тормозится. Эти результаты свидетельствуют о важной роли PTTG в развитии фиброза/цирроза печени посредством его регуляторного влияния на процессы фиброге-неза, ангиогенеза и воспаления. Несомненно, что данный ген является важной мишенью для про-тивофиброзной терапии, а поиск ингибиторов PTTG будет одним из перспективных направлений для разработки антифибротиков нового поколения.
Прежде чем приступить к описанию потенциальных терапевтических подходов к фиброзу печени, следует остановиться на проблеме обратимости этого процесса. Длительное время существовало мнение, что фиброз и цирроз печени необратимы. Однако в последнее десятилетие различными научными центрами, в том числе и нашей лабораторией, получены неопровержимые доказательства противоположного [6]. Обратимость фиброза печени была продемонстрирована на ряде экспериментальных моделей, а также парных биопсиях у пациентов с поражениями печени. В исследовании, анализирующем
результаты рандомизированных контролируемых опытов у пациентов с хроническим гепатитом С, были приведены достоверные результаты обратимости фиброза под влиянием противовирусной терапии интерфероном и рибави-рином [7]. Механизм деградации экстрацеллюлярного матрикса при фиброзном поражении печени связывают как с уровнями матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов, главным образом TIMP-1, так и с апоптозом ЗКП.
Базируясь на современных представлениях о процессах фиброгенеза, фибролиза и анги-огенеза, можно сформулировать основные тенденции современной терапии фиброза печени. Следует отметить, что предпочтение отдается комбинационной терапии, где используется 2-3 агента, воздействующие на различные мишени-звенья патогенетической цепи, обусловливающей развитие фиброза и его деградацию. Наиболее перспективные препараты могут сочетать в себе свойства, одновременно влияя на несколько различных мишеней, определяющих фиброгенез/фибролиз. Основные принципы противофиброзной терапии представлены в табл. 1.
Нами проведен ряд исследований по доклинической оценке активности некоторых из приведенных в табл. 2 наиболее перспективных противофиброз-ных препаратов, в частности нор-урсодезоксихолевой кислоты, микофенольной кислоты, пентоксифиллина и галофугино-на, а также некоторых статинов (симвастатин и флувастатин).
Микофенольная кислота угнетала уровень транскрипции проколлагена аЩ) в линии звездчатых клеток печени СР8С-2О, линии звездчатых клеток печени СР8С-2О и первичной культуре активированных ЗКП/миофибробла-стов. Экспрессия ТОР^1, основного профиброгенного цитокина, угнеталась микофенольной кислотой в обоих типах клеток в 2 раза.
Галофугинон угнетал уровень транскрипции профиброгенного проколлагена аЩ) и металло-протеиназы ММП-2 в 2 и 3 раза соответственно. Экспрессия мРНК проколлагена а1(Ш) угнеталась подобно проколлагену аЩ). В умеренно активированных СР8С-2О клетках 2Ч0-7 М галофу-гинона резко активируют ММП-3 (общий проактиватор металло-протеиназ) и ММП-13 (основная кишечная коллагеназа), причем степень активации колеблется между 10- и 200-кратностью. Галофугинон жестко угнетал синтез ДНК в обеих линиях клеток и в первичной культуре ЗКП/МФ дозозависимым образом с максимумом угнетения при концентрации 2^10-7 М. Кроме того, галофугинон при субмикро-молярных концентрациях (10-7 М) полностью блокировал миграцию ЗКП/МФ, индуцируемую фетальной телячьей сывороткой, в конфлюэнтном монослое.
Нами также исследовался противофиброзный эффект производного урсодезоксихолевой кислоты (УДХК), нор-УДХК. УДХК является широко распространенным гепатопротектором, обладающим умеренными проти-вофиброзными свойствами [8]. В эксперименте на крысах, у которых фиброз печени индуцировался тиоацетамидом (ТАА)
4
0
0
в течение 3 месяцев, введение нор-УДХК оказывало как профилактический эффект, тормозя развитие фиброза печени, так и терапевтическое действие, снижая признаки фиброза после отмены гепатотоксина. При этом введение нор-УДХК уменьшало морфометрические значения отложения экстрацеллюлярного матрикса в печени, снижало содержание оксипролина и уровни сывороточных маркеров фиброза печени (рис. 5). Следует отметить, что по большинству показателей противофиброзный эффект нор-УДХК был значительно выше, чем при введении УДХК.
В течение последнего десятилетия выяснено, что пен-токсифиллин (ПТФ), известный препарат для лечения сосудистых нарушений, является эффективным противовоспалительным средством, угнетающим наработку основного провоспалительного цитокина, ТОТа. Исследуя применение ПТФ у крыс, содержавшихся на диете с дефицитом холина и метищнина, а также у крыс с ТАА-индуцируемым фиброзом
10
Контроль
+УДХК +нор-УДХК
70 -
60 -
* 50 -
** Ü 40 -
т X 30 -
20 -
10 - I
0
Контроль
э
**
т
* **
Контроль
+УДХК +нор-УДХК
1_
Контроль
А. Площадь соединительной ткани; Б. Содержание коллагена I; В. Содержание коллагена I Г. Содержание проколлагена III-NT
печени мы обнаружили выраженное противофиброзное действие этого препарата. ПТФ эффективно уменьшал площадь соединительной ткани и содержание оксипро-лина в печени, а у крыс, получавших ТАА, снижал экспрессию
Противовоспалительные мероприятия
Удаление повреждающего агента Активация наработки интерлейкина-10 Угнетение наработки TNFa Антиоксидантные мероприятия
Влияние на наработку внеклеточного матрикса
Угнетение или снижение активации ЗКП Снижение синтеза и секреции матрикса Угнетение пролиферации и миграции ЗКП Подавление ангиогенеза
Влияние на разрешение фиброза
Инициацияапоптоза ЗКП Активация секреции и активности ММР Подавление наработки ТИМП
Влияние на регуляторные системы
Ингибирование экспрессии PTTG
Модуляция трансдукции сигнала с клеточных рецепторов
Таблица 1. Основные подходы к лечению фиброза печени
мРНК проколлагена al и ММР-3. Полученные данные явились основанием для создания нового гепатопротективного и противо-фиброзного комбинированного препарата, включающего ПТФ, разработкой которого занимается в настоящее время наша лаборатория и ГП «Академфарм».
Таким образом, микофе-нольная кислота, галофугинон, пентоксифиллин и нор-УДХК проявляют потенциальные проти-вофиброзные свойства как в культуре звездчатых клеток печени, так и в опытах in vivo, и являются многообещающими компонентами для комбинационной терапии фиброза печени.
Выраженные противофиброз-ные свойства статинов на модели ТАА-индуцируемого фиброза печени у крыс обнаружены не были. Симвастатин (10 мг/кг массы тела) умеренно снижал площадь соединительной ткани на срезах печени и повышал экспрессию мРНК некоторых металлопротеиназ, тогда как флувастатин в той же дозе снижал уровень транскрипта проколлагена al и повышал этот показатель для ММР-3.
В эксперименте in vivo нами было исследовано влияние донора окиси азота (NO), NaNO2 на трансформацию хрониче-
* **
Т
Э
* **
т
+УДХК +нор-УДХК
*
т
* **
+УДХК +нор-УДХК
Рис. 4. Показатели компьютеризированного морфометричес-кого измерения площади соединительной ткани (в % к общей площади среза) и содержание сывороточных маркеров фиброза печени (нг/мл) у крыс с ТАА-индуцированным фиброзом печени, получавших УДХК или нор-УДХК
о х
X
5
X
8
6
4
2
0
6
5
4
3
2
0
59
Производные урсодезоксихолевой кислоты
Нор-урсодезоксихолевая кислота - гомолог урсодезоксихолевой кислоты с укороченной на один атом углерода боковой цепью, уменьшает отложение экстрацеллюлярного матрикса, проявляя антифиброгенное и противовоспалительное действие Бис-нор-урсодезоксихолевая кислота - гомолог урсодезоксихолевой кислоты с укороченной на два атома углерода боковой цепью; механизм действия, по всей вероятности, аналогичен нор-урсодезоксихолевой кислоте
Растительные компоненты
Силимарин - флавоноид из расторопши пятнистой, антиоксидант, снижает активацию ЗКП, угнетает экспрессию проколлагена 1, ТСРРТ, Т1МР-1
Галофугинон - алкалоид, обладающий противомалярийными свойствами, угнетает проколлаген а1
Байкалеин - алкалоид, применяемый в китайской традиционной медицине, антиоксидант, препятствует активации ЗКП
Модуляторы трансдукции сигнала
Ролипрам и Лозартан - специфические ингибиторы ФДЭ 3 и 4, индуцируют сигнальную молекулу 5ГаИ. Угнетают проколлаген а1 и ТСРр! Ш135252 - антагонист ЕТАР, снижает аккумуляцию коллагена на 60%
Пиоглитазон, Росиглитазон - лиганды пероксисомального пролифератор-активируемого рецептора гамма (РРДЩ, антидиабетические тиазолидиндионы, угнетают активацию ЗКП и синтез коллагена
Микофенолят мофетил (микофенольная кислота) - иммунодепрессант, используемый в трансплантологии, ингибитор синтеза гуанозиновых нуклеотидов; описан ингибирующий эффект на развитие фиброза почек
Антагонисты профиброгенных цитокинов
Пептидный аналог ТСРР1 Растворимый рецептор ТСРР1 типа 2
Статины (ловастатин, симвастатин) - гипохолестеинемические препараты, ингибиторы оксиметилглутарил-КоА-редуктазы, угнетают экспрессию СТСР и индуцируют апоптоз МФ
Доноры окиси азота (пирро-ИО и др.) - угнетают провоспалительный и профиброгенный эффекты ТЫРа
Антиангиогенные препараты
Каптоприл, эналаприл - ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента, антиоксиданты, угнетают ангиогенез и активацию ЗКП Интерферон-а - противовирусный препарат, угнетает ангиогенез, активацию/пролиферацию ЗКП и синтез коллагена, индуцирует сигнальную молекулу 5ГаМ
ТИР-470 - блокатор рецепторов УЕСР
о
X X
5
X
Таблица 2. Перспективные противофиброзные агенты
ского гепатита в фиброз у крыс, получавших диметилнитроза-мин (ДМНА). Гистологические исследования позволили заключить, что №да2 замедляет или даже предотвращает развитие гепатита, индуцируемого ДМНА. Результаты биохимических исследований также подтверждают, что №да2 частично предотвращает развитие хронического гепатита и его трансформацию в фиброз, что, по нашему предположению, обусловлено модуляцией свободно-радикальных процессов в печени [6].
Следует обратить внимание на то, что большинство перечисленных в табл. 2 препаратов с известной степенью безопасности уже применяются в клинической практике по другим показаниям.
После необходимых дополнительных исследований эти препараты легко можно будет использовать для лечения фиброза и цирроза печени.
Статья поступила в редакцию 27. 06. 2013 г. Summary
The modern view on mechanisms of liver fibrosis including fibrogenesis, angiogenesis and fibrolysis is presents. Authors formulated main trends of actual pathogenetic therapy of liver fibrosis and presented the list of mostly prospective antifibrotic compounds. The role of pituitary tumor transforming factor in liver fibrosis, newly discovered in author's laboratory, is presented in this review. The own data on high antifibrotic activity of nor-ursodeoxycholicacid and some other compounds are also presented.
Литература
1. Blachier M., Leleu H., Peck-Radosavijevich M. [et al.]. The burden of liver disease in Europe. Review of available epidemiological data // J. Hepatol. 2013. Vol. 58. P. 593-608.
2. Schuppan D., Afthal N.H. Liver cirrhosis// Lancet. 2008. Vol. 371. P. 838-851.
3. Friedman S.L. Molecular regulation of hepatic fibrosis, an integrated cellular response to tissue injury// J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. P. 2247-2250.
4. Medina J., Arroyo A.G., Sanchez-Madrid F. [et al.]. Angiogenesis in chronic inflammatory liver disease// Hepatology. 2004. Vol. 39. P. 1185-1195.
5. Buko V., Belonovskaya E., Lukivskaya O. [et al.]. Effect of pituitary tumor-transforming gene on progression of liver fibrosis/ In: Challenges of Liver Cirrhosis and Tumors. Falk Symposium 186. Mainz, 2012. Abs. 8.
6. Lukivskaya O., Patsenker E., Lis R., Buko V.U. Inhibition of inducible nitric oxide synthase activity prevents liver recovery in rat thioacetamide-induced fibrosis reversal// Eur. J. Clin. Invest. 2008. Vol. 38. P. 317-325.
7. Poynard T., McHutchinson J., Manns M. [et al.]. // Gastroenterology. 2002. Vol. 122. P. 1301-1313.
8. Buko V.U., Kuzmitskaya-Nikolaeva I.A., Naruta E.E. [et al.]. Ursodeoxycholic acid dose-dependently improves liver injury in rats fed a methionine and choline deficient diet// Hep. Res. 2011. Vol. 41. P. 647-659.
