CC BY
53
бактериям вида L. delbrueckii subsp. bulgaricus. В резуль- Сконструированную систему праймеров для выявления
тате были синтезированы праймеры, входящие в состав гена 16S рРНК можно использовать в реакции в качестве
тест-системы, которые позволяют выявлять отличия лак- видоспецифической для L. delbrueckii subsp. bulgaricus. Ее
тобактерий от других видов микроорганизмов. применение будет способствовать расширению возмож-
Оптимальные параметры реакции: 950С - 200 с - 1 цикл, ностей исследователей при молекулярно-генетической
[620С - 50 с, 950С - 20 с] - 25 циклов, 720С - 120 с - 1 цикл. характеристике лактобацилл.
Литература.
1. Ермолаев В.А., Комарова Н.А., Курбанова М.Г. Интенсификация процесса вакуумного обезвоживания молочно-белковых продуктов //Хранение и переработка сельхозсырья. 2012. № 2. С. 8-1l.
2. Курбанова М.Г., Масленникова С.М., БондарчукО.Н. Исследование закономерностей получения кислотныхгидролизатов казеина // Вестник Алтайского государственного аграрного университета. 2013. № 12 (110). С. 101-105.
3. Ботина С.Г. Видовая идентификация и паспортизация молочнокислых бактерий методами молекулярно-генетического типирования / Молочная промышленность. 2008. № 3. С. 52-54.
4. Torriani S., Zapparoli G., Dellaglio F. Use of PCR-Based methods for rapid differentiation of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and L. delbrueckii subsp. lactis//Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. № 10. P. 4351-4356.
5. Питательные среды для микробиологического контроля качества лекарственных средств и пищевых продуктов: справочник/ В.А. Галынкин, Н.А. Заикина, В.И. Кочеровец, И.З. Курбанова; под ред. В.А. Галынкина и В.И. Кочеровца. СПб.: Проспект науки, 2006. 336 с.
6. Беспоместных К.В., Короткая Е.В. Идентификация бактерий рода Lactobacillus с использованием ПЦР-тест-системы// Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. 2011. № 7-8. С. 109-117.
development of TEST-SYSTEMS for THE iDENTiFicATioN oF MicRooRGANiSMS
of the bacterial ferments
K.V. Bespomestnykh
Kemerovo State Institute of Agriculture
Summary. This article presents the results of research to develop a PCR-test-system for indication and identification of lactic acid bacteria starter cultures used in the manufacture of dairy products. The nucleotide sequence of DNA encoding 16S rRNA synthesis of bacteria of the genus Lactobacillus, submitted to GenBank, to identify conserved regions of nucleic acid sequences and for laying the genus-specific species-specific primers. Designed new genus-specific and species-specific primers for the identification of bacteria of the genus Lactobacillus, with significant differences from other lactic acid bacteria genera and species. Theoretical specificity synthesized primers confirmed experimentally bacterial ferments, concentrates and dairy products. Revealed that virtually created primers have the highest degree of homology to the nucleotide sequence of DNA sections 16S rRNA microorganisms L. delbrieckii subsp. bulgaricus and have high specificity. They can detect a particular species of microorganism the difference with respect to other bacteria and to determine their quantitative content in the product. The optimal values of the 16S rRNA gene amplification of lactic acid bacteria (temperature, incubation time, number of cycles): 95 0С - 200 sec - 1 cycle [62 0С - 50 sec, 95 0С - 20 sec] - 25 cycles of 72 0С - 120 sec - 1 cycle. A comparative evaluation of the species specificity of PCR with the classical biochemical methods. The results of identification of species other L. bulgaricus and Lactobacillus obtained using polymerase chain reaction are comparable to the classical biochemical identification methods based on different species saccharolytic activity of lactobacilli. Experimentally confirmed the higher specificity and sensitivity of PCR-test-systems for the identification of lactic acid bacteria belonging to the bacterial starters. Studies have been conducted on a wide range of dairy products. Keywords: polymerase chain reaction primers, bacteria of the genus Lactobacillus, milk products , quality control.
УДК 663.52+663.03
перспективы использования экструдата ржи в биотехнологии этанола
A.Ю. ШАРИКОВ, кандидат технических наук, научный сотрудник
B.И.СТЕПАНОВ, кандидат технических наук, зав. отделом
В.В. ИВАНОВ, кандидат технических наук, ведущий научный сотрудник
Л.В. РИМАРЕВА, член-корреспондент Россельхозака-демии, зам. директора
Н.И. ИГНАТОВА, старший научный сотрудник Л.И. СКВОРЦОВА, научный сотрудник ВНИИ пищевой биотехнологии Россельхозакадемии E-mail: [email protected]
Резюме. Основные тенденции развития биотехнологии этанола - повышение концентрации перерабатываемых сред и использование трудноперерабатываемого зернового сырья, прежде всего, ржи. Одновременная их реализация в рамках традиционной технологии ограничена в силу резкого ухудшения реологических свойств высококонцентрированных ржаных гидролизатов. В качестве альтернативы традиционной водно-тепловой обработке при подготовке сырья к осахариванию предложено использование варочной экструзии. Проведены исследования влияния экструзии ржи на процесс ее дальнейшей биконверсии
в этанол. Показана возможность получения гидролизатов ржи с концентрацией 30% растворимых сухих веществ с приемлемыми реологическими свойствами. На этапе получения гидролизата установлена необходимость использования совместно с альфа-амилазой и протеазой гемицеллюллитического ферментного комплекса в количестве не менее 0,15 единиц ксиланазной способности на 1 г сухих веществ. На стадии разжижения уже к 30 мин. биокатализа динамическая вязкость опытного гидролизата ржи снизилась до 0,5 Пас, что свидетельствует о ее пригодности для дальнейшей биоконверсии. По результатам бродильных проб с использованием осмофильной расы дрожжей Saccharomyces cerevisiae концентрация спирта в браге и выход спирта опытного образца из экструдата ржи составили 15,09 об.% и 64,7 дал/т условного крахмала соответственно, что на 1 об.% и 2,25 дал/т условного крахмала выше, чем в контроле, предусматривающем применение механико-ферментативной обработки. Концентрация побочных метаболитов спиртового брожения в опытном образце браги составила 2844 мг/дм3, в контроле - 4664 мг/дм3. Максимальные различия отмечены для изоамилола, 2-фенилэтанола и изобутанола. По содержанию летучих кислот, сложных эфиров и альдегидов отличия не существенны. Экструзия ржи обеспечивает значительное сокращение времени подготовки зернового сырья к осахариванию и улучшение биохимических показателей брожения концентрированного ржаного сусла: увеличивается выход спирта, снижается количество побочных метаболитов.
Ключевые слова: спиртовое производство, рожь, экструзия, биоконверсия, высокие концентрации, вязкость, побочные метаболиты.
Целесообразность использования зерна ржи в качестве субстрата биотехнологических производств определяется, прежде всего, экономическими предпосылками и связана с заменой более дорогостоящего зерна пшеницы. Например, в производстве этилового спирта из пищевого сырья на сегодняшний день оно широко используется, наряду с пшеницей [1]. В контексте тенденции повышения концентрации перерабатываемых крахмалсодержащих сред спиртового производства использование ржи в качестве источника сбраживаемых углеводов может вызвать определенные технологические трудности. Переход к высоким концентрациям сусла в случае ее переработки затруднен в силу некоторых биохимических свойств, а именно высокого содержания некрахмалистых полисахаридов [1, 2]. Увеличение концентрации сухих веществ в зерновом замесе в этом случае вызывает значительный рост вязкости перерабатываемой среды и влечет за собой риск потери транспортабельности гидролизатов по технологическим коммуникациям и образования заторов. Частичным решением возникающих проблем служит расширение спектра применяемых ферментных препаратов различной субстратной специфичности и увеличение их дозировок [3, 4]. Кроме того, предлагается использование дополнительных технологических стадий, например, гидротермической обработки зерна с применением роторно-пульсационных агрегатов [5] и др.
Цель нашего исследования - изучение возможности использования технологии варочной экструзии в качестве способа получения высококонцентрированного ржаного сусла с одновременным исключением традиционной многостадийной водно-тепловой обработки зернового сырья.
Условия, материалы и методы. Экструзия обеспечивает глубокую деструкцию зерна и значительно изменяет его структурные и биохимические свойства, увеличивает степень ферментативной атакуемости биополимеров [6]. Ранее было установлено [7], что экс-трудирование пшеницы позволяет получать сусло для спиртового производства с 30%-ной концентрацией растворимых сухих веществ и показателями брожения, соответствующими, а для некоторых режимов даже превосходящими, контроль и установленные нормативы.
Экструзионную переработку зерна ржи осуществляли с использованием экструдера Werner&Pfleiderer Continua 37. Режимные параметры подбирали с расчетом обеспечения достаточной для последующей биоконверсии клейстериза-ции крахмала. Температура процесса находилась в пределах 178...185 С, общее влагосодержание перерабатываемого сырья, включающее собственную влажность и дополнительное увлажнение, - 15.17%, давление перед матрицей - 1,5 МПа, крутящий момент на валу двигателя - 40%.
Для разжижения концентрированных ржаных сред использовали гидролитические ферменты: мезофильную а-амилазу ЛН 608 в дозировке 2 ед.АС/г усл.крахмала, грибную протеазу Максазим — 0,5 ед.ПС/г сухих веществ и препарат грибной гемицеллюлазы Брюзайм, обладающий ксиланазной, р-глюканазной и цитолитической способностями, - 0,15 ед.КС/ г сухих веществ из расчета по ксиланазе. В качестве осахаривающего фермента применяли глюкоамилазу Глюкомил Л706. Динамическую вязкость образцов гидролизатов ржи измеряли методом вибрационной вискозиметрии с использованием вибрационного вискозиметра SV-10. Биохимические показатели осахаренного сусла и зрелой браги определяли в соответствие с принятыми в отрасли методами [8].
Эффективность процессов сбраживания опытных и контрольных зерновых гидролизатов оценивали методом бродильной пробы. В качестве контроля использовали сусло ржи, полученное осахариванием после механико-ферментативной обработки (МФО), в которой ржаной замес подвергается многостадийному ферментативному гидролизу в интервале температур 40.95 °С. При этом длительность экспозиции превышает 2 ч. Для сбраживания использовали биомассу дрожжей расы Saccharomyces Cerevesiae 1039 - осмофильный штамм, селекционированный ВНИИПБТ [9]. По результатам сбраживания в зрелой браге определяли объем этилового спирта и его выход, содержание несброженных и общихуглеводов. Концентрацию побочных метаболитов спиртового брожения учитывали методом газожидкостной хроматографии [10].
Приведенные в работе экспериментальные данные представлены в виде средних значений по результатам двух параллельных измерений с условием отсутствия превышения расхождения между ними и их среднеарифметическим значением 5% среднего значения при доверительной вероятности Р = 0,95.
результаты и обсуждение. Поскольку главная проблема получения высококонцентрированных биотехнологических сред из ржи - значительное увеличение динамической вязкости и потери текучести, первым этапом исследований стало изучения влияния ферментов различной субстратной специфичности на реологические показатели гидролизатов из экструдированного зерна.
Вязкость гидролизатов ржи с концентрацией 30% растворимых сухих веществ, обработанных а-амилазой отдельно и в сочетании с протеазой сначала резко возрастала, а затем постепенно снижалась (см. рисунок).
5Т--1
о о
0 -;-;-1
0 10 20 30 40 50 60 70
Время гидролиза, мин
рисунок. Динамика изменения вязкости ржаных концентрированных сред, обработанных различными ферментными препаратами. Используемые ферменты: —•— - а-амилаза; -т— а-амилаза + протеаза; - а-амилаза + протеаза + гемицеллюлолитический комплекс.
При этом характер кривых для обоих образцов был оди -наковым, величины показателя вязкости примерно равны и составили на 60 мин. гидролиза около 3,5 Пас. Пик вязкости на 15 мин. гидролиза и общее ее увеличение можно объяснить набуханием, растворением некрахмалистых полисахаридов ржи, основными компонентами которых служат р-глюкан и пентозаны, и отсутствием в реакционной среде биокатализатора, способного их гидролизовать. Значения вязкости, превышающие 3 Пас считаются неприемлемыми для использования на дальнейших стадиях технологического процесса спиртового производства. Поэтому единственным образцом, удовлетворяющим необходимым требованиям по реологии, стал гидролизат, обработанный не только ферментными препаратами- источниками а-амилазы и протеазы, но и гемицеллюлолити-ческим препаратом Брюзайм - источником ксиланазы и р-глюканазы. Использование такой комплексной системы
Таблица. результаты сбраживания опытного и контрольного сусла ржи
Экст- Норма-
Показатель МФО рудиро- тивный
ванная показа-
рожь тель
Концентрация растворимых 28,2 30,2 Не нор-
сухих веществ в сусле, % мируется
Несброженные углеводы,
г/100 г 2,24 2,05 0,45
Общие углеводы, г/100 г 2,34 2,20 1,15
Концентрация спирта, об.% 14,09 15,09 8,0.9,0
Выход спирта, дал/т усл.
крах. 62,45 64,70 65,5
Концентрация побочных ме- Не нор-
таболитов в отгоне, мг/дм3 4664 2844 мируется
обеспечило последовательное снижение динамической вязкости к 30 мин. гидролиза до 0,5 Пас.
Анализ результатов сбраживания ржаного сусла, приготовленного различными способами показал, что по концентрации несброженных и общих углеводов, а также выходу спирта оба образца уступают требованиям нормативов (см. табл.). Но с учетом того, что нормативы разработаны для сред с концентрацией растворимых сухих веществ 16.18%, такие отклонения можно считать приемлемыми. Сравнение образцов между собой указывает на преимущество использования для подготовки зерна ржи к сбраживанию экструзионной обработки. По всем показателям, в том числе по концентрации спирта в браге и содержанию побочных метаболитов,
опытный образец превосходит образец с механико-ферментативной обработкой.
Основная категория примесей, по содержанию которой контрольный образец уступает опытному, - компоненты сивушного масла. Наибольшие различия в концентрациях отмечены для изоамилола (2137 и 1075 мг/дм3 соответственно), 2-фенилэтанол (880 и 361 мг/дм3), изобутанол (561 и 311 мг/дм3). По содержанию летучих кислот, сложных эфиров и альдегидов отличия не так значительны.
выводы. В результате проведенных вискозиметриче-ских исследований установлена возможность получения высококонцентрированных гидролизатов из экструдатов ржи с содержанием растворимых сухих веществ 30% и приемлемыми для дальнейшей биотехнологической переработки реологическими свойствами. Показана необходимость использования на стадии разжижения гидро-лизата совместно с а-амилазой ферментов, гидролизую-щих некрахмалистые полисахариды ржи. Биоконверсия ржаного сусла в этанол демонстрирует преимущество экструзионной обработки, по сравнению с традиционным механико-ферментативным водно-тепловым способом. Предлагаемый подход обеспечивает улучшение биохимических показателей брожения ржаного сусла.
Экспериментальные данные, полученные при проведении представленной работы, позволяют создать научный задел для развития технологий переработки труднопе-рерабатываемых видов зерна, таких как рожь и ячмень, с совмещением гидротермомеханических и биотехнологических процессов.
Литература.
1. Абрамова И.М. Особенности переработки ржаного сырья, обеспечивающие производство спирта с высокими показателями качества// Производство спирта и ликероводочных изделий. 2011. №4. С.8-10.
2. Поляков В.А. Биотехнология переработки зернового сырья в производстве солода, пива, алкогольных и безалкогольных напитков. М.: Пищепромиздат, 2002. 176 с.
3. Интенсификация переработки ржи на этанол с использованием мультиэнзимного комплекса / А.Н. Яковлев, О.С. Кор-неева, С.В. Востриков, С.Ф. Яковлева //Производство спирта и ликероводочных изделий. 2009. №4. С.12-14.
4. Теоретические и практические основы ферментативного катализа полимеров зернового сырья в спиртовом производстве /Л.В. Римарева, М.Б. Оверченко, Н.И. Игнатова, И.М. Абрамова//Производство спирта и ликероводочных изделий. 2008. №3. С.4-9.
5. Поляков В.А., Туршатов М.В. Научно-технологические аспекты глубокой очистки зерна в спиртовом производстве// Хранение и переработка сельхозсырья. 2008. №6. С.50-54.
6. Mercier C., Linko P., Harper J.M. Extrusion Cooking. USA, St. Paul, MN.: American Association of Cereal Chemists, 1989. 471 p.
7. Влияние режимов экструзионной обработки зернового сырья на эффективность биотехнологических процессов в перерабатывающих отраслях АПК/ А.Ю. Шариков, Л.В. Римарева, В.И. Степанов, В.В. Иванов, Н.И. Игнатова, О.В. Веселовская // Хранение и переработка сельхозсырья. 2012. №5. С.18-21.
8. Инструкция по технохимическому и микробиологическому контролю спиртового производства / В.А. Поляков, И.М. Абрамова, Г.В. Полыгалина, Л.В. Римарева, Г.Т. Корчагина, Е.Н. Пискарева. М.:ДеЛиПринт.-2007.-480с.
9. Осмофильный штамм спиртовыхдрожжей Saccharomyces cerevisae 1039для сбраживания концентрированного зернового сусла /Л.В. Римарева, М.Б. Оверченко, Н.И. Игнатова, Е.М. Серба // Производство спирта и ликероводочных изделий. 2012. №3. С.6-11.
10. Контроль качества алкогольной продукции и биотехнологических процессов переработки сельскохозяйственного сырья в этиловый спирт с использованием хромато-масс-спектрометрических, газохроматографических и электрофоретических методов анализа/Н.В. Шелехова, Т.М. Шелехова, О.В. Веселовская, О.А. Овчинников, Л.И. Скворцова//Производство спирта и ликероводочных изделий. 2012. №3. С.32-34.
prospects of using the rye extrudate in ethanol biotechnology
A.Yu. Sharikov, L.V. Rimareva, V.V. Ivanov, V.I. Stepanov, N.I. Ignatova, L.I. Skvortsova Russian Research Institute of Food Biotechnology Russian Academy of Agricultural Sciences Summary. Main trends in development of ethanol biotechnology are fermentation of very high-gravity mashes and usage of grains which are difficult to process, e.g. rye, barley. Combination of these trends within the framework of traditional ethanol technologies is limited due sharp deterioration of rheological properties of very-high-gravity rye mashes. An alternative to traditional water-thermal treatment of grain in ethanol tecnology can be extrusion cooking as processing stage before liquefaction and saccharification. Influence of extrusion cooking on process of very-high-gravity rye mash obtaining and its fermentation was investigated. Possibility to obtain rye hydrolyzates with solubles concentration about 30% (wt/vol) and acceptable rheological properties was shown. Studies indicated, that there was a need to use hemicellulose enzymes in mashing process in common with a-amylase and protease. Dynamic viscosity of very-high-gravity hydrolizate from extruded rye decreased notedly and was only 0,5 Pas on the moment of 30 minutes of liquefaction process. Fermentation studies with use of ethanol-tolerance strain of Saccharomyces cerevisiae indicated, that ethanol concentration and its yield within 72 hours were 15,09% (vol/vol) and 64,7 dkl of ethanol from 1 ton of fermentable carbohydrates. Fermentation of 30% (wt/vol) mash from extruded rye yielded 1% (vol/vol) more ethanol and 2,25 dkl/ton more ethanol yield in contrast with fermentation of mash which was obtained using traditional cooking technology. Concentrations of alcoholic fermentation by-products were 2844 and 4664 mg/ethanol dm3 for fermented mashes from extruded and non-extruded rye respectively. Maximum differences fixed for isoamilol, 2-phenylethanol and isobutanol. Differences in concentration of volatile acids, esters and aldehydes were not significant. According to fermentation results, extrusion of rye on cooking stage was shown to improve biochemical parameters of further fermentation such as high ethanol concentration and its yield, low concentration of alcoholic fermentation by-products. Key words: ethanol production, rye, extrusion, bioconversion, very high gravity fermentation, enzyme, viscosity, ethanol yield, byproducts of alcoholic fermentation.
