CC BY
45
УДК 771.36
© 2011: М.Г. Томилин, ФНИ «XXI век»
ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ НОВОГО ПОЛЯРИЗАЦИОННО-ОПТИЧЕСКОГО МИКРОСКОПА НА ОСНОВЕ ЖИДКИХ КРИСТАЛЛОВ В БИОЛОГИИ
М.Г. Томилин
Санкт-Петербургский государственный университет информационных технологий, механики и оптики,
Санкт-Петербург, Россия Эл. почта: [email protected] Статья получена редакцией 14.12.2010, принята к печати 5.09.2011
Показано расширение функциональных возможностей поляризационно-оптического микроскопа (ПОМ) за счет использования пространственного модулятора света на жидком кристалле (ЖК), представляющем в простейшем случае тонкий слой ЖК, наносимый на поверхность изучаемого объекта. Оптически анизотропный слой ЖК под воздействием полей поверхности может деформироваться, вызывая при прохождении поляризованного излучения сквозь него изменение интенсивности светового сигнала. Деформации слоя ЖК под воздействием физических полей на поверхности объекта могут происходить локально и протекать в реальном времени. Это позволяет рассматривать слои ЖК в схеме ПОМ как среды, осуществляющие пространственно-временную модуляцию излучения. Предпосылкой для визуализации распределения физических полей на поверхности объектов является исходная упорядоченность молекул ЖК. Эта упорядоченность может быть локально нарушена полями поверхности или дефектами, деформирующими слой. Основная идея применения слоев ЖК в ПОМ состоит в том, что при их деформации они выполняют функцию оптической реплики с большой величиной оптической анизотропии, осуществляющей фазовую задержку проходящего излучения. Возникшие деформации регистрируются в поляризованном свете на просвет или отражение в виде изображений изучаемых полей. Деформации слоя ЖК позволяют визуализировать распределение неоднородных полей различной физической природы, в том числе обеспечивающих межмолекулярные взаимодействия, а также электрических, магнитных и акустических полей. Приведены примеры, свидетельствующие о перспективности применения ПОМ с использованием ЖК для изучения поверхностей биологических объектов с целью диагностики злокачественных опухолей, вирусов гриппа, патологических явлений в эритроцитах, а также для визуализации распределения неоднородных электрических полей на поверхности биологических объектов
Ключевые слова: жидкий кристалл, поверхность, фазовая задержка, неразрушающий контроль.
PROSPECTS FOR BIOLOGICAL APPLICATIONS OF A NOVEL POLARISATION OPTICAL MICROSCOPE USING LIQUID CRYSTALS
M.G. Tomilin
Saint-Petersburg University of Informational Technologies, Mechanics and Optics, Saint-Petersburg, Russia
E-mail: [email protected]
The performance of polarisation optical microscopy is enhanced by supplementing it with a liquid crystal-based spatial modulator of light, which in its simplest form is a thin liquid cristal layer applied to the surface of an object to be examined. Rearrangements of the optically anisotropic LQ layer by different fields associated with the surface result in altered transmission properties of the rearranged areas. The rearrangements may occur locally and in real time. This makes it possible to visualize the spatiotemporal modulations of light. The prerequisite for visualization of physical fields at the surface of an object under examination is the initially ordered pattern of LQ molecules. This order may be locally disturbed by surface-associated forces and surface flaws. The main idea behind LQ use in polarization microscopy is that upon their deformation LQ can function as an optical replica featuring high optical anisotropy resulting in differential phase lag of the radiation that pass though them. The resulting patterns may be registered using transmitted or reflected polarized light. The forces visualized in this way include those involved in molecular interactions and produced by electric, magnetic and acoustic fields. This approach is exemplified with attempts to visualize differences between normal and transformed cells, influenza virus types, and normal and pathological erythrocytes and to observe patterns of anisotropic electric field distributions at biological surfaces. Keywords: liquid crystal, polarisation microscope, surface, phase lag, nondestructive control.
1. Введение
Появление новых методов исследования приводит к развитию новых областей знаний. Примером может быть развитие биологии, вызванное изобретением оптического микроскопа, и астрономии, вызванное изобретением оптического телескопа. Историю биологии разделяют на два этапа: до и после изобретения микроскопа. Такие ее фундаментальные разделы как микробиология, цитология, гистология обязаны своим развитием изобретению микроскопа. Оглядываясь на историю биологии XVII века, В.В. Лункевич назвал это время эпохой «завоеваний микроскопа» и привел яркое описание состояния Роберта Гука, охваченного в то время азартом открытий: «Нужно только представить себе человека умного, образованного, любознательного и темпераментного во всеоружии первого микроскопа, которым почти никто до него не пользовался и который дает возможность открыть совершенно новый, никем до того не виданный и никому не ведомый мир; нужно только перевоплотиться в такого человека, чтобы не только представить себе ясно, но и почувствовать и настроение Гука, и торопливую пестроту его наблюдений. Он бросался на все, что можно поместить на столик под объектив микроскопа; пусть это будут кончик тоненькой иглы или острие бритвы, шерстяная, льняная или шелковая нить, крошечные стеклянные шарики, радугой играющие под линзой микроскопа, частички тонкого песка, осадок в моче, зола растений или кристаллики различных минералов - не важно: все это ново, интересно, полно неожиданностей, чревато возможностью засыпать мир тысячью маленьких открытий» [1].
Первые световые микроскопы позволяли рассматривать лишь клеточное строение организмов, но не микроструктуру клетки. Поэтому на протяжении почти четырех веков основные усилия разработчиков микроскопов были направлены на увеличение их пространственного разрешения. Электронная микроскопия позволила далеко шагнуть за ограничения разрешающей способности оптической микроскопии. И каждый шаг в повышении пространственного разрешения сопровождался новыми открытиями.
Однако вся оптическая микроскопия имеет существенные ограничения, связанные с наблюдением лишь некоторых характеристик объекта. Она позволяет наблюдать либо распределение освещенности на поверхности непрозрачных объектов при работе на отражение, либо поглощение в частично прозрачных объектах при работе на просвет. Эти функции расширяются при изучении объекта в поляризованном свете, позволяя выявлять внутренние напряжения в прозрачном объекте, вызывающие преломление проходящего света, либо оптическую активность материала. Поляризационно-оптический микроскоп (ПОМ) является эффективным средством изучения объектов во многих областях современной науки и технологии. Анализ взаимодействия света с изучаемым объектом позволяет получить о нем ценную информацию, однако невидимые физические поля, распределенные на изучаемой
поверхности, остаются недоступными для наблюдения. Практические нужды ставят перед микроскопией новые задачи. Одной из них является проблема визуализации распределения физических полей на поверхности материалов и объектов. В большинстве практических случаев это связано с их дефектоскопией. Большой интерес к выявлению физических свойств поверхности проявляют ученые, работающие в медицине и биологии, при изучении патологических явлений.
В статье приводится описание схемы и принципа работы ПОМ, совмещенного с пространственным модулятором света на жидком кристалле (ПМС на ЖК), позволяющего визуализировать распределение физических полей на поверхности объектов, и рассмотрены перспективы его использования в биологии и медицине.
2. Схема и принцип действия поляризационно-оптического микроскопа с использованием жидких кристаллов
Особенность предлагаемого ПОМ состоит во введении в его оптическую схему нового ЖК элемента. В простейшем случае это тонкий слой ЖК, находящийся в контакте с объектом и являющийся регистрирующей средой. Введение в схему микроскопа регистрирующей среды на основе ЖК придает ему новые функции [2].
Наибольшей чувствительностью к внешним полям обладают нематические жидкие кристаллы (НЖК), не имеющие, в отличие от хо-лестерических (закрученных) и смектических (слоистых) ЖК, надмолекулярной структуры. Деформации слоя НЖК под воздействием физических полей на поверхности объекта могут происходить локально и протекать в реальном времени. Это позволяет рассматривать слои НЖК в схеме ПОМ как среды, осуществляющие пространственно-временную модуляцию света [3]. Предпосылкой для визуализации распределения полей на поверхности объектов является исходная упорядоченность молекул НЖК, которая может быть локально нарушена полями поверхности или дефектами, деформирующими слой. Возникшие деформации регистрируются в поляризованном свете на просвет или отражение. Основная идея применения слоев НЖК в ПОМ состоит в том, что при их деформации они выполняют функцию оптической реплики с большой величиной оптической анизотропии, осуществляющей фазовую задержку проходящего света. Деформацию могут вызывать ряд физических полей при контакте слоя НЖК с поверхностью объекта: поля сил межмолекулярных взаимодействий, электрические, магнитные, акустические и другие. Это делает предлагаемый метод регистрации полей универсальным и не зависящим от природы изучаемой поверхности. Распределение и величина локальных фазовых задержек в поле зрения ПОМ соответствуют распределению и интенсивности исследуемого поля на поверхности объекта. Задание деформации осуществляется в сверхтонком приповерхностном слое НЖК, который транслирует
Рис. 1. Слева: оптическая схема ПОМ: 1 - источник белого света, 2 - коллектор, 3 - диафрагма, 4 - зеркало, 5 -поляризатор, 6 - конденсор, 7 - объект, 8 - ЖК ПВМС, 9 - микрообъектив, 10 - анализатор, 11 - светоделительная призма, 12 - объектив цифровой камеры, 13 - ПЗС-камера, 14 - компьютер, 15 - призма, 16 - диафрагма, 17 - окуляр. Справа: примеры деформации слоя НЖК при его контакте с объектом для характерных случаев: А - дефект микрорельефа, Б - структурный дефект, В - локальное электрическое или магнитное поле.
двумерную локальную ориентацию в толщу слоя. Граница раздела «поверхность - НЖК» выполняет функцию «командного слоя», а происходящие в ней явления имеют наноразмерную шкалу. Для накопления фазовой задержки, достаточной для визуализации деформаций (а значит и изучаемых полей), используют слои НЖК толщиной порядка 1 мкм. Подчеркнем, что ПОМ визуализирует не поля, распределенные на поверхности объекта, а их реплику в слое НЖК за счет его деформаций под действием физического поля (или локальных дефектов) объекта.
Принцип работы нового ПОМ при работе на просвет показан на рис. 1. Источник излучения 1 через коллектор 2 и зеркало 4 направляет свет в конденсор 6, перед которым расположен поляризатор 5. Прошедший через конденсор свет освещает объект 7. Изучаемый объект находится в контакте со слоем НЖК 8. Изображение деформированных слоев ЖК (не объекта!) строится в фокальной плоскости микрообъектива 9, пройдя через анализатор 10. Увеличенное изображение либо рассматривается через окуляр 17, либо проецируется объективом 12 на регистрирующую матрицу ПЗС-камеры 13 и анализируется на экране компьютера 14. Разделение пучков обеспечивается призмой 11.
Отличие нового ПОМ от предшествовавших моделей состоит во введении в его оптическую схему нового ЖК элемента.
Возможны различные способы осуществления контакта ЖК с объектом: нанесение свободного слоя НЖК на поверхность (рис. 1А, Б), размещение НЖК в зазоре между поверхностью объекта и прозрачным электродом (рис. 1В), погружение объекта в слой НЖК. В ЖК ячейке при размещении электродов ортогонально оптической оси ПОМ возможно изучение динамики переноса потока НЖК с повышенной проводимостью. Как видно из рис. 1, деформация слоя НЖК позволяет визуализировать локальные дефекты микрорельефа, структурные неоднородности, распределения неоднородных электрических и магнитных полей, а также механические напряжения, не наблюдаемые в обычный оптический микроскоп. При выведении из оптической схемы слоя НЖК, поляризатора или анализатора наблюдатель теряет возможность регистрировать фазовую задержку. Это наглядно выявляет тот вклад в изображение, который привносит деформированный слой НЖК (рис. 2). В англоязычной литературе этот метод визуализации невидимых физических полей и дефектов был кратко назван LC vision [4].
Наибольший интерес вызывает возможность визуализации структурных неоднородностей на поверхности и распределения невидимых физических полей. Именно этим направлениям уделено основное внимание в дальнейшем изложении. Описанный принцип можно рассматривать как новый метод декорирования поверхностей, ранее развиваемый отечественной школой исследователей применительно к задачам электронной микроскопии [5].
3. Теория визуализации распределения неоднородных физических полей методом НЖК
В основе метода визуализации лежит проявление общих закономерностей межмолекулярных взаимодействий твердого тела и ЖК, которые носят в основном дисперсионный диполь-диполь-ный характер и очень чувствительны к изменению свойств поверхности. Дефект поверхности можно представить как локальный скачок энергии связи молекул ЖК с подложкой, приводящий к локальной переориентации слоя ЖК. В общем случае интенсивность света I (х, у), проходящего через деформированный слой НЖК и строящего изображение визуализируемых полей, описывается уравнением:
1(х,у)=1о5тЩх,у)/2] (1)
Фазовая задержка 8(х,у), вызванная двулучепре-ломлением слоя НЖК, равна: Г н
д(х,у) = -п0 • Н + |п(х,у,z^ (2)
I 0 _
Здесь Н - толщина слоя НЖК; п(х,у) - показатель преломления для необыкновенного луча; п0 -для обыкновенного луча.
При отсутствии твистовой (закрученной) деформации возникает только деформация изгиба, и показатель преломления описывается уравнением:
n(x,y,z)=[n -2sin2q(x,y,z) +n-2cos2q(x, y, z)]
-1/2
(3)
Рис. 2. Слева: в поляризованном свете наблюдается не невидимый структурный дефект D, а деформации слоя НЖК D', вызванные дефектом. Справа: в неполяризованном свете невидимый структурный дефект D наблюдается сквозь тонкий прозрачный слой ЖК, и поэтому не наблюдаем.
.К x y) -Va
Y Y
sh(D - X )ctg — Sh(D + X)ctg-
■■ arctg—jj^———^ + arctg—^———p-; (4)
ch(D - X) + 1
ch(D - X) + 1
Здесь ф(х, у, z) - угол отклонения длиной оси молекул от нормали к поверхности; п0, пе - главные показатели преломления НЖК для необыкновенного и обыкновенного лучей.
Значения величин оптической анизотропии находятся в диапазоне 0,05...0,2, хотя предельные значения превышают величину 0,4. Это означает, что даже малые угловые отклонения директора НЖК позволяют получать значительную фазовую задержку света, а значит осуществлять регистрацию. Теория деформации слоев НЖК вблизи структурных дефектов или под действием электрических и магнитных полей описана в работах [6, 7].
Практически интересный случай визуализации структурных неоднородностей на поверхности различных материалов, включая и биологические, показан на рис. 1Б. Теория позволяет определить распределение углов ориентации молекул НЖК вблизи структурного дефекта (рис. 3). Ориентация молекул НЖК в окрестности структурного дефекта описывается уравнением (4):
х = п у = П в = П
Н и' н'
Разработанная теория используется для интерпретации получаемых экспериментальных результатов по визуализации структурных дефектов на поверхности различных объектов, в том числе и биологических. Она позволяет также рассчитать величины воздействующих на ЖК слои физических полей.
4. Перспективы исследования свойств поверхности биологических объектов
Описанный метод прошел широкую апробацию при изучении поверхности твердых кристаллов, минералов, полупроводников, полимерных материалов, оптических покрытий и стекол [3]. Ниже рассматриваются примеры возможности использования поляризационно-оптического микроскопа с НЖК для визуализации невидимой структуры поверхности ряда биологических объектов: гистологических срезов эпителиальных тканей при воспалительных процессах; злокачественных опухолей; проявлений взаимодействия антител и вирусов гриппа; патологических изменений
Рис. 3. Обособленный ориентационный дефект с наклоном молекул ф0.
в эритроцитах человека. В особый раздел выделено изучение распределений неоднородных электрических полей на поверхности биологических объектов. Эти примеры следует рассматривать не как завершенные биологические исследования, а как иллюстрации, свидетельствующие о перспективности нового метода в биологии и медицине.
4.1. Изучение структурных неоднородностей в гистологических срезах тканей человека
Объектами исследования были образцы срезов кожи человека с хроническим воспалением в дерме и реактивным утолщением покрывающего ее эпидермиса. Для микроскопических исследований срезы тканей обычно либо замораживают прямо на микротоме, либо заливают в парафиновые блоки. После этого срезы окрашивают красителями для распознавания клеточных органелл. Декорирование парафиновых срезов тканей слоем НЖК оказалось неэффективным, поскольку декорируется не сама ткань, а пропитавший ее парафин. Поэтому изучались срезы фиксированной в формалине и замороженной ткани, помещенной на предметное стекло без покровного стекла. Срезы окрашивались гематоксилином и эозином [8]. Результаты представлены на рис. 4. Традиционная методика дает изображение структуры
ткани с различимыми клетками эпидермиса, одинаково воспринимающими окраску, т.е. обладающими однотипными свойствами. При декорировании того же препарата слоем НЖК видно, что в поверхностных слоях эпидермиса клетки имеют иной вид, чем в базальных. Эта картина воспроизводится при многократном смывании НЖК растворителем (спирт, ацетон) и повторном нанесении НЖК. В базальном слое эпидермиса расположены наиболее молодые клетки, а в приповерхностном, куда клетки перемещаются по мере их созревания, - наиболее зрелые. При созревании клеток в их цитоплазме происходит накопление кератина. По завершении жизненного цикла поверхностные клетки превращаются в роговые чешуйки. С помощью НЖК выявлены изменения, свидетельствующие о том, что при хроническом воспалении кожи утолщение эпидермиса происходит за счет базального росткового. При этом видны отличия в соотношении зрелого и незрелого слоев клеток эпидермиса на разных участках, которые не заметны при оптической микроскопии обычного микропрепарата. Таким образом, НЖК позволяют получать новую информацию о структуре биологических тканей в норме и при патологических изменениях.
4.2. Применение НЖК в онкологии
Использование ПОМ с ЖК показало, что молекулы определенных классов НЖК, например п - метоксибензилиден -п'- бутиланилина (МББА), ориентируются гомеотропно на поверхности срезов злокачественных опухолей, в то время как на поверхности срезов здоровых тканей имеют планарную или наклонную ориентацию [9, 10] (рис. 5). Области срезов со злокачественными опухолями при наблюдении в поляризационный микроскоп при скрещенных поляризаторе и анализаторе выглядят темными, а здоровые ткани -светлыми или окрашенными в различные цвета.
Как известно, если поверхностное натяжение НЖК (у[£) больше, чем поверхностное натяжение подложки (у[с>у5), молекулы НЖК ориентируются гомеотропно; если у[Г<у5, молекулы НЖК ориенти-
Рис. 4. Микрофотографии срезов кожи человека, полученные с использованием обычного оптического микроскопа (слева) и с помощью ПОМ с ЖК ПВМС (справа). МББА:ЭББА. Т = 20°С. 300х.
Рис. 5: а - фотография границы аденокарциномы прямой кишки - (слева) и окружающей здоровой ткани (справа), выявленной НЖК; б - модель ориентации молекул НЖК на злокачественной и здоровой ткани.
руются планарно или наклонно [11]. Обнаруженное явление было использовано как новый критерий для диагностики злокачественных опухолей в Санкт-Петербургской Военно-медицинской академии [12, 13] и послужило основой для предположений о причинах различной ориентации молекул НЖК на злокачественной и здоровой ткани и для новых гипотез о механизме инвазии злокачественных опухолей. Изучение характера декорирования 220 срезов тканей животных и человека с различными патологискими нарушениями (в 130 случаях имелись различные виды злокачественных новообразований) подтвердило специфичность наблюдавшихся особенностей в ориентации молекул НЖК для злокачественных опухолей.
Для расчета поверхностного натяжения на границе «поверхность - пар» YSV злокачественных и здоровых тканей использовалось уравнение Янга и Ньюмана. Экспериментальные данные для МББА при Т=20°С составляют 30 дин/см2. Согласно измерениям ysv тканей, выполненным теневым методом, и расчетам: ysv=26 дин/см2 для злокачественных опухолей, Ysv=32 дин/см2 для здоровых тканей (при точности измерений 0,5 дин/см2). Эксперименты с 11 типами тканей человека показали, что контактный угол смачивания на поверхности здоровых тканей на 30% больше, чем у злокачественных. Таким образом, различия в ориентации ЖК на злокачественных и здоровых тканях объясняются различием поверхностного натяжения. Это было подтверждено в экспериментах in vivo при анализе мазков злокачественной ткани мыши (рис. 6) [14].
Причины различного поверхностного натяжения злокачественных опухолей и здоровых тканей могут быть связаны с тем, что оно в срезах биологических тканей определяется свойствами тонкой границы, заключенной между собственно тканью и слоем
Рис. 6. Мазок ткани мыши, декорированный МББА (темная область) in vivo. 25x.
НЖК, выполняющей функцию командного слоя. По своей природе это слой воды, структурированной клеточными коллоидами (преимущественно белковыми) и напоминающей строение ЖК вследствие связывания молекул воды водородными связями. Толщина такого слоя 100-10000 А. Было выявлено, что на поверхности срезов злокачественных опухолей слой структурированной воды имеет больший параметр порядка и большую толщину по сравнению со здоровой тканью. Это свойство можно объяснить более высоким содержанием белков в мембранах злокачественных клеток. Поэтому энергия сцепления молекул НЖК с поверхностью срезов злокачественных опухолей оказывается выше энергии сцепления со срезами здоровой ткани (рис. 7). По этой причине над клетками злокачественной опухоли НЖК имеет гомеотропную ориентацию по всей толщине слоя НЖК (~1,0 мкм), а над клетками здоровой ткани гомеотропная ориентация распространяется на меньшую толщину слоя НЖК, значения которой колебались, в зависимости от вида ткани, от 0,1 до 0,3 мкм. При удалении от границы гомеотропная ориентация переходит в планарную. Наблюдаемое изменение ориентации известно как локальный переход Фредерикса [3] и идентифицируется в проходящем поляризованном свете в виде светлой или окрашенной области. Метод НЖК в изучении свойств злокачественных опухолей позволяет выявить новые аспекты в проблеме ракового роста и метастазирования. Можно предположить, что скорость роста и метастазирование зависят от кооперативных динамических изменений между показателями поверхностного натяжения клеток опухоли (и ее метастазов) и клеток окружающих тканей. Эта гипотеза может иметь отношение к причинам избирательности метастазов злокачественных опухолей, например, часто наблюдаемого отсутствия метастазов сарком в лимфатических узлах.
Рис. 7. Модельное представление о влиянии структурированности воды в пограничном слое на характер ориентации молекул НЖК на поверхности среза злокачественной опухоли и на границе со здоровой тканью.
Одним из ограничений рассмотренного выше диагностического подхода является необходимость получения срезов ткани. В этой связи представляет интерес изучение объектов исследования, получаемых без инвазивного вмешательства, например, мочи. Результаты исследования образцов мочи пациентов, страдающих заболеваниями мочеполовых путей, приведены на рис. 8 а, б. Анализ распределения ядер в осадках мочи, выявленный с помощью НЖК и сопоставленный с традиционным урологическим исследованием, позволил отнести пациентов к группе риска прогрессирующего развития злокачественных опухолей. Индикатором служили области гомеотропной ориентации НЖК (темные зоны). Полученные результаты открывают возможности для структурного анализа патологических нарушений в организме без хирургического вмешательства при анализе других биологических жидкостей [15].
4.3. Применение НЖК для диагностики вирусов гриппа
Существующие методы диагностики вирусов гриппа основаны на визуализации взаимодействия вирусов с антителами с помощью красителей и флуоресцентных меток. Однако они не позволяют непосредственно наблюдать модификации вирусов гриппа, являются трудоемкими и требуют несколько дней для завершения. Результаты модификация этого метода с использованием НЖК [16] в применении к препаратам, полученным из Института вирусологии им. Д.И. Ивановского (Москва), приведены на рис. 9.
Препараты помещались на стеклянную подложку, на которую наносился слой НЖК. В случае взаимодействия несоответствующих структур вируса и антитела комплементарная реакция не происходит. При совпадении структур происходит комплементарная реакция, о чем свидетельствует возникновение кристаллоподобной сегментной структуры (рис. 9в).
В случае несоответствия структур вируса и антитела наблюдается мозаичное изображение,
состоящее из небольших блоков нерегулярной формы. В случае взаимного соответствия структур возникает изображение регулярных блоков с симметрией 6-го порядка (рис. 10), где отчетливо наблюдаются центры взаимодействий вируса и антитела.
Такие же результаты были независимо получены в Санкт-Петербурге в Институте гриппа (рис. 11). Некоторые различия в изображениях, представленных на рис. 10 и 11, объясняются разными масштабами увеличения. С помощью нового ПОМ можно непосредственно наблюдать проявления взаимодействия антитела и вируса. Центры взаимодействия видны как вершины многоугольников, в то время как блоки можно представить как области смежных взаимодействий. Области взаимодействия по площади во много раз больше размеров центров взаимодействия. Это объясняет тот факт, что области взаимодействия различимы при наблюдении в оптический микроскоп, хотя размеры собственно вирусов составляют величину менее 0,1 мкм.
Таким образом, поляризационно-оптический микроскоп с использованием НЖК при сравнении со спектроскопическим и флуоресцентным методами открывает новые возможности в идентификации типов вирусов и их модификаций.
4.4. Выявление патологических изменений в эритроцитах
Изучение вязкоупругих свойств эритроцитов может быть полезным при установлении, например, ранней стадии лейкемии, малярии, допустимых физических нагрузок на пациента. При этом главным параметром оказывается деформируемость эритроцитов, от которой зависит характер их перемещения по капиллярам сосудов. Для выявления патологических нарушений в эритроцитах были разработаны различные методы, основанные на выявлении различий упругости их мембран в норме и при патологических изменениях. Нами предложено использовать для этих целей метод НЖК [15].
Рис. 8. Результаты структурного анализа осадка мочи при раке мочеточника (а) и раке почек (б). МББА. Т=20°С. 100х.
Рис. 9. Визуализация взаимодействия вируса с антителом: а - образец вируса гриппа А (слева - с нанесенным слоем НЖК, справа - без слоя НЖК); б - образец структуры «вирус А - антитело В» (слева - с нанесенным слоем НЖК, справа - без слоя НЖК); в - образец структуры «вирус В - антитело В» (слева - с нанесенным слоем НЖК, справа - без слоя НЖК). МББА:ЭББА. Размер наблюдаемой поверхности 280 мкм в диаметре. Т=20°С.
Если на мазок крови, размещенный на стеклянной подложке и высушенный без доступа загрязнений на открытом воздухе, нанести тонкий слой НЖК, то при наблюдении такого препарата в ПОМ будет получена картина, приведенная на рис. 12. Исходно здоровые эритроциты имеют овальную форму, однако в НЖК матрице при взаимодействии с анизотропными молекулами НЖК они деформируются, принимая форму прямоугольников. Причиной этого является анизотропия межмолекулярного взаимодействия в системе. В то же время эритроциты с патологией принимают нерегулярную конфигурацию, что объясняется нарушением их деформируемости. Возникновение прямоугольной формы у мембран эритроцитов было подтверждено методом лазерной дифракции. Предложенный подход может использоваться как экспресс-метод для диагностики патологических изменений в эритроцитах.
5. Визуализация распределений неоднородных электрических полей на поверхности биологических объектов
Принцип визуализации неоднородных электрических полей для отображения информации реализуется в плоских дисплеях. При решении задач
Рис. 10. Картина проявлений взаимодействия комплементарных структур вируса и антитела на всей поверхности препарата, визуализированная с помощью эвтектической смеси МББА:ЭББА. Размер наблюдаемой поверхности 280 мкм в диаметре. Т=20°С.
Рис. 11. Картина следов взаимодействия комплементарных структур вируса В и антитела В на поверхности препарата без полианилинового слоя. МББА:ЭББА. Т=20°С. 500х.
дефектоскопии с применением ПОМ достигнуты положительные результаты при визуализации структурных неоднородностей полупроводниковых материалов, дефектов в диэлектрических слоях, доменной структуры в сегнетоэлектричес-ких материалах. Полученные результаты позволяют распространить использование нового ПОМ на изучение поверхности биологических объектов.
За последние полвека получил развитие метод газоразрядной визуализации (ГРВ). Он основан на регистрации изображения приповерхностных электрических полей объектов живой и неживой природы при разряде в конденсаторе. Изображения возникают при воздействии высоковольтных полей (десятки кВ) высокой частоты (десятки кГц) при возбуждении молекул воздуха или газа, сопровождаемом излучением фотонов при их возвращении из возбужденного состояния в невозбужденное [17]. Сам метод является вполне строгим в физическом смысле, однако наблюдаемые поля интерпретируются его разработчиками как имеющие особую природу, присущую только живым организмам. Независимо от дискуссий по этому вопросу (см. [18]), воздействия высоковольтных полей могут изменять поверхностные свойства объектов. Низковольтные электрооптические эффекты можно наблюдать с помощью предложенного нами оптического метода детектирования электрических полей биологических объектов, основанного на применении в НЖК. В качестве примера, объектом исследования был выбран человеческий волос диаметром около 10 мкм, помещенный в полость электрооптической ЖК ячейки с толщиной слоя НЖК 80 мкм. Такая толщина слоя НЖК позволяет исследовать электрический рельеф на поверхности объектов при малых напряжениях внешнего электрического поля. ЖК ячейка представляла собой электролитический конденсатор с НЖК, размещенным между разделенными прокладками плоскопараллельными стеклянными подложками, на внутренней стороне которых нанесен прозрачный токопроводящий слой. Подложки склеивались по периметру. На поверхности подложек задавалась планарная ориентация НЖК. ЖКЯ
заполнялась материалом ЖК-1289 (Дп=0,169; Ае>0) разработки НИИОПиК (Москва). Удельная электропроводность составляла величину — 1-10-13 Ом-!см_1. Исследовались три ЖК ячейки, в каждую помещалось по три образца волоса параллельно направлению ориентации. Волосы размещались в средней части ячейки. Они принадлежали молодому человеку, не были ни окрашены, ни подвержены болезни.
Методика эксперимента была основана на наблюдении в поляризованном свете эффекта переориентации молекул НЖК в ячейке вблизи биологического объекта при приложении внешнего напряжения. Источником питания служил генератор низкочастотного напряжения. Измерительная установка содержала ПОМ с исследуемой ЖК ячейкой на рабочем столе и цифровой камерой, генератор низкочастотного напряжения и вольтметр. Наблюдения производились в режиме на просвет; регистрация статических и переходных динамических процессов переори-
Рис. 12. Изображение эритроцитов в НЖК матрице: в слое НЖК эритроциты без патологий имеют прямоугольную форму, а вне зоны НЖК - овальную; эритроциты с патологией в слое НЖК имеют иную деформированную конфигурацию. НЖК -5ЦБ, Т=20°С. 250х.
Рис. 13. Изображение деформированного слоя НЖК в одной из ЖКЯ в зоне волоса через день после срезания, наблюдаемое в поляризованный микроскоп. а: и = 0 В; б: и = 10 В, f = 1 Гц, ¿жк/d = 3,25±0,15.
ентации слоя НЖК осуществлялась цифровой фотокамерой. На экране дисплея наблюдались с высоким цветовым контрастом и измерялись размеры волоса и деформированного слоя НЖК вокруг него [19]. Метод основан на деформации слоя НЖК в неоднородном поле. Особенностью изучаемого биологического объекта является наличие собственного электрического поля. Возникающая зона деформации НЖК в окрестности волоса вызвана суперпозицией поля биологического объекта и внешнего электрического поля.
Эксперименты дали следующие результаты. В отсутствие внешнего электрического поля в окрестности волоса наблюдалась небольшая деформация слоев НЖК, вызванная влиянием поверхности на ориентацию прилегающих слоев. Выявлялись дефекты рельефа поверхности волоса и его формы (рис. 13а). Диаметр зоны деформации НЖК dжк измерялся и сопоставлялся с диаметром волоса d. Область деформации dжк в отсутствие внешнего поля (и=0) составляла в среднем величину 1^. При подаче напряжения 2 В в диапазоне частот 1-10 Гц область деформации слоя НЖК вблизи волоса увеличивалась за доли секунды. С увеличением напряжения область деформации плавно возрастала. Измерения проводились для напряжения 10 В на частоте 1 Гц. При этих условиях более четко наблюдалась граница области деформации НЖК. В начальный момент времени область деформации dжк для свежесрезанного («живого») волоса имела величину 3^ (рис. 13б).
Исследовалась зависимость dжк от времени. Обобщенные результаты исследований для трех ячеек приведены на рис. 14. Со временем величина dжк плавно уменьшалась и на 9-й день после срезания достигала в среднем величины 2^. Такую же величину dжк имели образцы волоса после года хранения (рис. 14, кривая 4) или после температурного воздействия в 120°С, убивающего
живую ткань (рис. 14, кривая 5) [19]. После 9-го дня дальнейшее уменьшение деформированной зоны не зарегистрировано.
Полученные результаты были сопоставлены с результатами исследования интенсивности свечения волоса методом ГРВ [22]. Изменение интенсивности свечения волоса человека во време-
¿жк/Ы
' 1
—± -т- зТ к
5 ! —- - •—
I—
\ 6
дни 1
40
Рис. 14. Обобщенные результаты исследований деформированных областей ЖК для различных объектов и условий проведения экспериментов в течение времени (в днях): 1, 2, 3 - зависимость dжк/d для 3-х ЖКЯ при и = 10 В, f = 1 Гц;
4 - зависимость ¿жк/d для ЖКЯ при и = 10 В, f = 1 Гц через год после срезания волоса;
5 - зависимость ¿жк/d для ЖКЯ при и = 10 В, f = 1 Гц после температурного воздействия на образец в 120°С;
6 - зависимость ¿жк/d для ЖКЯ в отсутствие электрического поля; деформация вызвана воздействием поверхности образца.
Рис. 15. Изменение интенсивности свечения волоса человека во времени для двух образцов после их срезания с головы испытуемых. По данным К.Г. Короткова, полученным методом ГРВ. А - первый образец, Б - второй образец.
ни для двух образцов после момента их срезания с головы испытуемых показаны на рис. 15. Характер зависимостей, представленных на рис. 14 и 15, совпадает. Полученные результаты свидетельствуют о возможности применения ЖК для визуализации биологических полей объектов и их динамики во времени.
Высокая чувствительность и пространственная разрешающая способность, низкие затраты времени, неразрушающее воздействие на объект, простота и низкая стоимость являются основанием для дальнейшего применения метода НЖК в изучении приповерхностных электрических полей других биологических объектов [20]. Преимущество предложенного метода состоит в использовании низковольтных электрооптических эффектов в НЖК, не вызывающих заметных изменений свойств изучаемых объектов. Достоинством метода является возможность определять значения собственных электрических полей биологических объектов, основанная на теории электрооптических эффектов в НЖК. Применение НЖК для изучения полей живых и неживых объектов малых
размеров, а также границы между живой и неживой тканью открывает возможности для его дальнейшего использования в биологии и медицине.
5. Заключение
Приведенные примеры свидетельствуют о широких возможностях применения поляризаци-онно-оптической микроскопии на основе НЖК в биологии и медицине. Предложенный метод позволяет изучать структуры самых различных объектов, является сравнительно простым, не требует больших затрат времени, обладает высокой чувствительностью к воздействиям на изучаемые объекты и высоким пространственным разрешением. ПОМ на основе НжК позволяет по результатам экспериментов и развитой теории определять параметры внешних воздействий на слой НЖК и может расширить возможности диагностики, дополнив спектральные и люминесцентные методы.
Автор благодарит студентку Санкт-Петербургского института информационных технологий, механики и оптики Е.Б. Иванову за участие в проведении ряда экспериментов.
Литература
1. Лункевич В.В. От Гераклита до Дарвина. Очерки по истории биологии. - М., 1960. - С. 46.
2. Томилин М.Г., Барсуков О.А. Новый поляризационный микроскоп с расширенными функциональными возможностями // Опт. и спектр. - 2010. - № 1. - С. 122-128.
3. Томилин М.Г. Взаимодействие жидких кристаллов с поверхностью. - СПб.: Политехника, 2001. - 325 с.
4. Tomilin M.G. LC vision // Optical information processing. SPIE // 1993. - Vol. 2051. - P. 286-294.
5. Дистлер Г.И., ВласовВ.П., Герасимов Ю.М., Кобзарева С.А. Декорирование твердых поверхностей. - М.: Наука, 1976. - 111 с.
6. Аэро Э.Л., Томилин М.Г. Применение ЖК для неразрушающего контроля оптических материалов, деталей и изделий // Журнал ОМП. - 1987. - № 8. - С. 50-69.
7. Аэро Э.Л. Электро- и магнитооптические эффекты в криволинейных областях, заполненных НЖК / / Опт. и спектр. - 1995. - Т. 79, вып. 2. - С. 320-328.
8. Томилин М.ГГ, Повзун С.А. Применение ЖК для декорирования структурных неодно-родностей в гистологических срезах тканей человека // Опт. журн. - 1998. - Т. 65, № 7. -С. 58-59.
9. Томилин М.Г., Повзун С.А., Киланов А.А. Применение нематиков для оптической диагностики злокачественных опухолей // Опт. журн. - 1999. - Т. 66, № 1. - С. 141-144.
10. Tomilin M.G., Kilanov A.A., Povzun S.A. The use of nematics for optical diagnosis of malignant growth // Mol. Cryst. Liq. Cryst. - 1999. -V. 41. - Р. 341-346.
11. Kahn F.J., Taylor C.N., Shonhorn H. Surface-produced alignment of LCs // Proceed. IEEE. -1973. - Vol. 61. - P. 823-829.
12. Tomilin M.G., Povzun S.A., Gribanova E.V., Efimova T.A. New criterion of cancer detection based on NLC molecules orientation // Mol. Cryst. Liq. Cryst. - 2001. - Vol. 367. - P. 133-141.
13. Томилин М.Г., Повзун С.А., Грибанова Е.В., Ефимова Т.А. Исследование с помощью нематиков поверхностного натяжения тканей с целью диагностики злокачественных опухолей // Опт. журн. - 2001. - Т. 6, № 9. - С. 73-77.
14. Томилин М.Г., Курмашов А.Ф., Повзун С А.. Использование НЖК для диагностики злокачественных опухолей / / Жидкие кристаллы и их практическое использование. - 2004. - Вып. 2. - С. 86-90.
15. Томилин М.Г. Новый поляризационно-оптический микроскоп на основе жидкокристаллического пространственно-временного модулятора света и его применения. Методическое пособие. - СПб.: СПбГИТМО. 2009. - 115 с. (window.edu.ru/window/library/pdf2txt?p... -)
16. ИвановВ.Ф., ИвановаВ.Т., РакутинаР.О., ИсаковаА.А., Томилин М.Г., Яблоков М.Ю. Оптический метод диагностики вирусов гриппа на основе НЖК // Опт. журн. - 2006. - Т. 73, № 8. - С. 90-92.
17. Коротков К.Г. Основы ГРВ биоэлектрографии. - СПб.: СПбГИТМО, 2001. - 360 с.
18. Томилин М.Г. Кирлиан-эффект: физика и метафизика / / Машины и механизмы. -2008. - № 1. - С. 28-33.
19. Иванова Н.Л., Коротков К.ГГ, Томилин М.Г. Оптические исследования волоса человека с помощью ЖК / / Труды VII Межд. конференции «Прикладная оптика 2006». СПб., 2006. -Т. 4. - С. 131-134.
20. Tomilin M.G. How to display biological objects E-field // Abstract of SID-ME Chapter Spring Meeting 2008, March 13-14, 2008. Abbe Center, Beutenberg Campus, Jena, Germany.
