CC BY
10
НАУЧНАЯ СТАТЬЯ УДК 577.151.
ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ ТРАНСАМИНАЗЫ Б-АМИНОКИСЛОТ ИЗ АМШОБАСТЕШиМ СОЬОМБШтЕ ДЛЯ (Я )-СЕЛЕКТИВНОГО АМИНИРОВАНИЯ а-КЕТОКИСЛОТ
Софья Александровна Шилова1, Татьяна Владимировна Ракитина2, Владимир Олегович Попов3, Екатерина Юрьевна Безсуднова4
1-4 Институт биохимии имени А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук
2 Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»
Авторы, ответственные за переписку: Софья Александровна Шилова, [email protected]; Екатерина Юрьевна Безсуднова, [email protected]
Аннотация. Трансаминаза Б-аминокислот из Aminobacterium colombiense (АшюоТА) опробована в качестве биокатализатора (^)-селективного ами-нирования 2-оксобутирата, 2-оксовалерата и 2-оксо-4-фенилбутирата в целях получения неприродных Б-аминокислот - Б-гомоаланина, Б-норвалина и Б-гомофенилаланина. Для увеличения выхода продукта Б-аминокислоты разработана трехферментная система, включающая трансаминазу АшюоТА, (,К)-2-гидроксиглутаратдегидрогеназу и глюкозодегидрогеназу, которая позволяет эффективно сместить равновесие реакции трансаминирования в сторону продуктов. Предложенная система работает как при нейтральных, так и при слабощелочных значениях рН. Обнаружено, что при высокой концентрации субстрата (500 мМ) происходит ингибирование АшюоТА продуктами системы. В результате оптимизации условий (К)-селективного аминирования достигнуты следующие выходы целевых продуктов: 435 мМ Б-гомоаланина, 320 мМ Б-норвалина и 47,5 мМ Б-гомофенилаланина, энантиомерный избыток Б-аминокислот превысил 99,5%.
Ключевые слова: биокатализ, (^)-селективное аминирование, трехферментная система, трансаминазы Б-аминокислот
Б01: 10.55959/М8Ш579-9384-2-2023-64-2-85-98
Список сокращений: АшюоТА - трансаминаза Б-аминокислот из АттоЬас-terium colombiense, БААТ - трансаминаза Б-аминокислот, РЬР - пиридоксаль-5'-фосфат, ГГДГ - (^)-2-гидроксиглутаратдегидрогеназа, ГДГ - глюкозодеги-дрогеназа, ЛДГ - лактатдегидрогеназа.
Финансирование. Работы по клонированию, экспрессии, характеристике трансаминазы и анализу трехферментной системы выполнены при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект №19-14-00164). Работы по анализу стабильности гидроксиглутаратдегидрогеназы и глюкозодегидро-геназы выполнены при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации.
Для цитирования: Шилова С.А., Ракитина ТВ., Попов В О., Безсуднова Е Ю. Перспективы применения трансаминазы Б-аминокислот из Aminobacterium colombiense для (^)-селективного аминирования а-кетокислот // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. Т. 64. № 2. С. 85-98.
© Шилова С.А., Ракитина Т.В., Попов В.О., Безсуднова Е.Ю., 2023
ORIGINAL ARTICLE
PROSPECTS OF APPLICATION OF D-AMINO ACID TRANSAMINASE FROM AMINOBACTERIUM COLOMBIENSE FOR (R)-SELECTIVE AMINATION OF a-KETOACIDS
Sofia A. Shilova1, Tatiana V. Rakitina2, Vladimir O. Popov3, Ekaterina Yu. Bezsudnova4
1-4 Bach Institute of Biochemistry, Federal Research Centre "Fundamentals of Biotechnology" of the Russian Academy of Science, Moscow, Russian Federation
2 National Research Centre "Kurchatov Institute", Moscow, Russia
Corresponding authors: Sofia A. Shilova, [email protected], Ekaterina Yu. Bezsudnova, [email protected]
Abstract. D-amino acid transaminase from Aminobacterium colombiense was applied for (R)-selective amination of 2-oxobutyrate, 2-oxovalerate and 2-oxo-4-phenylbutyrate to produce unnatural D-amino acids - D-homoalanine, D-norvaline and D-homophenylalanine. To increase the product yield of D-amino acids, a one-pot three-enzyme system was developed. The system included transaminase from A. colombiense, (R)-2-hydroxyglutarate dehydrogenase and glucose dehydrogenase and effectively shifted the equilibrium of transamination reaction toward the products. The system functioned in both neutral and slightly alkaline pH. We found that at high substrate concentrations (500 mM) transaminase from A. colombiense was inhibited by the products accumulated in the system. The optimization of operational conditions of the three-enzyme system led to the following yields of the target products: 435 mM D-homoalanine, 320 mM D-norvaline and 47,5 mM D-homophenylalanine; the enantiomeric excess of produced D-amino acids exceeded 99,5%.
Keywords: biocatalysis, (R)-selective amination, three-enzyme system, D-amino acid transaminases
Abbreviations: AmicoTA - D-amino acid transaminase from Aminobacterium colombiense, DAAT - D-amino acid aminotransferase, PLP - pyridoxal-5'-phosphate, HGDH - (R)-2-hydroxyglutarate dehydrogenase, GDH - glucose dehydrogenase, LDH - lactate dehydrogenase
Financial support: cloning, expression, the transaminase characterization, and three-enzyme system analysis was supported by the Russian Science Foundation (grant №19-14-00164). Stability analysis of hydroxyglutarate dehydrogenase and glucose dehydrogenase was supported by the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation.
For citation: Shilova S.S., Rakitina T.V., Popov V.O., Bezsudnova E.Y. Prospects of application of D-amino acid transaminase from Aminobacterium colombiense for the (R)-selective amination of a-ketoacids // Vestn. Mosk. un-ta. Ser. 2. Chemistry. T. 64. № 2. P. 85-98.
(К)-селективное аминирование а-кетокислот - эффективный путь синтеза оптически чистых Э-аминокислот, которые в живых организмах вовлечены во многие физиологические процессы: участвуют в работе центральной нервной системы, выступают маркёрами различных патологий и являются структурными блоками молекул с проти-вомикробной и противоопухолевой активностью
[1, 2]. Биологическая активность Э-аминокислот открывает перспективы их применения в области медицины и фармацевтики, поэтому разработка высокопроизводительных путей их синтеза представляет собой актуальную задачу фарминдустрии и химической промышленности. Одно из важнейших требований к лекарственным препаратам - оптическая чистота [3]. С проблемой
получения оптически чистых продуктов наиболее эффективно справляются биокатализаторы-ферменты [4, 5], которые отличаются высокой специфичностью и стереоселективностью, а также способностью работать в мягких условиях, что значительно снижает экологическую нагрузку производственного процесса [5].
Трансаминазы D-аминокислот (D-amino acid aminotransferase, DAAT, КФ 2.6.1) относятся к пиридоксаль-5'-фосфат (РЬР)-зависимым двух-субстратным ферментам, которые катализируют стереоселективный перенос аминогруппы с D-аминокислоты на а-кетокислоту с образованием новых D-аминокислоты и а-кетокислоты (переаминирование). DAAT являются перспективными ферментами для разработки на их основе биокатализаторов (^)-селективного аминирования а-кетокислот. In vivo одной из важнейших катализируемых DAAT реакций является синтез D-глутамата для клеточной стенки бактерий путем переаминирова-ния между D-аланином и а-кетоглутаратом. In vitro для многих DAAT описана активность с D-аминокислотами и а-кетокислотами с алифатическими, ароматическими и отрицательно заряженными боковыми группами [6-8]. Широкая субстратная специфичность делает DAAT перспективными объектами для разработки на их основе биокатализаторов синтеза различных D-аминокислот [7, 9, 10]. Однако в случае применения трансаминаз возникают принципиальные сложности: ингибирование субстратом или продуктом (чаще кетокислотой) и термодинамическое равновесие реакции переаминирова-ния между аминокислотой и кетокислотой, для смещения которого в сторону продукта (новой аминокислоты) требуются избытки субстрата аминодонора или вывод продукта кетокислоты из реакции [7, 11-13].
DAAT из мезофильной бактерии Aminobacte-rium colombiense (AmicoTA) имеет широкую субстратную специфичность, активна в температурном диапазоне 30-60 °С в нейтральных и слабощелочных рН. В настоящей работе проведена оценка эффективности применения AmicoTA для (^)-селективного аминирования а-кетокислот с D-глутаматом как донором аминогруппы. Для смещения равновесия катализируемой AmicoTA реакции разработана трехфер-ментная система, включающая AmicoTA, NAD-зависимую (Л)-2-гидроксиглутаратдегидрогеназу (ГГДГ) и NAD-зависимую глюкозодегидроге-назу (ГДГ) для регенерации NADH-формы ко-
фермента. Разработанная схема опробована для синтеза D-гомоаланина, D-норвалина и D-гомофенилаланина при нейтральных и слабощелочных значениях рН. Проанализировано влияние концентрации кофактора PLP на выходы продуктов реакций и концентрации субстратов и продуктов на выходы продуктов реакций, а также на активность и стабильность ферментов системы.
Экспериментальная часть
Клонирование, экспрессия и выделение AmicoTA и ГГДГ. Ген Amico_1844, кодирующий AmicoTA, был взят из базы данных NCBI и оптимизирован для экспрессии в бактериальных клетках E. coli с помощью онлайн-сервера Optimizer (http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/). На 5'- и 3'-концы последовательности добавляли сайты эндонуклеаз рестрикции NdeI и HindIII соответственно. Синтетический ген (ООО «АТГ Сервис Ген», Россия) в составе модифицированного вектора pET-21d [14] трансформировали в клетки E. coli Rosetta(DE3) pLysS. Клетки растили в среде LB/ампициллин при 37 °С до А 600 = 0,6-0,8, затем индуцировали экспрессию гена 0,2 мМ ИПТГ и инкубировали при 30 °С в течение 18 ч. Далее клетки цeнтрифугировали и ресуспендировали в 50 мМ К-фосфатном буфере (рН 8,0), содержащем 500 мМ NaCl, 20 мМ ими-дазола, 5 мМ ß-меркаптоэтанола, 0,5 М мочевины, 10% глицерина, 100 мкМ PLP и 1 мМ фе-нилметилсульфонилфторида, а затем разрушали ультразвуком. Клеточный экстракт центрифугировали при 18 500 g в течение 45 мин и наносили супернатант на колонку HisTrap HP («Cytiva», США), уравновешенную 50 мМ К-фосфатным буфером (рН 8,0), содержащим 500 мМ NaCl, 20 мМ имидазола, 0,1% тритона Х-100 и 1 мМ фе-нилметилсульфонилфторида. Рекомбинантную AmicoTA с His6-тагом на N-конце элюировали линейным градиентом имидазола (20-500 мМ) в том же буфере без фенилметилсульфонил-фторида и Тритона Х-100. Собранную фракцию AmicoTA инкубировали с 300 мкМ PLP при 25 °С в течение 1 ч, концентрировали и переводили в 50 мМ К - фосфатный буфер (pH 8,0), содержащий 100 мМ NaCl и 100 мкМ PLP, с помощью центрифужных концентраторов Amicon Ultra-15 («Millipore», США) и хранили в 50%-м глицерине при -20 °С. Реком-бинантную ГГДГ из Acidaminococcus fermentas получали аналогично AmicoTA. Чистоту белковых препаратов анализировали с помощью
электрофореза в денатурирующих условиях в 12%-м ПААГ. Концентрацию AmicoTA и ГГДГ определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм, используя рассчитанные коэффициенты экстинкции 0,615 и 0,573 млмг-1см-1 для AmicoTA и ГГДГ соответственнно (https:// web.expasy.org/protparam/).
Получение холоформы и апоформы Лт1еоТА. Холоформу AmicoTA получали инкубацией 10 мг/мл AmicoTA с 600 мкМ PLP и 5 мМ а-кетоглутарата в течение 1 ч при 25 °C с последующим обессоливанием препарата на ко-лонке HiTrap («Cytiva», США), уравновешенной 50 мМ CHES-буфером (рН 9,0). Апоформу AmicoTA получали инкубацией холоформы с 500 мМ D-аланина в течение 1 ч при 25 °C с последующим обессоливанием препарата на колонке HiTrap, уравновешенной 50 мМ CHES буфером (рН 9,0).
Определение специфичности Лт1еоТА к D-аминокислотам. Специфичность AmicoTA к D-аминокислотам определяли по активности холоформы AmicoTA в полуреакциях в следующих условиях: 1 мг/мл (30 мкМ) холоформы AmicoTA, 4 мМ D-аминокислоты (D-глутамат, D-аланин, D-аспартат, D-лейцин, D-фенилаланин, D-орнитин), 50 мМ CHES-буфер (рН 9,0), 40 °С. Активность определяли по снижению концентрации холоформы в присутствии D-аминокислоты. За скоростью полуреакции следили спектрофо-тометрически по убыли оптической плотности при длине волны 408 нм, соответствующей максимуму поглощения холоформы фермента, на спектрофотометре «SPECTROstar Omega» («BMG LABTECH», Германия). Константу скорости полуреакции (£набл) определяли обработкой экспериментальных значений по уравнению
At = Aда + А AeXP ^наблЛ
где At - поглощение в момент времени t, АЛ -разность поглощений при t = 0 и t = да, Лда - поглощение при t = да.
Определение активности ЛmicoТА в реакции трансаминирования. Активность AmicoTA в реакциях трансаминирования между D-аланином и а-кетоглутаратом, между D-глутаматом и различными а-кетокислотами в 50 мМ CHES-буфере (рН 9,0) или в 100 мМ К фосфатном буфере (рН 7,5), при 30-60 °С оценивали по скорости накопления продуктов реакций - пирувата и а-кетоглутарата соответственно. Накопление пирувата или а-кетоглутарата контролировали по сопряженной ферментативной реакции вос-
становления пирувата лактадегидрогеназой из мышц кролика («Roche», США) (ЛДГ-метод) или восстановления а-кетоглутарата (К)-2-гидроксиглутаратдегидрогеназой из A. fermentas (ГГДГ-метод) соответственно, в присутствии кофермента NADH. Превращение пирувата и а-кетоглутарата в сопряженной реакции соответствовало убыли NADH, которую регистрировали с помощью спектрофотометра «SPECTROstar Omega» («BMG Laboratories») при длине волны 340 нм (e340(NADH) = 6,22 мМ-1см-1). Скорость реакции определяли по тангенсу угла наклона начального линейного участка убыли оптической плотности при 340 нм от времени. За единицу ферментативной активности U принимали количество (мкмоль) образованного пирувата (ЛДГ-метод) или а-кетоглутарата (ГГДГ-метод) в 1 мин. Для реакции трансаминирования между D-аланином и а-кетоглутаратом стандартная реакционная смесь содержала 50 мМ D-аланина, 5 мМ а-кетоглутарата, 60 мкМ PLP, 330 мкМ NADH, 4 U/мл (0,01 мг/мл) ЛДГ и 0,005 мг/мл AmicoTA. Для реакции трансаминирования между D-глутаматом и различными а-кетокиалотами стандартная реакционная смесь содержала 10 мМ D-глутамата, 5 мМ а-кетокислоты, 180 мкМ PLP, 330 мкМ NADH, 4 U/мл (0,0002 мг/мл) ГГДГ, 0,05-0,2 мг/мл AmicoTA. Реакции запускали D-аминокислотой после инкубации реакционной смеси в течение 10 мин. При концентрации 2-оксобутирата и 2-оксовалерата 500 мМ определение активности ГГДГ-методом проводили при длине волны 370 и 377 нм соответственно (e370(NADH) = 2,4 мМ-1см-1, г377(NADH) = 1,4 мМ-1см-1), так как при 340 нм вклад от поглощения кето-кислот в большой концентрации становится значительным. За время проведения эксперимента (30-40 мин) ЛДГ и ГГДГ не инактиви-ровались при 30-60 °С.
Определение оптимальных значений рН и температуры реакции трансаминирования, катализируемой ЛmicoТА. Зависимость активности AmicoTA от рН определяли для реакций трансаминирования между D-аланином и а-кетоглутаратом, D-глутаматом и пируватом в стандартных условиях (описаны выше) при 30 °С в буферах 25 мМ К-фосфат/25 мМ Tris-HCl (рН 6-9), 50 мМ CHES (pH 9-10). Зависимость активности AmicoTA от температуры определяли для реакции между D-аланином и а-кетоглутаратом в стандартных условиях в
50 мМ К-фосфатном буфере (рН 8,0) в температурном диапазоне 30-60 °С ЛДГ-методом. ЛДГ не инактивируется в указанном температурном диапазоне за время проведения эксперимента (30-40 мин).
Анализ термостабильности холофор-мы AmicoTA. Термостабильность холоформы AmicoTA оценивали по времени полуинактивации при инкубации в следующих условиях: 1,5 мг/ мл холоформы в присутствии 100 мкМ PLP выдерживали в 50 мМ CHES-буфере (рН 9,0) при 50 и 60 °С в течение 40 ч. Через определенные промежутки времени отбирали алик-воты и определяли активность AmicoTA в реакции трансаминирования между D-аланином и а-кетоглутаратом в стандартных условиях при 60 °С.
Анализ операционной стабильности AmicoTA, ГГДГ и ГДГ. Операционную стабильность AmicoTA, ГГДГ и ГДГ оценивали по остаточной активности при инкубации фермента в течение 24 ч в реакции (^)-селективного аминирова-ния 2-оксовалерата. Фермент, 4 мг/мл AmicoTA, или 180 U/мл (0,01 мг/мл) ГГДГ, или 30 U/ мл (0,6 мг/мл) ГДГ, выдерживали в 100 мМ К-фосфатном буфере (рН 7,5) в присутствии 500 мМ D-глутамата, 500 мМ 2-оксовалерата, 100 мкМ PLP, 1 мМ NADH и 1 М D-глюкозы при 30 °С в течение 24 ч. Отбирали аликво-ты и определяли в них остаточную активность ферментов. Активность AmicoTA определяли в стандартных условиях реакции трансаминиро-вания между D-аланином и а-кетоглутаратом в 50 мМ CHES-буфере (рН 9,0) при 60 °С. Значение активности ГГДГ определяли в реакции восстановления а-кетоглутарата в присутствии NADH (1 мМ а-кетоглутарата, 0,33 мМ NADH, 0,0001 мг/мл ГГДГ), активность ГДГ определяли в реакции окисления D-глюкозы в присутствии NAD+ (1 мМ D-глюкозы, 1 мМ NAD+, 0,02 мг/мл ГДГ) в 100 мМ К - фосфатном буфере (рН 7,5) при 30 °С. Убыль и накопление NADH определяли спектрофотометриче-ски по изменению оптической плотности при 340 нм с использованием спектрофотометра «SPECTROstar Omega». Скорость реакции определяли по тангенсу угла наклона начального линейного участка убыли/роста оптической плотности при 340 нм от времени.
Проведение (R)-селективного аминирования а-кетокислот Ферментативное аминирование а-кетокислот проводили в 100 мМ К-фосфатном буфере (рН 7,5) (условия 1) и 100 мМ CHES-
буфере (рН 9,0) (условия 2) в двух концентрационных диапазонах реагентов. Начальные условия первого диапазона концентраций: 100 мМ D-глутамата, 50 мМ а-кетокислоты, 100 мкМ PLP, 4 мг/мл AmicoTA (не больше 1 U/мл), 1 мМ NADH, 150 мМ D-глюкозы, 180 U/мл (0,01 мг/ мл) ГГДГ, 30 U/мл (0,6 мг/мл) ГДГ. Начальные условия второго диапазона концентрации: 500 мМ D-глутамата, 500 мМ а-кетокислоты (в случае 2-оксо-4-фенилбутирата в систему добавляли 20% ДМСО), 1 М D-глюкозы, 180 U/мл (0,01 мг/ мл) ГГДГ, 30 U/мл (0,6 мг/мл) ГДГ. Здесь также варьировали концентрацию кофактора PLP -100, 200 и 500 мкМ.
Определение выходов продуктов реакций трансаминирования. Выход продуктов реакций D-глутамат + 2-оксобутират, D-глута-мат + 2-оксовалерат и D-глутамат + 2-оксо-4-фенилбутират оценивали по убыли кетосуб-стратов в реакционной смеси методом ВЭЖХ («AKTA Purifier, Cytiva», OTA) с УФ-ВИД-детектором на колонке с обращенной фазой С-18 (Zorbax Eclipse XDB-C18, 5 мкм, 4,6x150 мм, «Agilent», СШA) при 25 °С. Через определенные промежутки времени низкомолекулярную фракцию реакционной смеси отделяли от белковой с помощью центрифужных концентраторов «Amicon-Ultra-0,5» («Millipore», СШA), разбавляли в 10 раз элюентом и 20 мкл препарата наносили на колонку. В качестве элюента использовали 20 мМ Na-фосфатный буфер (рН 2,2) с добавлением 5% метанола для определения выхода 2-оксобутирата и 2-оксовалерата (условия 1), и 20 мМ Na-фосфатный буфер (рН 3,0) с добавлением 30% метанола (условия 2) для определения выхода 2-оксо-4-фенилбутирата. Aнализируемые а-кетокислоты детектировали спектрофотометрически при 210 нм. Объемы удерживания приведены в табл. 1.
Определение энантиомерных избытков продуктов реакций трансаминирования. Энан-тиомерные избытки продуктов реакции транс-аминирования (D-гомоаланин, D-норвалин и D-гомофенилаланин) определяли методом ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой С-18. Aминопродукты и оставшийся D-глутамат в ходе реакций предварительно модифицировали 1-фтор-2,4-динитрофенил-5^-аланинамидом (Marfey's reagent, «Sigma», СШA) [15]. Полученные диастереомеры разделяли на колонке со скоростью потока 1 мл/мин в режиме градиента: 10-70% буфера Б за 20 мин для разделения диастереомеров гомоаланина (условия 3), 20-
Т а б л и ц а 1
Объемы удерживания соединений в ходе ВЭЖХ
Соединение Условия ВЭЖХ Объем удерживания, мл
Определение выходов продуктов реакций трансаминирования
2-Оксобутират условия 1 3,7
2-Оксовалерат 8,6
2-Оксо-4-фенилбутират условия 2 8,7
Определение энантиомерного избытка продуктов D-аминокислот
После модификации 1-фтор-2,4-динитрофенил-5-Ь-аланинамидом (Marfey's reagent) D-Глутамат условия 3 18,9
условия 4 15,1
L-Гомоаланин условия 3 19,2
D-Гомоаланин 21,8
L-Норвалин условия 4 16,0
D-Норвалин 18,6
L-Гомофенилаланин 20,2
D-Гомофенилаланин 26,6
70% буфера Б за 15 мин для разделения диа-стереомеров норвалина и гомофенилаланина (условия 4). В качестве буфера А использовали 0,1%-ю 3-фторуксусную кислоту (ТФУ) («Sigma», США) в воде, в качестве буфера Б применяли 0,1%-ю ТФУ в метаноле. Модифицированные аминосоединения в ходе ВЭЖХ детектировали спектрофотометрически при 340 нм. Объемы удерживания приведены в табл. 1.
Результаты и их обсуждение
Активность AmicoTA в полуреакциях с D-аминокислотами представлена в табл. 2. Специфическим аминодонором AmicoTA является D-глутамат. Активность с D-аспартатом и алифатическими D-аланином и D-лейцином значительно ниже. D-фенилаланин и D-орнитин наименее специфические аминодоноры для Ат^оТА. По результатам анализа полуреакций D-глутамат и D-аланин отобраны в качестве аминодоноров для катализируемого АтшоТА (^)-селективного аминирования а-кетокислот.
Подбор условий реакции трансаминирования показал, что АтшоТА катализирует полную реакцию трансаминирования между D-глутаматом и пируватом и D-аланином и а-кетоглутаратом в температурном диапазоне 30-60 °С и диапазоне рН 7-9. Кроме того, Ат^оТА является термостабильным ферментом: время по-
луинактивации холоформы AmicoTA в 50 мМ CHES-буфере (рН 9,0) в присутствии 100 мкМ PLP при 60 и 50 °С составляют 10 и 40 ч соответственно.
Для катализируемого AmicoTA (К)-селектив-ного аминирования а-кетокислот были опробованы две трехферментные системы (схема 1). Для смещения равновесия трансаминазной реакций с аминодонором D-глутаматом система I включала (К)-2-гидроксиглутаратдегидрогена-зу (ГГДГ) из A. fermentas [16], которая восстанавливала кетопродукт а-кетоглутарат до (К)-2-гидроксиглутарата. Для смещения равновесия трансаминазной реакций с аминодонором D-аланином система II включала лактатдегидро-геназу (ЛДГ) из мышц кролика, которая восстанавливала кетопродукт пируват до L-молочной кислоты. Так как обе дегидрогеназы являются NAD-зависимыми ферментами, то для регенерации NAD в системы добавляли глюкозо-дегидрогеназу (ГДГ) из Pseudomonas sp. [16, 17], которая восстанавливала NAD+ до NADH в результате окисления D-глюкозы.
Таким образом, для (^)-селективного ами-нирования а-кетокислот различной природы были составлены две трехферментные системы, включающие реакцию трансаминирования, вывод продукта-кетокислоты и регенерацию ко -фермента NADH (схема 1).
Т а б л и ц а 2
Константы скорости полуреакций холоформы AmicoTA с D-аминокислотами. Условия проведения полуреакций: 1 мг/мл (30 мкМ) холоформы AmicoTA, 4 мМ D аминокислоты, 50 мМ CHES буфер (рН 9,0),
40 °С
D-аминокислота
Формула D-аминокислоты
104^ с-1
D-Глутамат
690 i 30
D-Аланин
18 i 1
D-Аспартат
2,7 i 0,1
D-Лейцин
1,3 i 0,1
D-Фенилаланин
0,59 i 0,03
D-Орнитин
0,60 i 0,04
В ходе анализа активности AmicoTA в реакциях трансаминирования с аминодонорами D-аланином и D-глутаматом обнаружилось, что ЛДГ активна не только с пируватом, но и с различными гидрофобными кетокислотами, тогда как ГГДГ специфична исключительно к а-кетоглутарату и, следовательно, не выводит а-кетокислоту из реакции трансаминирования.
Поэтому дальнейшие исследования проводили с трехферментной системой I с D-глутаматом в качестве донора аминогруппы в реакции транс-аминирования (схема 1, система I).
Наибольшую активность в реакциях трансаминирования с D-глутаматом AmicoTA проявляла с пируватом, 2-оксобутиратом, 2-оксо-4-фенилбутиратом и 2-оксовалератом (табл. 3).
Схема
Трехферментные системы I и II для (К)-селективного аминирования а-кетокислот
а-Кетокислота
Аг
о
о
АпнсоТА
о" О
"о О
О-Аминокислота О"
N1^
О
О
N113 Б-Глутамат
О
а-Кетоглутарат
ггдг
О-Глюкоза
гдг Г
Г----¡ЧА1)
Б-Глюконо-
1,5-л актон (й)-2-гидроксиглутарат
*
Э-Глюконовая кислота
Система I
а-Кетокислота О"
АшкоТА
о-
О-Аминокислота О"
1 +
N113
сн.
N113 О-Алании
О
Пируват
О-Глюкоза
ГДГ(С,
NAD
О-Глюконо-
1,5-л актон *
Э-Глюконовая кислота
лдг
Ь-Лактат
Система II
T а б л и ц а 3
Удельная активность AmicoTA в реакциях трансаминирования между 10 мМ D-глутамата и 5 мМ а-кетокислоты. Условия определения активности: 100 мМ К-фосфатный буфер (рН 7,5), 50 °С
а-Кетокислота
Формула а-кетокислоты
Соответствующая D-аминокислота
Лктивность, ми/мг
Пируват
D-аланин
226 ± 4
2-Оксобутират
D-гомоаланин
118 ± 5
2-Оксо-4-фенилбутират
D-гомофенилаланин
45 ± 1
2-Оксовалерат
D-норвалин
14 ± 1
Фенилпируват
D-фенилаланин
7,7 ± 0,2
4-Метил-2-оксовалерат
D-лейцин
4,7 ± 0,6
3-Метил-2-оксобутират
D-валин
3,1 ± 0,3
2-Оксогексаноат
D-норлейцин
2,61 ± 0,02
Окончание табл. 3
а-Кетокислота Формула а-кетокислоты Соответствующая D-аминокислота Активность, ми/мг
О" СНз
3-Метил-2-оксовалерат D-изолейцин 1,9 ± 0,05
о
4-Гидрокси-фенилпируват D-тирозин 1,6 ± 0,1
Активность AmicoTA уменьшалась с увеличением объема боковой группы и с добавлением заместителя к CP- и Су-атому боковой группы а-кетокислоты. Интересно, что активность AmicoTA с 2-оксо-4-фенилбутиратом была выше, чем с фенилпируватом, что, вероятно, обусловлено структурными особенностями активного центра фермента.
Разработанную трехферментную систему для (К)-селективного аминирования а-кетокислот (схема 1, система I) было решено опробовать на субстратах - 2-оксобутират, 2-оксовалерат и 2-оксо-4-фенилбутират, для синтеза неприродных аминокислот - D-гомоаланина, D-норвалина и D-гомофенилаланина. Для начала были выбраны следующие условия (К)-селективного аминирования а-кетокислот: 100 мМ D глутама-та, 50 мМ а-кетокислоты, 100 мкМ PLP, 4 мг/мл AmicoTA (не больше 1 U/мл), 180 U/мл ГГДГ, 1 мМ NADH, 30 U/мл ГДГ и 150 мМ D глюкозы, 100 мМ К фосфатный буфер (рН 7,5), 30 °С [18]. Температура 30 °С была выбрана для предотвращения быстрой инактивации всех ферментов в системе. (При понижении температуры реакции трансаминирования между D-аланином и а-кетоглутаратом с 50 до 30 °С удельная активность AmicoTA снижалась в два раза). Для систем с 2-оксобутиратом и 2-оксовалератом проверили также влияние рН на скорость накопления D-гомоаланина и D-норвалина. Реакции проводили в 100 мМ К-фосфатном буфере (рН 7,5) и в 100 мМ CHES-буфере (рН 9,0).
Выход продукта реакции D-глутамат + + 2-оксобутират через 24 ч составил 100% при значениях рН как 7,5, так и 9,0 (табл. 4), тогда как выход продукта реакции D-глутамат +
+ 2-оксовалерат через 24 ч при рН 7,5 составил 100%, а при рН 9,0 - 86% (табл. 4). При рН 9,0 трехферментная система синтеза 2-оксовалера-та работает менее эффективно, однако через следующие 24 ч выход продукта данной реакции все же достиг 100%. Реакцию Б-глутамата с 2-оксо-4-фенилбутиратом проводили только при рН 7,5. Через 66 ч выход продукта составил 95% (табл. 4).
На следующем этапе была увеличена концентрация исходных субстратов (Б-глутамата и соответствующей а-кетокислоты) до 500 мМ, а Б-глюкозы до 1 М. Концентрацию других реагентов не меняли. Реакции проводили при 30 °С. Реакцию Б-глутамат + 2-оксо-4-фенилбутират проводили при рН 7,5 в присутствии 20% ДМСО из-за низкой растворимости 2-оксо-4-фенилбутирата. Через 24 ч выход продукта Б-гомофенилаланина составил 5% и более не увеличивался (табл. 4). Также в реакционной смеси наблюдалась агрегация белков. Вероятно, высокая концентрация субстратов или ДМСО привели к денатурации ферментов в системе. Для реакций Б-глутамат + 2-оксо-бутират/2-оксовалерат через 24 ч выходы продуктов достигли больших значений: выход Б-гомоаланина составил 65 и 60%, а выход Б-норвалина - 40 и 33% при рН 7,5 и 9,0 соответственно (табл. 4). Для повышения выхода продукта при рН 7,5 повысили концентрацию РЬР в реакционной среде от 100 до 500 мкМ. Действительно, было достигнуто некоторое увеличение выхода Б-гомоаланина и Б-норвалина (табл. 4), однако 100%-го выхода продуктов не удалось достичь. Таким образом, при высокой концентрации субстратов трехферментная система
Т а б л и ц а 4
(^)-селективное аминирование а-кетокислот: условия проведения синтеза и выходы продуктов реакций
[D-Глутамат], мМ [a-Кетокислота], мМ [PLP], мкМ pH Время, ч Выход продукта, % Полученная D-аминокислота, мМ
2-Оксобутират D-Гомоаланин
100 50 100 7,5 24 100 50
9,0 100 50
500 500 7,5 65 325
9,0 60 300
200 7,5 75 375
500 87 435
2-Оксовалерат D-Шрвалин
100 50 100 7,5 24 100 50
9,0 68 34
500 500 7,5 40 200
9,0 33 165
200 7,5 58 290
500 64 320
2-Оксо-4-фенилбутират D-Гомофенилаланин
100 50 100 7,5 60 95 47,5
500* 500* 24 5 25
*В систему добавляли 20% ДМСО.
оказалась менее эффективной для синтеза как D-гомоаланина, так и D-норвалина. Одной из причин могло быть закисление реакционной среды в результате накопления D-глюконовой кислоты (продукта окисления D-глюкозы, схема 1). Возможно также ингибирование субстратами и продуктами реакции.
Для каждой системы был определен энанти-омерный избыток продукта D-аминокислоты. Реакционную смесь депротеинизировали с помощью центрифужных концентраторов и амино-соединения реакционной смеси модифицировали 1-фтор-2,4-динитрофенил-5-Ь-аланинамидом (Marfey's reagent). Модифицированные энантио-меры аминокислот разделяли с помощью ВЭЖХ. В результате анализа определено, что энантио-мерные избытки D-гомоаланина, D-норвалина и D-гомофенилаланина составили 99,9; 99,5 и 99,5% соответственно.
Высокая концентрация субстратов или продуктов реакции могла повлиять как на активность, так и на стабильность любого из трех
ферментов системы. Для каждого фермента была проанализирована операционная стабильность в условиях (К)-селективного аминирования 2-оксовалерата. AmicoTA, ГГДГ и ГДГ инкубировали в течение 24 ч в 100 мМ К-фосфатном буфере (рН 7,5) в присутствии 500 мМ D-глутамата, 500 мМ 2-оксовалерата, 100 мкМ PLP и 1 М D-глюкозы при 30 °С. В этих условиях активность AmicoTA не изменилась, ГГДГ уменьшилась на 40%, а ГДГ - на 20%. Таким образом, инактивация трехферментной системы в присутствии субстратов в высокой концентрации в течение 24 ч не связана с полной инактивацией какого-либо из ферментов в условиях (^)-селективного аминирования.
Далее был проведен анализ влияния высокой концентрации субстратов и продуктов на активность AmicoTA в полных реакциях D-глутамат + 2-оксобутират и D-глутамат + + 2-оксовалерат. При повышении концентрации 2-оксобутирата и 2-оксовалерата в реакционной смеси до 500 мМ активность AmicoTA опреде-
Рис. 1. Кинетические кривые реакций D-глутамат + 2-оксобутират (А, В) и D-глутамат + 2-оксовалерат (Б, Г), катализируемых AmicoTA, при 30 °С в 100 мМ К-фосфатном буфере (рН 7,5) (А, Б) и в 100 мМ CHES-буфере (рН 9,0) (В, Г), при разных значениях концентрации субстратов (1 - 100 мМ D-глутамат и 50 мМ а-кетокислоты, 2 - 100 мМ D-глутамат и 500 мМ а-кетокислоты, 3 - 500 мМ D-глутамат
и 500 мМ а-кетокислоты)
Время, с Время, с
Рис. 2. Кинетические кривые реакции D-глутамат + 2-оксовалерат, катализируемой AmicoTA, при 30 °С в 100 мМ K-фосфатном буфере (рН 7,5) при разных значениях концентрации продукта D-норвалина (А) и глутаровой кислоты (Б) (1 - 0 мМ, 2 - 50 мМ, 3 - 200 мМ, 4 - 500 мМ D-норвалина/глутаровой кислоты)
ляли ГГДГ-методом при длине волны 370 и 377 нм соответственно из-за значительного вклада в поглощение при длине волны 340 нм этих субстратов. Субстраты с высокой концентрацией не ингибировали AmicoTA (рис. 1), тогда как высокая концентрация продуктов реакции D-глутамат + 2-оксовалерат способствовала ингибированию AmicoTA (рис. 2). D-Норвалин ингибировал AmicoTA при концентрации от 200 мМ, тогда как глутаровая кислота (аналог продукта трехферментной системы Л-2-гидроксиглутарата) ингибировала AmicoTA уже при концентрации 50 мМ, а при 500 мМ ингибировала активность AmicoTA на 90%. Можно заключить, что ингибирование AmicoTA продуктами реакции стало одной из причин снижения выходов продуктов при высоких значениях концентрации субстратов.
Tаким образом, в результате проделанной работы трансаминаза D-аминокислот из Aminobacterium colombiense (AmicoTA) опробована в качестве биокатализатора (^)-селективного аминирования а-кетокислот. Дана оценка эффективности трех-ферментной системы, включающей AmicoTA, которая катализирует реакцию трансаминиро-вания между D-глутаматом и а-кетокислотой, и
СПИСОК ЛИTЕРATУРЫ
1. Grishin D.V., Zhdanov D.D., Pokrovskaya M.V, Soko-lov N. N. // All life. 2020. Vol. 13. N. 1. P. 11-22 (DOI: 10.1080/21553769.2019.1622596).
2. Martínez-Rodríguez S., Martínez-Gómez A.I., Rodríguez-Vico F., Clemente-Jiménez J.M., Las Heras-Vázquez F.J. // Chem. Biodivers. 2010. Vol. 7. N 6. P. 1531-1548 (DOI: 10.1002/cbdv.200900245).
3. Nguyen L.A., He H., Pham-Huy C. // Int. J. Biomed. Sci. 2006. Vol. 2. N 2. P. 85-100.
4. Bornscheuer U.T., Huisman G.W., Kazlauskas R.J., Lutz S., Moore J.C., Robins K. // Nature. 2012. Vol. 485. N 7397. P. 185-194 (DOI: 10.1038/nature11117).
5. Sheldon R. A., Woodley J. M. // Chem. Rev. 2018. Vol. 118. N. 2. P. 801-838 (DOI: 10.1021/acs.chemrev.7b00203).
6. Bakunova A.K., Nikolaeva A.Y., Rakitina T.V., Isaiki-na T.Y., Khrenova M.G., Boyko K.M., Popov VO., Bez-sudnova E.Y. // Molecules. 2021. Vol. 26. N. 16. P. 5053 (DOI: 10.3390/molecules26165053).
7. Zhou H., Meng L., Yin X., Xu G., Wu J., Wu M., Yang L. // Eur. J. Org. Chem. 2019. Vol. N. 38. P. 64706477 (DOI: 10.1002/EJOC.201900828).
8. Kobayashi J., Shimizu Y., Mutaguchi Y., Doi K., Ohshi-ma T. // J. Mol. Catal., B Enzym. 2013. Vol. 94. P. 15-22 (DOI: 10.1016/j.molcatb.2013.04.013).
9. Nakajima N., Tanizawa K., Tanaka H., Soda K. // J. Biotech. 1988. Vol. 8. N 3. P. 243-248 (DOI: 10.1016/0168-1656(88)90006-5).
10. Galkin A., Kulakova L., Yamamoto H., Tanizawa K.,
вспомогательные ферменты (глюкозодегидроге-назу и (К)-2-гидроксиглутаратдегидрогеназу) для смещения равновесия и регенерации кофермента НАБН. Разработанная система была опробована с а-кетокислотами 2-оксобутиратом, 2-оксова-лератом и 2-оксо-4-фенилбутиратом для синтеза неприродных аминокислот - Б-гомоаланина, Б-норвалина и Б-гомофенилаланина. В результате каскада реакций в трехферментной системе при концентрациях субстратов 100 мМ Б-глутамата и 50 мМ а-кетокислоты выходы продуктов Б-гомоаланина и Б-норвалина составили 100% как при нейтральных, так и при слабощелочных рН, выход Б-гомофенилаланина составил 95% при нейтральных значениях рН. Однако при повышении концентрации субстратов до 500 мМ наблюдалось снижение выходов целевых Б-аминокислот, вероятно, в результате ингибиро-вания АшюоТА продуктами реакций, инактивации вспомогательных ферментов и закисления среды. В результате оптимизации условий проведения (К)-селективного аминирования удалось получить 435 мМ Б-гомоаланина, 320 мМ Б-норвалина и 47,5 мМ Б-гомофенилаланина. Энантиомерный избыток продуктов Б-аминокислот составил более 99,5%.
Tanaka H., Esaki N, Soda K. // J. Ferment. Bioeng. 1997. Vol. 83. N 3. P. 299-300 (DOI: 10.1016/S0922-338X(97)80997-X).
11. Slabu I., Galman J.L., Lloyd R.C., Turner N.J. // ACS Catal. 2017. Vol. 7. N 12. P. 8263-8284 (DOI: 10.1021/ acscatal.7b02686).
12. Guo F., Berglund P. // Green Chem. 2017. V. 19. N 2. P. 333-360 (DOI: 10.1039/c6gc02328b).
13. Dold S.M., Syldatk C., Rudat J. Transaminases and their applications. Green Biocatal (29). New Jersey, 2016. P. 715-746 (DOI: 10.1002/9781118828083.ch29).
14. Boyko K., Rakitina T., Korzhenevskiy D., Vlaskina A., Agapova Y., Kamashev D., Kleymenov S., Popov V // Sci Rep. 2016. N 6. P. 36366 (DOI: 10.1038/srep36366).
15. Pavkov-Keller T., Strohmeier G., Diepold M., Peeters W., Smeets N., Schurmann M., Gruber K., Schwab H., Steir K. // Sci. Rep. 2016. N 6. P. 38183 (DOI: 10.1038/ srep38183).
16. Yu X., Bresser J., Schall I., Djurdjevic I., Buckel W., Wang X., Engel P. // Anal. Biochem. 2012. Vol. 431. N 2. P. 127-131 (DOI: 10.1016/j.ab.2012.09.009).
17. Wang X., Saba T., Yiu H. P., Howe R. F., Anderson J.A., Shi J. // Chem. 2017. Vol. 2. N. 5. P. 621-654 (DOI:10.1016/j.chempr.2017.04.009).
18. Schätzle S., Steffen-Munsberg F., Thontowi A., Höhne M., Robins K., Bornscheuer U. T. // Adv. Synth. Catal. 2011. Vol. 353. N. 13. P. 2439-2445 (DOI: 10.1002/ adsc.201100435).
Информация об авторах
Шилова Софья Александровна - мл. науч. сотр. лаборатории инженерной этимологии Института биохимии имени А.Н. Баха Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук, аспирант кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова ([email protected]);
Ракитина Татьяна Владимировна - вед. инженер Курчатовского комплекса НБИКС - природоподобных технологий, ст. науч. сотр. лаборатории инженерной энзимологии Института биохимии имени А.Н. Баха Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук, канд. хим. наук ([email protected]);
Попов Владимир Олегович - академик РАН, науч. руководитель Федерального государственного учреждения «Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук», зав. лабораторией инженерной энзимологии Института биохимии имени А.Н. Баха Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук, докт. хим. наук, профессор ([email protected]);
Безсуднова Екатерина Юрьевна - ст. науч. сотр. лаборатории инженерной энзимологии Института биохимии имени А.Н. Баха Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук, докт. хим. наук ([email protected]).
Вклад авторов
Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации. Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Статья поступила в редакцию 28.11.2022; одобрена после рецензирования 01.12.2022; принята к публикации 05.12.2022.
