Перспективы использования высокоэффективной жидкостной хроматографии для стандартизации сырья и препаратов бессмертника песчаного Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 615.32: 547.972+543.544 ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ ДЛЯ СТАНДАРТИЗАЦИИ СЫРЬЯ И ПРЕПАРАТОВ БЕССМЕРТНИКА ПЕСЧАНОГО

© 2011 А.В. Куркина, В.М. Рыжов, Е В. Авдеева

Самарский государственный медицинский университет

Поступила в редакцию30.08.2011

Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) изучен компонентный состав цветков бессмертника песчаного и лекарственного средства «Фламина таблетки» и определено, что в обоих случаях доминирующим флавоноидом является изосалипурпозид. Разработана методика количественного определения содержания изосалипурпозида в лекарственном средстве «Фламина таблетки» с использованием ВЭЖХ при длине волны 360 нм (стационарная фаза «Диасорб С-16», элюентная система - ацетонитрил: вода в соотношении 25:75 с добавлением 1% ледяной уксусной кислоты). Обоснована целесообразность использования в методиках анализа ГСО изосалипурпозида. Содержание изосалипурпозида в препарате «Фламина таблетки» варьирует от 10,35 мг до 11,05 мг в одной таблетке. Результаты статистической обработки проведенных опытов свидетельствуют о том, что ошибка единичного определения изосалипурпозида лекарственном средстве «Фламина таблетки» с доверительной вероятностью 95% составляет ±4,03%.

Ключевые слова: бессмертник песчаный Helichrysum arenarium (L.) Moench., флавоноиды, изосалипурпозид, спектрофотометрия, высокоэффективная жидкостная хроматография

Флавоноиды как биологически активные соединения обладают широким спектром фармакологического действия и являются уникальным источником желчегонных, гепатопро-текторных и антиоксидантных лекарственных средств [2, 3, 7]. Одним из перспективных источников препаратов желчегонного и гепато-протекторного действия являются цветки бессмертника песчаного Helichrysum arenarium (L.) Moench. [1-3]. В настоящее время в медицинской практике широко применяются такие лекарственные средства, как настой, жидкий экстракт, «Фламин», желчегонные сборы, однако по-прежнему проблемы стандартизации сырья и препаратов не решены в полной мере, в том числе в плане унификации. Это связано с тем, что в отношении химического состава цветков бессмертника песчаного литературные данные довольно противоречивы. Согласно им

Куркина Анна Владимировна, кандидат фармацевтических наук, ассистент кафедры фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии. E-mail: [email protected]

Рыжов Виталий Михайлович, кандидат фармацевтических наук, ассистент кафедры фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии. E-mail: [email protected]

Авдеева Елена Владимировна, доктор фармацевтических наук, профессор кафедры фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии. E-mail: [email protected]

в цветках бессмертника песчаного к преобладающим флавоноидам относятся халкон изосалипурпозид, флаваноны салипурпозид, пру-нин и нарингенин [2-7], однако нет единой точки зрения, какой из этих компонентов является доминирующим. В бессмертнике песчаном содержится также ряд сопутствующих веществ, включая кумарины, коричные кислоты, фталиды, полисахариды и др. [2], которые вносят вклад в спектральные характеристики анализируемых извлечений, что, на наш взгляд, может приводить к завышению результатов анализа.

Цель исследований - разработка методики количественного определения изосалипурпозида в лекарственном средстве «Фламина таблетки» с использованием ВЭЖХ.

Материал и методы. Исследовали образцы цветков бессмертника песчаного, собранные в различных регионах РФ, промышленные образцы сырья производства ОАО «Красногорсклексредства» (Московская обл.), а также образцы лекарственного средства «Фламина таблетки» (АО «Галичфарм», г. Львов). В ходе разработки методики количественного определения изосалипурпозида в цветках бессмертника песчаного изучены УФ-спектры водно-спиртовых извлечений из данного сырья, а также растворов изосалипурпо-зида (1), салипурпозида (2), 5,7-дигидрокси-фталида (3) и 5-гидрокси-7-метоксифталида

2015

(4), выделенных из цветков бессмертника песчаного.

OH

фаза «Диасорб С-16», элюентная система -ацетонитрил: вода в соотношении 25:75 с добавлением 1% ледяной уксусной кислоты, скорость элюирования - 100 мкл/мин, объем вводимой пробы - 5 мкл. Детекцию веществ осуществляли при пяти длинах волн 254, 270, 290, 330 и 360 нм. Выбор длин волн обусловлен тем, что исследуемые вещества имеют максимумы поглощения при 372 нм (изосалипурпозид), 284 нм (салипурпозид), 256 нм и 292 (5,7-дигидроксифталид, 5-гидрокси-7-метоксифталид), 330 нм (гидроксикоричные кислоты). Опорная и аналитическая длина волны при разметке пиков - 360 нм, так как целевым анализируемым веществом является изосалипурпозид, имеющий максимум поглощения при длине волны 372 нм (рис. 1).

[А]

Glc-

OO

Салипурпозид (2)

O

OH

5,7-Дигидроксифталид (3)

O

200 2 50 3 00 3 50 00 4 50 [™]

5-Метокси-7-гидроксифталид (4)

Регистрацию спектров проводили с помощью спектрофотометра «Specord 40» (Analytik Jena).В основу разработанной нами методики количественного определения положены следующие оптимальные параметры: экстракция сырья 70% этиловым спиртом в течение 1 часа в условиях кипения в соотношении 1:50 [4]. ВЭЖХ-анализ осуществляли с использованием хроматографа «Милихром-5» в следующих условиях обращенно-фазовой хроматографии в изократическом режиме: колонка КАХ (2 мм х 80 мм), стационарная

Рис. 1. УФ-спектр раствора изосалипурпозида

Результаты и их обсуждение.

Сравнительное исследование извлечения из цветков бессмертника песчаного (рис. 2) и раствора лекарственного средства «Фламина таблетки» (рис. 3) показало, что, несмотря на некоторые различия в их компонентном составе, в обоих случаях доминирующим компонентом является изосалипурпозид. Сравнение значений времени удерживания пиков веществ (пики 1-5) на ВЭЖХ-хроматограмме извлечения из цветков бессмертника песчаного (рис. 2) и раствора лекарственного средства «Фламина таблетки» (рис. 3), а также времени удерживания пиков индивидуальных веществ (рис. 4-7, табл. 1) позволило идентифицировать четыре соединения (1-4), среди которых доминирующим является изосалипурпозид (1).

2016

Рис. 2. Схема ВЭЖХ-хроматограммы извлечения из цветков бессмертника песчаного (здесь и далее номера пиков веществ соответствуют таковым в таблице 1)

Рис. 3. Схема ВЭЖХ-хроматограммы раствора препарата «Фламина таблетки»

Рис. 4. Схема ВЭЖХ-хроматограммы изосалипурпозида (1)

2017

Рис. 5. Схема ВЭЖХ-хроматограммы салипурпозида (2)

Рис. 6. Схема ВЭЖХ-хроматограммы 5,7-дигидроксифталида (3)

Рис. 7. Схема ВЭЖХ-хроматограммы 5-метокси-7-гидроксифталида (4)

2018

Таблица 1. Время удерживания пиков веществ цветков бессмертника песчаного и препарата «Фламина таблетки» на хроматограммах

Вещество № пика на Время удерживания на

хроматограмме хроматограмме, мин

извлечение фламин вещество

из сырья

изосалипурпозид (1) 5 7,198 7,953 7,399

салипурпозид (2) 3 3,795 3,926 3,976

5,7-дигидроксифталид (3) 2 2,919 2,975 3,221

5-метокси-7- 4 4,832 5,184 5,285

гидроксифталид (4)

вещество неидентифицированное 1 2,215 2,265 -

Методика количественного определения изосалипурпозида в лекарственном средстве «Фламина таблетки». Около 0,3 г (точная навеска) порошка измельченных таблеток помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 30 мл 95% спирта, растворяют содержимое колбы при перемешивании в течение 30 мин, доводят объем раствора до метки 95% спиртом и затем фильтруют через бумажный фильтр с красной полосой в колбу с притертой пробкой вместимостью 100 мл (испытуемый раствор). 5 мкл испытуемого раствора вводят в жидкостной хроматограф «Милихром-5» с УФ-детектором. Хроматографируют в условиях обращенно-фазовой хроматографии в изократическом режиме: колонка КАХ (2x80 мм), стационарная фаза «Диасорб С-16», элюентная система - ацетонитрил: вода в соотношении 25:75 с добавлением 1% ледяной уксусной кислоты, скорость элюирования - 100 мкл/мин. Проводят УФ-детектирование при длине волны 360 нм, диапазон чувствии-тельности 0,5. Проводят не менее 3 параллельных определений. Параллельно 5 мкл раствора ГСО изосалипурпозида вводят в хроматограф и хроматографируют как описано выше. Проводят определение высоты пика ГСО изосалипурпозида и рассчитывают среднюю высоту пика по результатам 3-х определений. Определяют время выхода и идентифицируют пик изосалипурпозида на хромато-грамме испытуемого раствора. Измеряют высоту пика изосалипурпозида на хромато-грамме и рассчитывают среднюю высоту пика по трем параллельным определениям.

Содержание изосалипурпозида в одной таблетке лекарственного средства «Фламина таблетки» в граммах (X) вычисляют по формуле:

х = ИШуУУРр

НтУРг ;

где Н - среднее значение высоты пика изо-салипурпозида испытуемого раствора, вычисленное из хроматограмм раствора испытуемого образца, мм; Но - среднее значение высоты пика раствора ГСО изосалипурпозида, вычисленное из хроматограмм раствора ГСО изосалипурпозида, мм; V - объем испытуемого раствора, мл; V1 - объем вводимой пробы испытуемого раствора, мкл; Vo - объем раствора ГСО изосалипурпозида, мл; V2 -объем вводимой пробы раствора ГСО изосалипурпозида, мкл; т - масса навески, г; то - масса ГСО изосалипурпозида, г; Рср. -средняя масса таблетки, г.

Приготовление раствора изосалипур-позида-стандартного образца. Около 0,02 г (точная навеска) изосалипурпозида помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 20-30 мл 95% этилового спирта, доводят объем раствора 95% этиловым спиртом до метки и перемешивают.

Содержание изосалипурпозида в лекарственном препарате «Фламина таблетки» варьирует в пределах от 10,35 мг до 11,05 мг в одной таблетке.

Метрологические характеристики разработанной методики ВЭЖХ-анализа свидетельствуют о том, что ошибка единичного определения содержания изосалипурпозида лекарственного средстве «Фламина таблетки» с доверительной вероятностью 95% составляет ±4,03% (табл. 2). Опыты с добавками ГСО изосалипурпозида к навеске препарата показали, что ошибка анализа находится в пределах ошибки единичного определения, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки разработанной методики.

2019

Таблица 2. Метрологические характеристики методики количественного определения изосалипурпозида в одной таблетке лекарственного средстве «Фламина таблетки»

f X S P, % t (P,f) AX E, %

10 10,35 мг 0,1870 95 2,23 ±0,417 ±4,03

1.

Выводы:

1. С использованием ВЭЖХ-анализа изучен компонентный состав цветков бессмертника песчаного и лекарственного средства 2 «Фламина таблетки» и определено, что в обоих случаях доминирующим флавоноидом являя-ется изосалипурпозид.

2. Разработана методика количественного 3 определения содержания изосалипурпозида в лекарственном средстве «Фламина таблетки» и обоснована целесообразность использования в 4 методике ВЭЖХ-анализа ГСО изосалипурпо-зида.

3. Содержание изосалипурпозида в лекарственном препарате «Фламина таблетки» 5 варьирует от 10,35 мг до 11,05 мг в одной таблетке. Ошибка единичного определения изосалипурпозида в лекарственном средстве 6 «Фламина таблетки» с доверительной вероятностью 95% составляет ±4,03%.

7.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

Государственная Фармакопея СССР. Одиннадцатое издание. Вып. 2. - М.: Медицина, 1990. 400 с. Куркин, В.А. Фармакогнозия: Учебник для фармацевтических вузов (факультетов). 2-е изд. перераб. и доп. - Самара: ООО «Офорт», ГОУ ВПО «Сам-ГМУ», 2007. 1239 с.

Куркин, В.А. Основы фитотерапии: Учебное пособие для студентов фармацевтических вузов. - Самара: ООО «Офорт», ГОУ ВПО «СамГМУ Росзд-рава», 2009. 963 с.

Куркина, А.В. Новые подходы к стандартизации сырья бессмертника песчаного - Helichrysum arenarium (L.) Moench. // Традиционная медицина. 2010. № 1. С. 45-49.

Куркина, А.В. Определение содержания изосали-пурпозида в цветках бессмертника песчаного / А.В. Куркина, В.М. Рыжов // Фармация. 2011. № 1. С. 12-14.

Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование; Семейство Asteraceae (Compositae). - СПб.: Наука, 1993. 352 с. Wagner, H. Pharmazeutische Biologie. Drogen und ihre Inhaltsstoffe. - Stuttgart-New York: Gustav Fischer Verlag, 1993. 522 s.

PROSPECTS OF USE THE HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY FOR STANDARDIZATION OF RAW

MATERIALS AND PREPARATIONS OF HELICHRYSUM ARENARIUM

© 2011 A.V. Kurkina, V.M. Ryzhov, E.V. Avdeeva Samara State Medical University

By the method of high performance liquid chromatography (HPLC) it was studied componental structure of Helichrysum arenarium (L.) Moench. flowers цветков and a medical product of "Flamin" in tablets and was defined that in both cases dominating flavonoid is isosalipurposide. The method of quantitative definition of isosalipurposide maintenance in medical product of "Flamin" in tablets with the use of HPLC is developed at wave length of 360 nanometers (stationary phase «Diasorb С-16», eluent system -an acetonitrile: water in ratio 25:75 with addition of 1% ice acetic acid). The expediency of use in methods of SSS isosalipurposide analysis is proved. Isosalipurposide maintenance in preparation "Flamin" in tablets varies from 10,35 mg to 11,05 mg in one tablet. Results of statistical processing of the spent experiences testify that an error of isosalipurposide individual definition in medical product "Flamin" in tablets with confidential probability of 95% makes ±4,03%.

Key words: Helichrysum arenarium (L.) Moench., flavonoids, isosalipurposide, spectrophotometry, high performance liquid chromatography

Anna Kurkina, Candidate of Pharmacy, Assistant at the Department of Pharmacognosy

with Botany and Bases of Phytotherapy. E-mail: [email protected]

Vitaliy Ryzhov, Candidate of Pharmacy, Assistant at the Department of Pharmacognosy

with Botany and Bases of Phytotherapy. E-mail: [email protected]

Elena Avdeeva, Doctor of Pharmacy, Professor at the Department of Pharmacognosy

with Botany and Bases of Phytotherapy. E-mail: [email protected]

2020