CC BY
132
шт детской о
ГЕМАТОЛОГИИ и ОНКОЛОГИИ 2 III 2017
Перспективы использования экзосом опухолевых клеток в диагностике, мониторинге и терапии
злокачественных заболеваний
М.В. Тихонова1, А.И. Карачунский1, В.И. Поспелов2, С.А. Румянцев3, А.Г. Румянцев1
1ФГБУ«ННПЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России; Россия, 117997, Москва, ул. Саморы Машела, 1; 2ЗАО «Генетические технологии и анализы»; Россия, 105118, Москва, ул. Шоссе Энтузиастов, 25/18; 3ФГБОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России; Россия, 117997, Москва, ул. Островитянова, 1
Контактные данные: Марина Валерьевна Тихонова [email protected]
Разработка неинвазивных методов исследования экзосом, содержащих нуклеиновые кислоты и специфические белки опухолевых клеток для скрининга, ранней диагностики и мониторинга опухолевого роста является актуальной проблемой онкологии. Это важно как для первичной диагностики злокачественных заболеваний, так и для контроля метастатических процессов, являющихся ключевым моментом контроля латентных опухолевых стволовых клеток, вступающих в пролиферацию и приводящих к летальному исходу через годы и десятилетия после типирования первичной опухоли.
Экзосомы, выделенные из опухолевых клеток биологических жидкостей, злокачественных выпотов и дендритных клеток онкологических больных, являясь близкими копиями исходных клеток по рецепторам, белкам и нуклеиновым кислотам, обладают иммуномодулирующей активностью и могут презентировать антигены, стимулируя антиген-специфический Т-клеточный ответ. Терапевтический потенциал экзосом исследуется при инфекциях, возбудители которых персистируют в клетках иммунной системы (токсоплазмоз, туберкулез, тяжелый острый респираторный синдром), опухолях, аутоиммунных и аутовоспалитель-ных заболеваниях. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что экзосомы, содержащие антигены опухолевых клеток, ингибируют рост опухоли за счет индукции Т-клеточного специфического иммунного ответа, приводя к рецессии опухоли у экспериментальных животных. Перенос результатов исследований терапевтической активности экзосом с мышей на человека невозможен из-за различий в иммунной системе человека и мыши. Вместе с тем, использование экзосом в I фазе клинических испытаний при различных онкологических заболеваниях показало, что терапия экзосомами безопасна, нетоксична, хорошо переносится больными, эффективно сочетается с колониестимулирующими факторами, индуцирует врожденный и адаптивный иммунный ответ, стабилизирует заболевание и обеспечивает выживание в долгосрочной перспективе для ряда пациентов. Имеются и противоположные данные о супрессивном воздействии экзосом на активность эффекторных клеток и, следовательно, возможности ускорения роста опухоли. Общая тенденция развития терапевтических исследований во многом повторяет опыт использования противоопухолевых вакцин и их взаимоотношения с химиотерапией и таргетной иммунотерапией злокачественных заболеваний.
Представленный обзор отражает диагностические и терапевтические опции экзосом опухолевых клеток и возможность их использования в мониторинге и лечении опухолевых заболеваний человека.
Ключевые слова: экзосомы опухолевых клеток, микроРНКэкзосом, возможности диагностики, мониторинга и терапии онкологических заболеваний с использованием экзосом
Е
09
DOI: 10.17650/2311-1267-2017-4-2-40-45
Prospects of exosomes use of tumor cells in the diagnosis, monitoring and therapy of malignant diseases
M.V. Tikhonova1, A.I. Karachunskiy1, V.I. Pospelov2, S.À. Rumyantsev3, À.G. Rumyantsev1
1Dmitry Rogachev National Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology Ministry of Health of Russia;
1 Samory Mashela St., Moscow, 117997, Russia; Genetic technologies and analyzes; 25/18 Highway Enthusiasts, Moscow, 105118, Russia; 3N.I. Pirogov Russian National Research
Medical University, Ministry of Health of Russia; 1 Ostrovityanova St., Moscow, 117997, Russia
Development of non-invasive methods of studying of exosomes, containing nucleic acids and specific proteins of tumor cells for screening, early diagnostics and monitoring of tumor growth, is the actual problem of oncology. This is important both for primary diagnostics of malignant diseases andfor control of metastatic processes, which are the key momentfor control of latent tumor stem cells, starting the proliferation and o, leading to lethal outcome after years and decades after typing of primary tumor. Exosomes, extracted from the tumor cells of biological fluids, malignant exudates and dendritic cells of oncological patients, are the close copies of receptors, proteins and nucleic acids of initial cells, which have the immune modulating activity and able to represent antigens by stimulating of antigen-specific T-cells answer. Therapeutic
1Ш ДЕТСКОЙ Г) ТОМ 4
ГЕМАТОЛОГИИ и ОНКОЛОГИИ 211 2017
potential of exosomes studying now in case of infections, which pathogens persist in cells of immune system (toxoplasmosis, tuberculosis, .severe acute respiratory syndrome), tumors, autoimmune and autoinflammatory diseases. Experimental data indicate that exosomes, containing antigens of malignant cells, inhibit tumor growth by induction of T-cell specific immune answer, leading to tumor regression in experimental animal models. Transferring of results of study of therapeutic activity of exosomes from mice to humans is impossible due to difference in immune system of human and mouse. However, usage of exosomes in phase I of clinical trials in different oncological diseases showed that therapy with exosomes is safe, non-toxic, well-tolerated, can effectively be combined with colony stimulating factors, inducting congenital and adaptive immune answer, stabilizing disease and provides prolonged surviving for a number of patients. There are also the opposite data on suppressive effect of exosomes on activity of effector cells and, therefore, possible acceleration of tumor growth. General tendency of development of therapeutic studies largely repeats experience of usage of anti-cancer vaccines and it's relationship with chemotherapy and target immune therapy of malignant disorders.
This review reflects diagnostic and therapeutic options of exosomes tumor cells and possibility of usage in monitoring and treatment of malignant disorders of human.
Key words: exosomes tumor cells, exosomal microRNAs, diagnostics, monitoring and therapy of oncological diseases using exosomes
Введение
Экзосомы являются мембранными везикулами, диаметром 30—100 нм, субфракцией внеклеточных везикул, которые секретируются всеми видами клеток во внеклеточное пространство [1]. Они содержат цитоплазму клеток, заключенную в липидный бислой с внешними доменами трансмембранных белков, подверженных контакту и воздействию внеклеточной среды и других клеток.
Образование микроэндосом начинается на клеточной цитоплазмической мембране или мембранах аппарата Гольджи с формирования холестерин-обога-щенного островка и присоединения к нему клатрина и нескольких других белков, что обеспечивает втягивание участка мембраны и формирование микроэн-досомы. В микроэндосоме, благодаря выворачиванию мембраны, наружная и внутренняя поверхность меняются местами [2]. В образовавшийся липидный мембранный пузырек могут проникать белки, предназначенные для переноса, но только в том случае, если они моноубиквитилированы, т. е. связаны с одной молекулой убиквитина. Особенно важна при этом убиквитин-лигаза 3 (НЕСТ Е3 лигаза), регулирующая трафик многих рецепторов, белков каналов и вирусных белков [3]. Микроэндосомы могут выходить из клеток в биологические жидкости и циркулировать в организме. В случае выхода из клеток они называются экзосомами.
В экзосомах содержатся белки, микроРНК (miR), ДНК и мРНК. Известно всего около 1000 представителей miR. Они регулируют в клетке работу около 80 % генов, кодирующих белки. В опухолевых клетках miR-регулируемые гены апоптоза, клеточного деления и дифференцировки определяют характер опухоли. Определен набор miR и их соотношение в экзосомах клеток, плазмы крови и других биологических жидкостях при раке легких, толстой кишки, яичника, молочной железы и др. [4]. Показано, что набор miR и их соотношение в экзосомах в сыворотке (плазме) крови соответствует таковому
в экзосомах опухолевых клеток у того же больного. Во многих опухолях имеет место повышенное содержание let7 miR, регулирующей Ras [5], miR-15, miR-16, регулирующей активность мРНК Bcl-2 [6], miR-21, miR-214.
Высокая концентрация экзосом опухолевого происхождения у больных с опухолями яичников соответствует поздней стадии, прогрессии заболевания или большей способности к метастазированию. При злокачественных опухолях концентрация эк-зосом в сыворотке крови выше, чем при доброкачественных образованиях в яичниках или у здоровых женщин. Так, при IV стадии опухоли яичника количество экзосом увеличилось в 50 раз по сравнению с нормой. Из 467 тестируемых miR в экзосомах были обнаружены 218 видов, из них 31 в повышенном количестве, 8 представителей miR были особенно ги-перэкспрессированы [7].
Биологические эффекты экзосом
Экзосомы находятся в надосадочной жидкости клеточных культур и в различных биологических жидкостях. На данный момент они выделены из В-клеток, Т-клеток, дендритных, тучных, эпителиальных клеток и культур опухолевых клеток и даже тромбоцитов в сыворотке, моче, спинномозговой жидкости, грудном молоке, слюне, злокачественных выпотах и жидкости бронхоальвеолярного лаважа. Присутствие экзосом в биологических жидкостях можно использовать в качестве биомаркеров при диагностике заболевания и работы в этом направлении ведутся под кодовым названием — «жидкая биопсия» [8, 9]. в,
Экзосомы опухолевых клеток оказывают двоякий эффект на иммунную или, точнее, клеточную защиту организма от злокачественного новообразования. С одной стороны, опухолевые экзосомы, смешиваясь с Т-лимфоцитами in vitro, позволяют индуцировать более сильный противоопухолевый иммунитет, чем смесь дендритных клеток больного с лимфоцитами [10, 11]. Они попадают в моноциты — предшественни- is
2
ТОМ 4
2017
Е
га
ш Е
ки макрофагов, инфильтрирующих опухоли, и переносят опухолеспецифические антигены и мРНК. Опухолевые везикулы усиливают активность дендритных клеток, презентирующих антигены в своих экзосо-мах. Опухолевые экзосомы эффективней дендритной вакцины в создании противоопухолевого иммунитета и усилении синтеза фактора некроза опухолей, однако только в сочетании с гранулоцитарно-макрофагаль-ным колониестимулирующим фактором (GM-CSF). Например, инъекция экзосом из асцитной жидкости опухолевого происхождения и GM-CSF вызывает противоопухолевый эффект при раке толстой кишки [12].
Блокада на моноцитах CD44 отменяет секрецию экзосом дендритными клетками [13], поэтому гиалу-ронин или другие лиганды, связывающиеся с рецептором CD44, регулируют выход экзосом из моноцитов [14] и могут служить основой для разработки новой группы препаратов противоопухолевой защиты, влияющих на интенсивность выхода экзосом из дендритных клеток.
С другой стороны, нативные экзосомы опухолевого происхождения подавляют перенос экзосом из дендритных клеток в Т-лимфоциты [14]. В результате попадания опухолевых экзосом в цитотоксические Т-лимфоциты последние временно теряют специфическую цитотоксичность и синтезируют на опухолевой РНК опухолеспецифические антигены, чем помогают росту опухоли. Например, куркумин, подавляющий образование miR и влияющий на мРНК, отменяет супрессию лимфоцитов опухолевыми экзо-сомами [15]. miR опухолевых экзосом также способны перепрограммировать дифференцировку моноцитов в миелоидные клетки, вызывающие супрессию противоопухолевого иммунитета. Так, экзосомы, секретируемые клетками меланомы и рака толстой кишки, вовлечены в прогрессию опухоли именно за счет дифференцировки моноцитов в миелоидные им-муносупрессирующие клетки [16]. Эти клетки в свою очередь выделяют TGF-фактор, блокирующий противоопухолевые лимфоциты. Под действием опухолевых экзосом в Т-лимфоцитах провоцируется апоптоз. FAS-лиганд и TRAIL — компоненты экзосом, непосредственно вызывающие апоптоз.
При многих опухолях в состав эндосом входит активированный рецептор эпидермального ростового фактора EGFR [17], который переносится в окружающие клетки и усиливает рост всей опухолевой массы. Анализ EGFRvIII-мутантного белка и его мРНК в экзосомах плазмы крови или мочи больного может стать более надежным предикативным обоснованием в иммунотерапии злокачественных глиом. Было показано, что фенотип опухоли может переноситься через экзосомы с кровотоком и реализовываться в удаленных тканях. При этом измененные белки опухоли, содержащиеся в экзосомах, сразу же могут экс-
прессироваться в принявших их клетках, а miR модифицируют внутриклеточную регуляцию, воздействуя на генетический аппарат данных клеток [18].
Применение экзосом в диагностике злокачественных заболеваний и мониторинге латентных метастатических клеток
Уникальные возможности для диагностики злокачественных заболеваний и контроля эволюции остаточной опухоли [19] ограничены техническими трудностями выделения и молекулярного анализа таких наномасштабных и молекулярно-разнообразных молекул [20, 21]. Стандартным протоколом выделения экзосом является многоступенчатое ультрацентрифугирование, которое является трудоемким и занимает более 10 ч. Экзосомальный анализ проводится методами вестерн-блота, энзимсвязанного иммуно-сорбентного анализа (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) и масс-спектрометрии. Серия дальнейших процедур включает экзосомный лизис, изоляцию miR, синтез кДНК и проведение анализа с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. В дополнение ко всему, из-за своих небольших размеров зрелая miR до стадии синтеза кДНК должна быть удлинена с помощью специфического олигонуклеотида, такого как полиаделиновая кислота, чтобы гарантировать, что ее размер достаточен для обнаружения в продукте ПЦР. Поиск быстрых и недорогих методов обнаружения специфичных miR привел к разработке новых методов детекции с помощью олигонуклеотидного зонда [22] или микрожидкостной технологии на основе экзосомных микрочипов [23].
Экзосомы различного клеточного происхождения секвестируют общий набор молекул, которые необходимы для их биогенеза, структуры и транспорта, а также компоненты, специфические для конкретного типа клеток, которые, предположительно, отражают биологическую функцию материнской клетки. В состав универсальных белков экзосом входят цито-плазматические белки, такие как тубулин, актин и ак-тинсвязывающие белки, белки теплового шока Hsp70 и Hsp90 и тримерные G-белки, а также мембранные белки, такие как члены семейства тетраспанинов (CD9, CD63, CD81, CD82) [24], которые, как предполагается, участвуют в клеточной адгезии, активации, пролиферации и презентации антигена. В дополнение к консервативному набору белков функционирование экзосом определяется белками, специфическими для конкретного типа клеток, которые отражают специализированную функцию исходной, например опухолевой, клетки.
Липиды, которые содержатся на экзосомах, также соответствуют происхождению клетки, а большинство аналитических работ было проведено на экзосо-
. Журнал
нодго
ДЕТСКОЙ ГЕМАТОЛОГИИ и ОНКОЛОГИИ
2
ТОМ 4
2017
мах, выделенных из опухолевых клеток, ретикулоци-тов, тучных клеток, клеточных линий В-лимфоцитов и дендритных клеток человека [25]. Типичный липид-ный состав экзосом, выделенных из тучных клеток, включает лизофосфатидилхолин, сфингомиелин, фосфатидилхолин, фосфатидилсерин, фосфати-дилэтаноламин, холестерин и диглицерид. Хотя большинство из этих липидов присутствует на экзосомах, изолированных из других типов клеток, их соотношения отличаются.
Подготовка экзосом для терапевтических целей
Учитывая, что экзосомы имеют размер в диапазоне от 40 до 100 нм, плотность в диапазоне от 1,13 до 1,21 г/мл и содержат белки, специфические для определенного типа клеток, процедуры их выделения для терапевтических целей были сфокусированы на технологиях, основанных на размере, плотности и биохимических свойствах. Как правило, экзосомы выделяют путем последовательного центрифугирования супернатанта клеточной культуры и жидкостей организма с целью удаления клеток и продуктов их распада, которое состоит из нескольких этапов. В начале проводится центрифугирование на малой скорости (300^ в течение 10 мин), с помощью которого удаляются мертвые клетки и крупные продукты апоптоза, а затем — центрифугирование на более высоких скоростях, которые в различных протоколах варьируются от 1000 до 20 000^, с помощью которого удаляются большие везикулы и продукты клеточного распада. После заключительного центрифугирования на высокой скорости 60 000—100 000^ в течение более чем 1 ч образуется осадок, состоящий из внеклеточных везикул, в том числе экзосом. В некоторые протоколы включены этапы фильтрования (с использованием фильтров с размером пор 0,8 и 0,22 мкм) и вращения с целью удаления продуктов клеточного распада и других посторонних веществ. Однако результаты ультрацентрифугирования могут приводить к формированию осадка в пробирке, который может агрегировать экзосомы с другими везикулами, частицами, апоптозными тельцами или другими продуктами клеточного распада и мешать очистке. Кроме того, чрезмерное центрифугирование может привести к разрыву экзосом. Кроме того, используя плотность экзосом, их можно очистить от белковых агрегатов, апоптозных телец и нуклеосомных фрагментов с помощью флотации в градиенте плотности сахарозы. С помощью этой процедуры можно удалить примеси, которые по составу отличаются от экзосом. Однако с помощью данной технологии можно получить только гетерогенные экзосомы с микровезикулами, потому что имеющиеся на настоящий момент методики не позволяют отличить «экзосому» размером 50—100 нм от «микровезикулы» размером 50—200 нм. Эти про-
цессы приводят к варьированию степени изоляции начального количества экзосом [26, 27].
Несмотря на то, что данная отрасль науки развивается быстрыми темпами, качество и степень чистоты подготовки экзосом, которых можно достичь с помощью этих методов, не удовлетворяют общим критериям надлежащей производственной практики (GMP). Экзосомы, приготовленные с использованием данного метода, легко загрязняются белками среды и содержат только 5—25 % от начальной концентрации. В отличие от дифференциального центрифугирования, новый метод очистки экзосом степени чистоты для клинического применения (cGMP), выделенных из антигенпрезентирующих клеток (АРС) с использованием ультрафильтрационных картриджей и насосов, особенно полезен для очистки экзосом из больших объемов (> 1 л) кондиционированной среды. Более конкретно: процесс ультрафильтрации осуществляется посредством использования тонковолоконного картриджа NM WCO 500 кДа, который позволяет проникновение неагрегированных белков среды через поры мембраны, в то же время не пропуская агрегированные белки без существенных изменений состава и эффективности среды. Таким образом, удаление совместно очищаемых белков, таких как человеческий гаптоглобин и агрегаты альбумина, предотвращает нежелательный иммунный ответ на компоненты сыворотки. Кроме того, в ходе предыдущей совместной очистки с экзосомами, концентрации этих белков в конечном продукте могут быть выше, что делает его одним из важнейших аспектов очистки GMP-экзосом.
В другом методе выделения, основанном на биохимическом составе экзосом, используются магнитные микроносители, покрытые специфическими моноклональными антителами к белку, который, как известно, присутствует на мембране экзосом. Например, с помощью магнитных микроносителей, покрытых антителами, используя антитела против опухолеспецифических белков, удалось получить HER-2-экспрессирующие опухолевые экзосомы из культуральной надосадочной жидкости линии клеток аденокарциномы молочной железы и перитонеально-го выпота пациентки с раком яичников [28].
Применение экзосом в терапевтических целях
Экзосомы, секретируемые опухолевыми клетками, являются близкими копиями исходных клеток и с точки зрения их антигенности использование эк-зосом в имуннотерапии онкологических заболеваний является перспективным направлением. Например, экзосомы, выделенные из клеток меланомы, содержат высокоиммуногенные антигены MelanA/Mart-1 и gp100, а те, которые секретируются при раке толстой кишки, экспрессируют CEA и HER-2. Это антигенное
Е
га ш
Е
2
ТОМ 4
2017
содержимое характерно не только для экзосом, полученных in vitro, но также встречается и в микровезикулах (или фрагментах плазматической мембраны, размером от 50 до 1000 нм, почти всех типов клеток), выделенных из плазмы онкологических больных, а также является доказательством опухолевого происхождения этих органелл [14, 29]. Было продемонстрировано, что экзосомы, содержащие антигены опухоли, стимулируют CD4+ и CD8+ Т-клетки, а экзосомы, полученные in vitro культивированием APC, введенные in vivo, способны индуцировать Т-клеточный ответ, приводя к ингибированию роста опухоли [30].
В I фазе клинических испытаний при онкологических заболеваниях у человека оценивалась эффективность пациент-специфических экзосом, выделенных дендритными клетками и нагруженных пептидами, полученными с помощью антигена опухоли (дексо-сом), для меланомы и немелкоклеточного рака легких. Было установлено, что иммунотерапия дексосомами является целесообразной, безопасной и приводит к индукции врожденного и адаптивного иммунного ответов, стабилизации заболевания и выживанию в долгосрочной перспективе для некоторых пациентов [29, 30]. Кроме того, было установлено, что экзосомы, выделенные из перитонеального выпота пациентов с колоректальным раком, являются безопасными, нетоксичными и хорошо переносимыми при использовании в качестве вакцины против рака, и в сочетании с GM-CSF могут эффективно индуцировать мощный карциноэмбриональный антиген-специфический противоопухолевый иммунитет у пациентов с поздней стадией колоректального рака [12]. Однако следует отметить, что потенциальный противоопухолевый эффект экзосом опухолевого происхождения все еще остается неясным, о чем свидетельствует и тот факт, что у онкологических пациентов с поздней стадией заболевания экзосомы, выделенные из опухоли, не оказывают эффективной иммуностимулирующей и противоопухолевой активности, несмотря на обильную выработку экзосом опухолевого происхождения. Кроме того, было продемонстрировано, что экзосомы опухолевого происхождения проявляют иммуносу-
прессивную активность, так, при непосредственном их введении наблюдалось ускорение роста опухоли у экспериментальных животных [31]. Было продемонстрировано, что экзосомы опухолевого происхождения непосредственно подавляют активность эффекторных Т-клеток или действуют на миелоид-ные клетки, модулируя их дифференцировку и функцию, как, например, в случае, когда экзосомы, выделенные из линий клеток меланомы и колоректальной карциномы, изменили дифференцировку моноцитов в дендритные клетки в сторону генерации супрес-сорных клеток, выделенных из супрессорных клеток миелоидного происхождения, и оказали TGF-опосре-дованное супрессивное действие на Т-клетки in vitro [12, 29, 30]. Изучение характеристик экзосом опухолевого происхождения и понимание их влияния на патогенез онкологических заболеваний необходимо для дальнейшего обсуждения использования их в комбинированной химиоэкзосомной терапии.
Заключение
Исследования биологии экзосом являются новой областью науки, и многое еще предстоит сделать, чтобы определить механизмы экзосомно-клеточ-ной регуляции и обеспечить безопасное и эффективное использование экзосом в терапевтических целях. Экзосомы являются нетоксичными клеточными продуктами и хорошо переносятся больными. С расширением нашего понимания биологии экзо-сом расширится и диапазон принципов по созданию экзосом и экзосомальных конъюгатов, используемых при разработке иммунотерапевтических средств, вакцин и модуляторов ангиогенеза. Использование экзосом в качестве системы доставки лекарственных средств, по сравнению с уже существующими системами, также представляется перспективным из-за их небольшого размера, отсутствия токсичности и направленности действия, хотя загрузка экзосом лекарствами без ухудшения их биологических свойств остается весьма сложной задачей. Требуют изучения возможности использования экзосом в комбинации с химиотерапией и таргетной иммунотерапией.
Р
оссиискии
Журнал
2
TOM 4
2017
ЛИТЕРАТУРА
1. Simons M., Raposo G. Exosomes — vesicular carriers for intercellular communication. Cuzz Opin Cell Biol 2009;21(4):575-81.
2. Pisitkun T., Shen R.-F., Knepper M.A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci
U S A 2004;101(36):13368-73.
3. Rotin D., Kumar S. Physiological functions of the HECT family of unbiquitin ligases. Nat Rev Mol Cell Biol 2009;10(6)398-409.
4. Falcone G., Felsani A., D'Agnano I. Signaling by exosomal microRNAs in cancer. J Exp Clin Cancer Res 2015;34:32.
5. Johnson S.M., Grosshans H., Shingara J. et al. RAS is regulated by the let-7 microRNA family. Cell 2005;120(5):635-47.
6. Cimmino A., Calin G.A., Fabbri M. et al. miR-15 and miR-16 induce apoptosis by targeting BCL2. Proc Natl Acad Sci U S A 2005;102(29):13944-9.
7. Taylor D.D., Gercel-Taylor C. MicroRNA signatuers of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol Oncol 2008;110(1):13-21.
8. Simpson R.J., Lim J.W., Moritz R.L., Mathivanan S. Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential. Expert Rev Pro-teomics 2009;6(3):267-83.
9. Keller S., Ridinger J., Rupp A.K. et al. Body fluid derived exosomes as a novel template for clinical diagnostics. J Transl Med 2011;9:86.
10. Baj-Krzyworzeka M., Szatanek R., Weglarczyk K. Tumor-derived microvesicles modulate biological activity of human monocytes. Immunol Lett 2007;113(2):76-82.
11. Viaud S., Ullrich E., Zitvogel L., Chaput N. Exosomes for the treatment of human malignancies. Horm Metab Res 2008;40(2):82-8.
12. Dai S., Wei D., Wu Z. et al. Phase I clinical trial of autologous ascites-derived exo-
somes combined with GM-CSF for colorectal cancer. Mol Ther 2008;16(4):782-90.
13. Iero M., Valenti R., Huber V. et al. Tumor-released exosomes and their implications in cancer immunity. Cell Death Differ 2008:15(1):80-8.
14. Mytar B.I., Siedlar M., Woloszyn M.
et al. Cross-talk between human monocytes and cancer cells during reactive oxygen intermediates generation: the essential role of hy-aluronan. Int J Cancer 2001;94(5):727-32.
15. Zhang H.-G., Kim H., Liu C. et al. Cur-cumin reverses breast tumor exosomes mediated immune suppression of NK cell tumor cytotoxicity. Biochim Biophys Acta 2007;1773(7):1116-23.
16. Valenti R., Huber V., Iero M. et al. Tumor-released microvesicles as vehicles of im-munosuppression. Cancer Res 2007;67(7):2912-5.
17. Woodman P.G., Futter C.E. Multivesicular bodies: co-ordinated progression to maturity. Curr Opin Cell Biol 2008;20(4):408-14.
18. Al-Nedawi K.I., Meehan B., Micallef J. et al. Intercellular transfer of the oncogenic receptor EGFRvIII by microvesicles derived from tumour cells. Nat Cell Biol 2008;10(5):619-24.
19. Ciesla M., Skrzypek K., Kozakowska M. et al. MicroRNAs as biomarkers of disease onset. Anal Bioanal Chem 2011;401(7):2051-61.
20. Malladi S., Macalinao D.G., Jin X. et al. Metastatic latency and immune evasion through autocrine inhibition of WNT. Cell 2016;165(1):45-60.
21. Pollard J.W. Defining metastatic cell latency. N Engl J Med 2016;375(3):280-2.
22. Lee H.J., Kim J.A., Kwon M.H. et al. In situ single step detection of exosome mi-
croRNA using molecular beacon. Biomaterials 2015;54:116-25.
23. He M., Crow J., Roth M. et al. Integrated immunoisolation and protein analysis of circulating exosomes using microfluidic technology. Lab Chip 2014;14(19):3773-80.
24. Wubbolts R., Leckie R.S., Veenheizen P.T. et al. Proteomic and biochemal analyses of human B-cell derived exosomes. Potential implications for their function and multive-sicular body formation. J Biol Chem 2003;278(13):10963-72.
25. Subra C., Laulagnier K., Perret B., Record M. Exosome lipidomics unravels lipid sorting at the level of multivesicular bodies. Biochimie 2007;89(2):205-12.
26. Lamparski H.G., Metha-Damani A., Yao J.Y. et al. Production and characterization of clinical grade exosomes derived from dendritic cells. J Immunol Methods 2002;270(2):211-26.
27. Gonzales P.A., Zhou H., Pisitkun T. et al. Isolation and purification of exosomes in urine. Methods Mol Biol 2010;641:89-99.
28. Koga K., Matsumoto K., Akiyoshi T. et al. Purification, characterization and biological significance of tumor-derived exosomes. Anticancer Res 2005;25(6A):3703-7.
29. Delcayre A., Le Pecq J.B. Exosomes as novel therapeutic nanodevices. Carr Opin Mol Ther 2006;8(1):21-38.
30. Viaud S., Théry C., Ploix S. et al. Dendritic cell-derived exosomes for cancer im-munotherapy: what's next? Cancer Res 2010;70(4):1281-5.
31. Zitvogel L., Regnault A., Lozier A. et al. Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell-derived exosomes. Nat Med 1998;4(5):594-600.
E
re
09
E
