CC BY
580
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Сухих А.С., Кузнецов П.В.
Кемеровская государственная медицинская академия,
г. Кемерово
ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ ГУМИНОВЫХ И ГУМИНОПОДОБНЫХ КИСЛОТ В МЕДИЦИНЕ И ФАРМАЦИИ
В обзоре отражены основные направления разработки пелоидопрепаратов на основе гу-миновых кислот. Рассматривается возможность самостоятельного использования гуми-ноподобных веществ как альтернативы гуминовым кислотам. Обобщены известные медико-биологические эффекты гуминовых кислот и гуминоподобных веществ. Показаны современные методы очистки и фракционирования гуминовых и гуминоподобных веществ, позволяющих сохранить их нативные свойства.
Ключевые слова: гуминовые кислоты, биостимуляторы, пелоидопрепараты.
Sukhikh A.S., Kuznetsov P.V.
Kemerovo State Medical Academy,
Kemerovo
PROSPECTS OF APPLICATION HUMIC AND HUMIC-LIKE ACIDS IN MEDICINE AND PHARMACY
In the review the basic directions of development peloid preparations on a basis humic acids are reflected. The opportunity of independent use humic-like substances as alternatives humic acids is considered. Known medical and biologic effects humic acids and humic-like substances are generalized. Modern methods of clearing both фракционирования humic and hu-mic-like the substances are shown, allowing to keep them нативные properties.
Key words: humic acids, biostimulators, peloidpreparations.
Гуминовые кислоты (ГК) — гетерополимеры суп-рамолекулярного строения, являются составной частью объектов природного происхождения (лечебные грязи (ЛГ) илового и сапропелевого типов, торфяные и угольные ископаемые) и обладают достаточно разнообразной биологической активностью [17, 41]. В последнее десятилетие сформировалась необходимость разработки на основе ЛГ таких препаратов, которые, сохраняя высокую терапевтическую активность нативных грязей, освобождены от негативных сторон классической пелоидотерапии. Большинство хорошо известных пелоидопрепаратов (ФиБС, Гумизоль, Торфот и др.) производятся теперь зарубежными фирмами.
Так как ГК являются составной частью объектов природного происхождения, в настоящее время одним из ведущих направлений развития исследований является изучение физико-химических, биохимических
Корреспонденцию адресовать:
Сухих Андрей Сергеевич,
650029, г. Кемерово, ул. Ворошилова, 22а, ГОУ ВПО «Кемеровская государственная медицинская академия», тел. раб. 8 (3842) 73-48-72.
аспектов их строения и активности с целью получения новых высокоэффективных пелоидопрепаратов. Одной из главных проблем на пути разработки теории и практики применения пелоидопрепаратов является недостаточная изученность ГК (как компонентов пелоидов), которые обуславливают их терапевтическую эффективность [3, 37]. С другой стороны, обнаруживаемые в нативных пелоидах антропогенные загрязнители могут быть отсепарированы только в процессе высокотехнологичной переработки при выделении физиологически активных компонентов [2]. Препараты ГК являются альтернативными для лиц с противопоказаниями к нативному грязелечению, а создание оригинальных фармакотерапевтических препаратов с противовоспалительными, биостимулирующими и репаративными свойствами, средств для косметологии на основе ГК и гуминоподобных веществ (ГПВ) остаётся актуальным и приоритетным направлением исследований мировой науки. Достаточно перспективным подходом, позволяющим устранить дефицит качественных ЛГ для нужд бальнеотерапии, является использование региональных ресурсов. В этом контексте экономически обоснованным и перспективным является разработка препаратов на основе ГК из местных источников, а также разработка альтернатив-
Мп 1 nnnn СууШтна
10 № 1 2009 в Кузбассе
ных препаратов, содержащих ГПВ, из таких природных объектов, как гриб чага (1попо1ш оЬ^иия (Реге.)), мумие, гидролизованный лигнин [33].
Комплексные исследования донных отложений внутриконтинентальных озер в Сибирском регионе, как альтернативного источника биологически активных веществ (БАВ) морских отложений, в том числе и источника ГК, были начаты в 1987 году, согласно постановлению Совета Министров по теме «Создание высокоэффективных лекарственных препаратов на основе каустобиолитов (нефтей, торфа и липидов озёрных отложений)» [8]. В настоящее время, исследования по разработке лекарственных препаратов на основе ГК ведутся в разных регионах Сибири: Кемеровской [33], Омской [14], Тюменской [35], Томской [16, 34] областях. Сумма финансирования проектов дополнительно подтверждает стратегическую перспективность исследований данной группы веществ природного происхождения. Так, например, по региональной целевой программе «Омский сапропель» на исследования БАВ местного сапропеля и разработку препаратов на его основе привлекается около 35 млн. руб. [14]. Вместе с высокой биологической активностью, не уступающей нативному грязелечению (традиционная пелоидотерапия), применение препаратов на основе БАВ ЛГ вносит существенные экономические преимущества. Так, по данным [27], на одну бальнеопроцедуру расходуется 50 кг нативной грязи, тогда как на одну процедуру преформированной пелоидотерапии (при полиартрите) расходуется около 40 мл препарата.
Физиотерапевтам давно известно, что ЛГ различного типа отличаются по терапевтическим эффектам. Однако было установлено, что ГК, выделенные из различного типа ЛГ, характеризуются практически одним и тем же набором функциональных групп органического вещества, а отличительным параметром является их отношение в количественном содержании [33]. Именно наличие функциональных групп и соотношение содержания фрагментов структуры обуславливают специфичность действия и различия в физиологической активности ГК разного происхождения [7, 10, 32].
Таким образом, ответственность за физиологическую активность ГК несут те физико-химические особенности структуры (например, способность к супрамолекулярным эффектам), которые определяют их ключевые свойства, позволяющие выделить в отдельный класс природных веществ. По данным [1], к таким свойствам следует отнести наличие по-лисопряжённых, поликонденсированных структур, обладающих электронодонорными и электроноакцепторными свойствами.
Необходимо отметить, что, по современным представлениям, ГК являются гетерополимером супрамо-
лекулярной структуры, состоящим из биотермодинамически устойчивых соединений, образующихся в процессе разложения и трансформации растительных и животных остатков [24]. Базисные принципы классификационных признаков ГК, сформулированные И.В. Перминовой, базируются на трех иерархических уровнях: элементном, фрагментном и молекулярном блоках химической структуры [23]. Такой подход является уместным и для ГПВ [33].
Использование современных физико-химических методов исследования (спектроскопические, хроматографические) позволяет получать сравнимые характеристические данные с нативных образцов ГК, которые практически не подвергают очистке и фракционированию, что оставляет нерешенной проблему их очистки от содержащихся в них примесных органических и неорганических компонентов. Разногласия в данных о структурных особенностях ГК связаны с их большой разновидностью и, в значительной степени, со сложностью их фракционирования и несовершенством используемых методов очистки [33]. В настоящее время рассматриваются новые возможные подходы и варианты хроматографической отчистки ГК и ГПВ с использованием различных сорбентов, в том числе и на основе детонационных наноалмазов [15]. В недавней работе [32] впервые были исследованы возможности тандемного варианта хроматографирования (ТВХ) с использованием перешитых полисахаридных гелей и обозначены преимущества данного подхода относительно малоэффективных методов дробного переосаждения и ионообменной хроматографии [18]. Несомненным преимуществом ТВХ является возможность универсального применения для очистки и фракционирования как ГК, так и ГПВ. Использование ТВХ с последующим инструментальным анализом выделенных фракций позволяет получить сравнительные характеристики особенностей структуры ГК и ГПВ, содержащихся в некоторых лекарственных препаратах (полифепан, чага, и др.) и ЛГ различного типа [33].
Натриевая соль ГК, получаемой из бурого угля, в опытах in vivo проявила наличие антисклеротического и противовирусного эффектов [11, 25]. Раствор 0,05 % ГК, выделенных из низкоминерализованных сульфидных иловых грязей на изотоническом растворе хлорида натрия, в 90 % случаев стимулирует рост задерживающихся в прорезывании постоянных зубов. Препараты 0,5 % раствора ГК увеличивали длительность ремиссии хронических воспалительных процессов органов малого таза, проявляют противогрибковые свойства, стимулируют прорезывание постоянных зубов [4, 16, 31]. Наметившийся в последнее время интерес к ГК как основе для фармацевтической и косметической продукции объясняет-
Сведения об авторах:
Сухих Андрей Сергеевич, канд. фарм. наук, старший научный сотрудник Центральной научноисследовательской лаборатории ГОУ ВПО КемГМА Росздрава, г. Кемерово, Россия.
Кузнецов Петр Васильевич, доктор фарм. наук, профессор, академик РАЕН, заведующий кафедрой фармацевтической и токсикологической химии ГОУ ВПО КемГМА Росздрава, г. Кемерово, Россия.
ОУШщит .. 1
вКуэбассе № 1 2009 11
ся наличием эстрогенного, противовоспалительного, профибринолитического, противоопухолевого, противовирусного эффектов, и уже выходит за рамки только бальнеотерапии [26, 28, 29, 37, 41].
Отмечена высокая каталитическая активность ГК в диспропорционировании супероксида, определяющая существенное значение биологической роли данных соединений [9]. Предположение о том, что ГК являются поставщиками ионов водорода для ферментативных реакций аргументировано, хорошо коррелирует с содержанием ароматических фрагментов в ГК и количеством свободных радикалов, обусловленных наличием фрагментов семихинона [1, 33]. Чем сильнее выражена система сопряжения в ГК и ГПВ, тем в большей степени проявляется их биологическая активность [33]. С этой точки зрения возможно объяснение противовоспалительного действия ГК и препаратов на их основе. Ионы семихинонов, образовавшиеся в результате комплекса с переносом заряда, способны к взаимодействию с перекисными соединениями, избыточное образование которых сопровождает воспалительный процесс, тем самым уменьшая их содержание [1]. Эти представления хорошо согласуются с другим фундаментальным свойством ГК — их электронным парамагнетизмом [30]. Отмечено, что парамагнитная активность, под которой понимается концентрация свободных радикалов, в наибольшей степени может характеризовать общей уровень биохимической активности и биотермодинамической устойчивости ГК. Анализ большого числа ГК, выделенных из образцов торфа географически различных болот, расположенных на территории России, показал близость параметров спектров электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) ^ = 2,0035 ± 0,0002), а различия связаны только с содержанием азота [13, 17, 30].
Несмотря на то, что, по представлениям ряда исследователей, основным полифенольным комплексом чаги является гуминоподобная чаговая кислота, существует иная точка зрения.
В ранних работах Е.В. Ловягиной и соавт. [20, 21] по изучению химического состава чаги, выделяемый пигментный (хромогенный) комплекс из 1попо1ш оЬ-Ндиш (Реге.) рассматривается как гуминоподобная чаговая кислота. Однако, в работах [5, 19] выделяемый хромогенный комплекс рассматривается уже как меланины. Так, у вещества, выделенного из Гпопо^э оЬНдиш щелочным экстрагентом, был зарегистрирован «характерный для меланинов», несколько асимметричный синглетный ЭПР-сигнал с концентрацией парамагнитных центров около 2,93 х 1018 спин на 1 г сухого вещества [19]. Необходимо отметить, что в структуре меланинов также определено наличие парамагнитных центров. Например, у образцов меланинов, исследованных в работах [12], был зарегистрирован ЭПР сигнал с g-фактором 2,0044.
ЛИТЕРАТУРА:
В недавней серии наших работ [33] впервые рассмотрены структурные особенности хромогенного комплекса чаги методом спектроскопии ядерного магнитного резонанса по ядрам углерода С13 (ЯМР С13). При этом, в структуре выделяемого из чаги вещества идентифицированы полисахаридные, липидные, лигниновые компоненты, что позволяет рассматривать выделяемый компонент как гуминоподобную чаговую кислоту, занимающую промежуточное положение между лигнином и ГК. В нашем недавнем исследовании [32] методом электронного парамагнитного резонанса образцов ГПВ чаги и ГПВ, выделенных из препарата на основе гидролизного лигнина (Полифепан), показано, что ГПВ данных образцов обладают сходным g-фактором ЭПР спектра. Интересно, что способ получения (условия образования) ГПВ полифепана исключает содержание в нём меланинов. Методом гель-хроматографии на сорбенте се-фадекс G-100 нами впервые осуществлено фракционирование суммы ГПВ чаги, что позволило выделить две пиковые хроматографические фракции, отличающиеся не только по размеру молекул, но и по содержанию парамагнитных центров с различным g-фактором ЭПР спектра образца (2,00264 и 2,00235).
С учетом особенностей строения ГК, как наиболее вероятный, рассматривается неферментативный механизм их взаимодействия с субстратами, функциональными группами различных макромолекул, включая ферменты. При этом, за счет прямого взаимодействия с метаболитами, участвующими в некоторых ферментопосредованных реакциях ГК, и очевидно конкурируют за субстрат, способствуя их параметаболической биотрансформации [1, 30].
Интересно, что влияние гумата натрия определяется не только его специфичностью, но и способом введения в организм [6, 13]. Остаётся дискуссионным вопрос о наличии перечисленных эффектов для ГК в целом или присутствии некоторой специфической активности, присущей их определённому типу.
Однако в литературе описываются и отрицательные эффекты ГК. Так, ГК, возможно, являются этиологическим фактором эндемического заболевания (black foot), выявленного на юго-западном побережье острова Тайвань [38]. В проводившемся исследовании была использована коммерчески доступная ГК, дополнительно очищенная, и было показано, что ГК вызывает прекращение роста и апоптоза в фиб-робластах, причиняя им серьёзное окислительное повреждение и нарушая их рост [38, 40].
Возможности и условия физиологической активности ГК и ГПВ, уникальной группы гетерополимеров природного происхождения, еще предстоит уточнять и переоценивать, о чем свидетельствует недавний патент на изобретение, где показана способность ГК in vitro инактивировать вирус иммунодефицита человека [42].
1. Аввакумова, Н.П. Биохимические аспекты терапевтической эффективности гумусовых кислот лечебных грязей /Н.П. Аввакумова. - Самара: СамГМУ, 2002. - 124 с.
мп 1 оппп Суущлта
12 1 2009 в Кузбассе
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2. Аввакумова, Н.П. Физико-химическая характеристика и биологическая активность гумусовых кислот низкоминерализованных иловых сульфидных грязей /Н.П. Аввакумова: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Уфа, 1992. - 19 с.
3. Агапов, А.И. Пелоидопрепараты как средство повышения эффективности пелоидотерапии, сообщение I. Физико-химическая характеристика органических веществ иловых сульфидных грязей /А.И. Агапов, Н.П. Аввакумова, Т.В. Коршикова //Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физкультуры. - 1998. - № 4. - С. 43-45.
4. Агапов, А.И. Способ лечения хронического аднексита /А.И. Агапов, А.П. Гаврилов. -Описание изобретения А61Н39/00, А61К35/10, А61М/30, Д61Ш/32 к патенту РФ № 2150261; заявл.25.11.1997; опубл. 06.10.2000.
5. Бабицкая, В.Г. Меланиновый комплекс гриба 1попо1ш оЬ^шб /В.Г. Бабицкая, В.В. Щер-ба, Н.В. Иконникова //Прикладная биохимия и микробиология. - 2000. - Т. 36, № 4. -С. 439-444.
6. Базелян, В.Л. Влияние гумата натрия на всасывание углеводов и аминокислот в тонком кишечнике белых крыс /В.Л. Базелян, И.Э Бочарова, В.В. Бацко //Тканевая терапия: тез. науч. конф. - Одесса, 1983. - С. 27-28.
7. Базелян, В.Л. Химическая характеристика и физиологическая активность гуматов различного происхождения //Тканевая терапия: тез. науч. конф. - Одесса, 1983. - С. 26.
8. Буркова, В.Н. Липиды внутриконтинентальных субаквальных отложений и их роль в формировании нефтей неморского типа /В.Н. Буркова: Автореф. дис. ... докт. хим. наук. - Томск, 1998. - 45 с.
9. Вашурина, И.Ю. Гуминовые кислоты - эффективные катализаторы диспропорциониро-вания супероксида калия в щелочных средах /И.Ю. Вашурина, Н.Е. Кочкина, Ю.А. Калинников //Журнал прикладной химии. - 2006. - Вып. 2. - С. 275-278.
10. Взаимосвязь фрагментного состава гуминовых кислот с их физиологической активностью /Б. Бямбагар, Д.Ф. Кушнарёв, Т.Е. Федорова и др. //Химия твёрдого топлива. -2003. - № 1. - С. 83-90.
11. Дегтяренко, В.И. Противовирусная активность гуминовых веществ Куяльницкой грязи /В.И. Дегтяренко, В.Ф. Зеваков, В.А. Дивоча //Пелоидотерапия распространённых заболеваний: сб. науч. тр. - Пятигорск, 1985. - С. 40-45.
12. Елин, Е.С. Фенольные соединения в биосфере /Е.С Елин. - Новосибирск: СО РАН, 2001.
13. Исматова, Р.Р. Выделение из торфа гумата натрия пирофосфата и токсико-фармаколо-гическое обоснование его использования /Р.Р. Исматова: Автореф. дис. . канд. фарм. наук. - Пятигорск, 1999. - 20 с.
14. Исследование гуминовых кислот методом УФ спектофотометрии /И.А. Савченко, К.А. Нурмухаметова, И.Н. Корнеева и др. //Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Вып. 63. - Пятигорск, 2008. -С. 327-328.
15. К попытке использования выделения гуминовых веществ из препаратов мумиё на основе детонационных алмазов /Е.А. Гуров, П.В. Кузнецов, В.С. Бондарь и др. //Ползу-новский Вестник. - 2008. - № 3. - С. 273-275.
16. Карбышев, А.В. Химико-фармакологическое изучение гумата натрия из сапропеля /А.В. Карбышев: Автореф. дис. ... канд. фарм. наук. - Томск, 1999. - 24 с.
17. Конопля, Е.Ф. Влияние некоторых препаратов гуминовых веществ торфа на нуклеиново-белковые взаимодействия /Е.Ф. Конопля, В.К. Зимницкая, С.И. Крашевская и др. //Тканевая терапия: тез. науч. конф. - Одесса, 1983. - С. 73-74.
18. Кузнецов, П.В. Современные перспективы применения жидкостной колоночной хроматографии в химии гуминовых веществ /П.В. Кузнецов, Е.А. Гуров, А.С. Сухих //Вестник РАЕН ЗСО. - 2007. - Вып. 9. - С. 95-101.
19. Кукулянская, Т.А. Физико-химические свойства меланинов, образуемых чагой в природных условиях и при культивировании /Т.А. Кукулянская, Н.В. Курченко, В.П. Кур-ченко //Прикладная биохимия и микробиология. - 2002. - № 1. - С. 68-72.
20. Ловягина, Е.В. Изучение продуктов гидролиза действующего начала Чаги методом распределительной хроматографии /Е.В. Ловягина, А.Н. Шиврина, Е.Г. Платонова //Биохимия. - 1958. - № 1. - С. 41-46.
21. Ловягина, Е.В. Исследование карбонильной фракции гидролизатов водо-растворимо-го пигментного комплекса, образуемого трутовым грибом Чага /Е.В. Ловягина, Е.Г. Шив-рина //Биохимия. - 1960. - № 4. - С. 640-645.
22. Новицкий, А.А. Сапропелевый концентрат, содержащий гуминовые кислоты, и способ его получения /А.А. Новицкий. - Описание изобретения C05F7/00 к патенту РФ № 2264371; заявл.17.10.2003; опубл. 11.20.2005.
^М^ицит к. 1
вКузбассе № 1 2009 13
23. Перминова, И.В. Анализ, классификация и прогноз свойств гумусовых кислот /И.В. Пер-минова: Автореф. дис. ... докт. хим. наук. - М., 2000. - 34 с.
24. Пуцыкин, Ю.Г. Гуминовые кислоты как особый тип органоминеральных полимеров /Ю.Г. Пуцыкин, А.А. Шаповалов, А.Л. Степанов //XVII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. - Казань, 2003. - Т. 3. - С. 349.
25. Ребачук, Н.М. Медико-биологическое обоснование антисклеротического действия гу-матов натрия из гуминовых кислот окисленного бурого угля /Н.М. Ребачук, В.А. Петров //Роль техногенных факторов в формировании патологии в Сибири: тез. докл. -Кемерово, 1996. - Вып. 1. - С. 118-119.
26. Сайко, А.И. Средство, обладающее противовоспалительным и репаративным действием /А.А. Сайко, А.М. Бескровный, А.Д. Солдатов. - Описание изобретения А61К35/78, А61К9/02 к патенту РФ № 2142811; заявл.10.03.1998; опубл. 12.20.1999.
27. Семионова, М.А. Химико-фармацевтическое и организационно-экономическое обоснование применения гуминовых кислот пелоидов /М.А. Семионова: Автореф. дис. ... канд. фарм. наук. - Самара, 2006. - 22 с.
28. Способ получения противоопухолевого средства /В.А. Трофимов, В.П. Шипов, Е.С. Пи-гарев и др. - Описание изобретения А61К31/282, А61К45/06, А61Р35/00 к патенту № 2182482; заявл. 19.09.2000; опубл. 05.02.2002.
29. Способ получения противовирусного средства /В.А. Трофимов, В.П. Шипов, Е.С. Пига-рев и др. - Описание изобретения А61К35/78, А61К41/00, А61Р31/12 к патенту РФ № 2172176; заявл. 19.06.2000; опубл.20.08.2001.
30. Сравнительное изучение гуминовых кислот грязей и торфов методами электронного парамагнитного резонанса и инфракрасной спектроскопии /Л.М. Эфендиева, Г.Н. Богданов, М.А. Шыхов //Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физкультуры. -1985. - № 4. - С. 45-48.
31. Степанов, Г.В. Способ стимуляции задержавшихся в прорезывании постоянных зубов /Г.В. Степанов, Н.П. Аввакумова. - Описание изобретения А61С7/00 к патенту РФ № 2146900; заявл.16.10.1998: опубл. 03.27.2000.
32. Сухих, А.С. Новый тандемный хроматографический способ выделения и очистки гуминовых кислот и их аналогов из природных объектов и лекарственных препаратов /А.С. Сухих. П.В. Кузнецов //Разработка исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2007. - Вып. 62. - С. 383-387.
33. Сухих, А.С. Эпоксимодифицированные полисахаридные гели в химии гуминовых, гу-миноподобных веществ и препаратов на их основе /А.С. Сухих: Автореф. дис. . канд. фарм. наук. - Тюмень, 2007. - 21 с.
34. Федько, И.В. Химико-фармакологическое исследование спецефических органических веществ торфа /И.В. Федько: Автореф. дис. . канд. фарм. наук. - Томск, 2006. - 19 с.
35. Чирятьев, Е.А. Способ получения антикоагулянта из сапропеля /Е.А. Чирятьев, Е.П. Калинин, О.А. Русакова. - Описание изобретения А61К35/10, А61Р7/02 к патенту РФ № 2175552; заявл.16.03.2000; опубл. 10.11. 2001.
36. Шашкина, М.Я. Химические и медико-биологические свойства чаги (обзор) /М.Я. Шаш-кина, П.Н. Шашкин, А.В. Сергеев //Хим.-фарм. журнал. -2006. - № 10. - С. 37-44.
37. Юбицкая, Н.С. Гумат натрия в лечении больных остеоартрозом /Н.С. Юбицкая, Е.М. Иванов //Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физкультуры. - 1999. - № 5. - С. 22-24.
38. Cheng, M.-L. Humic acids induces oxidative DNA damage, growth retardation, and apopto-sis in human primary fibroblasts /M.-L. Cheng, H.-Y. Ho, Y.-W. Huang //Experimental biology and medicine. - 2003. - V. 228. - P. 413-423.
39. Coates, J. Diversity and ubiquity of bacteria capable of utilization humic substances as electron donors for anaerobic respiration /J. Coates, K. Cole, R. Chakraborty //Applied and environmental microbiology. - 2002. - N 5. - P. 2445-2452.
40. Frimmel, F. Development in aquatic humic chemistry /F.H. Frimmel //Agronomie. - 2000. -V. 20. - P. 451-463.
41. Peтa-Mendez, E. Humic substances - compounds of still unknown structure: applications in agriculture, industry, environment, and biomedicine. Review /E. Peтa-Mendez, J. Havel, J. Pa-^ka //J. Appl. Biomed. - 2005. - N 3. - P. 13-24.
42. Zanetti, M. Treatment of HIV infection with humic acid /M. Zanetti //Patent А61К035/78 US.; 15.07.2004.; N 667299.
