CC BY
39УДК 632.937.15:635.21
ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ МИКРОБОВ-АНТАГОНИСТОВ ДЛЯ ЗАЩИТЫ КАРТОФЕЛЯ ОТ БОЛЕЗНЕЙ ПРИ ХРАНЕНИИ
И.И. Новикова*, И.В. Бойкова*, В.А. Павлюшин*, В.Н. Зейрук**, С.В. Васильева**, Р.Р. Азизбекян***, Н.И. Кузнецова***
*Всероссийский НИИ защиты растений, Санкт-Петербург **Всероссийский НИИ картофельного хозяйства им.Лорха, Московская обл.
***ФГУП НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва
Проведено изучение биологической эффективности образцов биопрепаратов на основе отсе-лектированных штаммов BrevibacilluslaterosporusBl 101, BacillussubtilisM-22 и Bacillussubtilis - И5-12/23 в лабораторных условиях и в картофелехранилище в опыте по длительному хранению картофеля. В лабораторных опытах образцы биопрепаратов показали высокую биологическую эффективность против возбудителей грибных болезней картофеля - ризоктониоза и серебристой парши (42.2-77.8%). Обработка клубней перед закладкой на хранение в картофелехранилище снижала количество больных грибными и бактериальными болезнями клубней и повышала выход здорового картофеля в 2.6-2.7 раза. Биологическая эффективность образцов биопрепаратов на основе отселектированных штаммов B. subtilis - И5-12/23 и B. laterosporus Bl 101 в отношении кольцевой гнили, сухой гнили и фитофтороза достигала 55-90% и была существенно выше эффективности химического стандарта препарата максим КС. Хозяйственная эффективность применения образцов биопрепаратов увеличивалась на 7.1-10.9%.
Ключевые слова: микробы-антагонисты, биопрепараты, фитопатогенные грибы и бактерии, биологическая эффективность, болезни клубней.
Картофель - одна из основных сельскохозяйственных культур, используемая как на продовольственные и кормовые цели, так и в качестве сырья для перерабатывающей промышленности. Потенциальная продуктивность картофеля в оптимальных условиях достигает 60-100 т/га. Реальные урожаи в странах ЕврАзЭС значительно ниже, и качество клубней не всегда отвечает современным требованиям. Одна из основных причин снижения эффективности картофелеводства - сильное развитие болезней на растениях и клубнях в период вегетации и во время хранения, потери урожая от которых могут достигать 30-50% и более. Возросла вредоносность многих хорошо известных заболеваний - фитофтороза, аль-тернариоза, всех видов парши, черной ножки. Участились случаи появления кольцевой гнили - особенно опасного бактериального заболевания картофеля.
В настоящее время важная тенденция производства сельскохозяйственных продуктов - использование экологически малоопасных средств защиты растений. Широкое применение химических фунги-
цидов не всегда безопасно для теплокровных и способствует формированию резистентных популяций фитопатогенных видов - возбудителей болезней. В основе современной концепции защиты растений лежат представления о необходимости перехода от отдельных приемов и методов к «конструированию» интенсивных экологически устойчивых агроэкосистем. При этом существенный вклад в обеспечение экологического равновесия должна внести оптимизация системы трофических связей и других механизмов саморегуляции биоценозов.
Главными показателями адаптивности сельского хозяйства, наряду с ростом урожайности и качества продукции, являются ресурсо-, энергоэкономичность технологий и природоохранный эффект, оптимизация среды обитания полезных организмов, повышение стрессоустойчи-вости агроэкосистем (Жученко, 1994; Жу-ченко и др., 2008,2009). С точки зрения современного системного подхода, растения в биогеоценозе составляют ядро сложных биологических систем-консорций, включающих разнообразные группы гетеро-
Вестник защиты растений, 4, 2013 трофов, в том числе специфический микробиоценоз возбудителей болезней, их антагонистов и гиперпаразитов. При этом все микроорганизмы каждого трофического уровня находятся в постоянном био-ценотическом процессе, формирующем фитосанитарное состояние экосистемы. Микробиологическая защита сельскохозяйственных культур от болезней, преимущественно, основана на биоценотиче-ских принципах и представляет собой важнейшую часть биологической защиты в целом. Технологии микробиологической защиты базируются на использовании биологического разнообразия микроорганизмов-антагонистов и гиперпаразитов возбудителей болезней растений с полифункциональным типом действия на растения и фитопатогенные микроорганизмы. В связи с этим весьма актуальна задача поиска активных антагонистов фитопато-генных микроорганизмов и разработки на их основе новых биопрепаратов для включения в современные технологии фи-тосанитарной оптимизации агроэкоси-стем. Подобный подход должен быть основан на использовании штаммов микробов-антагонистов или их ассоциаций, обладающих высокой полифункциональной антагонистической активностью, эффективными жизненными стратегиями и высокой конкурентоспособностью в агроэкосисте-мах. Наиболее полно отвечают таким требованиям и перспективны для интродукции в микробиоценоз с целью регуляции плотности фитопатогенных популяций представители рода бацилл.
Подавление различных фитопатогенов бактериями рода Bacillus было продемон-
стрировано на целом ряде болезней овощных культур и картофеля (Азаматова, Габрилович, 1989; Centurion et al., 1994; Ко-зачко и др., 1995; Попов и др., 1995; Dolej, Bochow, 1996; Marrone et al., 1999). Японские исследователи сообщали о значительном влиянии штаммов B. subtilis, выделенных из компостов, на супрессивность почвы по отношению к фитопатогенным грибам (Phae et al., 1990).
Новые биопрепараты на основе бацилл (бактофит, битоспорин, алирин-Б, гамаир, витаплан и другие) с успехом применяют для борьбы с болезнями сельскохозяйственных культур. Биологические препараты зарекомендовали себя как эффективные, экологически безопасные и альтернативные синтетическим химическим соединениям (Коробкова и др., 1987; Burkhard et al., 1991; Berdian, 1996; Смирнов и др., 1998). Ряд коммерческих биопрепаратов на основе B.subtilis создан за рубежом (Попов, 1990; Collins et al., 1994).
В результате скрининга штаммов бацилл из Государственной коллекции микроорганизмов ГНУ ВИЗР и ВКПМ ФГУП НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов по признаку антагонистической активности в отношении возбудителей болезней картофеля при хранении были отобраны наиболее перспективные штаммы B. later-osporus Bl 101, B. subtilis М-22 и B. subtilis - И5-12/23. Цель работы - изучение биологической эффективности образцов биопрепаратов на основе
отселектированных штаммов в лабораторных условиях и в картофелехранилище.
Изучение биологической образцов биопрепаратов на основе
отселектированных штаммов В. ¡аЬвговроги В1 101, В. БиЫШв М-22 и В. БиЫШв - И5-12/23 осуществляли в соответствии со стандартными методиками, изложенными в следующих пособиях: «Методика исследований по культуре картофеля», М., 1967; «Методика полевого опыта», М, 1985; «Методические указания по государственным испытаниям фунгицидов, антибиотиков и протравителей семян сельскохозяйственных культур», М., 1965; «Методика исследований по защите картофеля от
Методика исследований
эффективности болезней, вредителей, сорняков и иммунитету», М., 1995; «Методические указания по регистрационным испытаниям фунгицидов в сельском хозяйстве», Санкт-Петербург, 2009.
Лабораторные опыты были заложены 18 декабря 2012 г. с учетом динамики развития заболеваний в насыпи клубней в картофелехранилище в основной период хранения. Для проведения опытов были отобраны клубни с признаками болезней.
В лабораторных опытах для определения влияния образцов биопрепаратов на прорастание склероциев ризоктониоза и развитие спороношения
серебристой парши клубни обрабатывали рабочей жидкостью с титром жизнеспособных клеток 108 и 109 КОЕ/мл. В стандарте клубни обрабатывали препаратом максим КС (0.2 л/т), в контроле - водой. После обработки клубни были заложены во влажные камеры. По истечении 2-7 дней были проведены учеты интенсивности спороношения грибов, вызывающих ризоктониоз (Rhizoctonia solani Kuhn.) и серебристую паршу картофеля (Helmintosporium solani Dur.ex.Mont).
Закладка клубней картофеля на длительное хранение с целью оценки биологической эффективности образцов биопрепаратов в отношении комплекса болезней была проведена в картофелехранилище № 1 ГНУ ВНИИКХ (Московская область, Люберецкий район, п. Красково, микрорайон Коренево) 06. 09. 2012 года.
В опыте использовали клубни сорта Сантэ (сред-неранний, универсального использования). Урожайность высокая. Сорт устойчив к раку картофеля
Результаты
Попытки использования микробов-антагонистов в защите картофеля от фи-топатогенов предпринимались давно. Обширные исследования посвящены оценке возможности использования штаммов дрожжей, выделенных из почвы в местах с наименьшей пораженностью клубней сухой фузариозной гнилью (Fusarium sambucinum и F. solani var. coeruleum) (Schisler et al., 2000). Однако существенного результата получено не было. Более эффективно применение штаммов бактерий. Против возбудителей черной ножки картофеля Erwinia carotovora var. atroseptica и E. aroideae, а также сухой фузариозной гнили F. sambucinum была изучена активность более 200 штаммов бактерий рр. Bacillus, Erwinia и Pseudomonas (Дорожкин и др., 1991). Выявлены штаммы B. mycoides и P. xanthochlora, перспективные для разработки способов микробиологической защиты картофеля. Показано влияние состава микофлоры почвы, в том числе почвообитающих микробов-антагонистов из р. Trichoderma, на развитие двух патогенов картофеля (F sulfureum Schl. и F. coeruleum Sacc.) На интенсивность развития болезней картофеля, в том числе и фитофтороза, может оказать существенное влияние и микрофлора поверхности клубней (Clulow et al.,
(возб. Synchytrium endobioticum), золотистой картофельной цистообразующей нематоде (Globodera rostochiensis), вирусным болезням, восприимчив по ботве к фитофторозу. Среднеустойчив к обыкновенной парше, восприимчив к ризоктониозу и фомозу. Набор материала для проведения опытов был произведен через 3 дня после уборки урожая. Перед обработкой и закладкой на хранение проводили клубневой анализ с целью определения фитопатологиче-ского состояния картофеля. Перед закладкой на хранение клубни обрабатывали рабочей жидкостью образцов биопрепаратов с титром жизнеспособных клеток 108 и 109 КОЕ/мл. В стандарте клубни обрабатывали препаратом максим, КС (0.2 л/т), в контроле - водой. Расход рабочей жидкости - 3 л/т. Масса образца клубней картофеля составляла 5 кг. По-вторность опыта - 10-кратная. Общая масса клубней каждого варианта - 50 кг. Место размещения образцов: в насыпи картофеля на глубине 20-30 см от поверхности.
Экспериментальные данные статистически обработаны посредством дисперсионного анализа.
исследований 1995).
Показано, что интенсивность развития болезней картофеля зависит от численности и состава антагонистов. На эффективность биопрепаратов положительное действие оказывают и агротехнические приемы (Kurzawinska, 1992). Изучено влияние отселектированных штаммов р. Strep-tomyces на подавление возбудителя обыкновенной парши картофеля (Liu et al.. 1995,1996). Изучение биоразнообразия и антагонистической активности эпифит-ных микроорганизмов, выделенных с клубней картофеля, показало, что наиболее активны штаммы рр. Bacillus и Pseudomonas (Бельская и др., 1995). Ф.А.Попов с соавторами продемонстрировали, что штамм Bacillus megaterium способен подавлять развитие Xanthomonas cam-pestris pv. campestris, E. carotovora subsp. carotovora, E. carotovora var. atroseptica (1995). Таким образом, рядом исследователей убедительно доказана перспективность использования биопрепаратов на основе микробов-антагонистов для защиты картофеля от болезней в период вегетации. До сих пор эффективность применения антагонистов для снижения пора-женности клубней картофеля болезнями в процессе длительного хранения не изучена.
Результаты оценки биологической эф-
фективности отселектированных штаммов бацилл для снижения пораженности картофеля болезнями при хранении приведены в таблицах 1 и 2. Полученные данные свидетельствуют о снижении количества проросших склероциев и достаточно высокой эффективности образцов биопрепаратов в отношении ризоктониоза клубней. Однако они существенно уступа
ли по эффективности химическому стандарту - максиму КС. Так, в начале учетов биологическая эффективность образцов на основе штаммов В. иЬйй? И-5 12/23 и В. ЫвгоБрогиБ В1 101 составляла 36.3-44.1% соответственно. Затем биологическая эффективность несколько снизилась и не превышала 42.2%, тогда как стандартный препарат полностью подавил развитие болезни.
Таблица 1. Биологическая эффективность образцов биопрепаратов _в отношении ризоктониоза клубней картофеля_
Варианты (титр клеток в рабочем растворе образца биопрепарата, КОЕ/мл) 20.12.2012 24.12.2012
проросших склероци-ев, Р, % развитие болезни, R, % биологич. эффект.,% проросших склероци-ев, Р, % развитие болезни, R,% биологич. эффект.,%
Контроль, вода 28.0 10.2 0 95.1 33.4 0
B. subtilis М-22, 109 33.6 8.2 19.6 89.8 27.6 17.4
B. subtilis И-5 12/23, 109 24.1 6.5 36.3 98.6 25.8 22.8
B.subtilis И-5 12/23, 108 32.8 8.4 17.6 97.7 27.9 16.5
B. la terosporus Bl 101, 109 33.6 8.7 14.7 89.5 23.2 30.5
B. la terosporus Bl 101, 108 28.3 5.7 44.1 74.4 19.3 42.2
максим КС, стандарт, 0.2 л/т 0 0 100.0 8.7 1.7 97.9
НСР 0,95 1.2 1.4 4.3 0.9
В борьбе с паршой серебристой (табл. 2) изучаемые образцы биопрепаратов показали высокую биологическую активность в сравнении со стандартом.
Таблица 2. Биологическая эффективность образцов
биопрепаратов в отношении спороношения _серебристой парши на клубнях картофеля_
Варианты (титр клеток в рабочем растворе образца биопрепарата, КОЕ/мл) Второй учет (28.12.2012) Биологическая,
доля клубней со спо-роношени- развитие болезни, эффективность, %
ем, Р, % R,% Р,% R,%
Контроль, вода 90.0 36.0 0 0
B. subtilis М-22, 109 70.0 16.0 22.2 55.6
B. subtilis И-5
12/23, 109 40.0 8.0 55.6 77.8
B.subtilis И-5
12/23, 108 40.0 8.0 55.6 77.8
B. la terosporus Bl 101, 109 50.0 12.0 44.4 67.7
B. la terosporus Bl 101, 108 70.0 14.0 22.2 61.1
Максим КС,
стандарт, 0.2 л/т 60.0 12.0 33.3 67.7
НСР 0,95 8.0 2.2
При проведении 1 -го учета ни в одном из вариантов опыта спороношения Не1-тшОзропит Бо1ат Биг.ех.МоШ отмечено не было. Результаты второго учета пока-
зали, что развитие болезни при использовании препарата на основе штамма B. sub-tilis И-5 12/23 при обеих концентрациях рабочего раствора было в 2 раза ниже по сравнению с образцом на основе штамма B. subtilis М-22 и в 4,5 раз - по сравнению с контролем. Биологическая эффективность в этом варианте опыта достигла 77.8%.
В целом, изучаемые образцы биопрепаратов существенно сокращали количество клубней картофеля со спороношени-ем возбудителя и снижали развитие парши серебристой. Показатели их биологической эффективности находились на уровне или превышали эффективность химического стандарта (61.1-77.8%).
Анализ результатов опыта в условиях картофелехранилища ВНИИКХ подтвердил данные лабораторных опытов. По окончании периода хранения в марте 2013 года был проведен клубневой анализ и определены пораженность болезнями и потери массы картофеля при хранении (табл. 3-5).
Отмечено существенное снижение развития болезней на клубнях семенного картофеля после обработки образцами
биопрепаратов и стандартом максим КС по сравнению с контролем. Количество здоровых клубней после применения биопрепаратов достигало 32.4-36.6%, в то время как в контроле этот показатель не превышал 13.3%. Таким образом, по сравнению с контролем выход здоровой продукции увеличился в 2.7 раза.
Все исследуемые образцы
биопрепаратов эффективно снижали пораженность клубней всеми
проявившимися заболеваниями, за
Вестник защиты растений. 4. 2013 исключением парши обыкновенной. Наибольший эффект образцы
биопрепаратов проявили в отношении возбудителей кольцевой и сухой гнилей картофеля. В варианте с применением образца биопрепарата на основе штамма В. БиЫШБ И5-12/23 распространенность кольцевой гнили составила 2.6-2.9%, сухой гнили - 1.5-3.0%, что значительно ниже этих показателей у образца на основе штамма В. БиЫШБ М-22 и максима КС (4.8 и 3.5%; 9.0 и 4.1% соответственно).
Таблица 3. Влияние образцов биопрепаратов на степень поражения клубней картофеля болезнями в период хранения (06.09.2012 - 26.03.2013)
Варианты (титр клеток в рабочем растворе образца биопрепарата, КОЕ/мл) Здо-ро-вых Доля пораженных клубней, % Биологическая эффек- тив-ность, %
Всего парша обыкновенная Str. scabies кольцевая гниль Clav. michiganensis vsepedonicum фитофто-роз Ph. infestans сухая гниль Phoma exigua
Контроль, вода 13.3 86.7 52.3 7.4 11.8 15.2 0
В. БиЫЖБМ-22. 109 30.4 69.6 47.3 4.8 8.5 9.0 19.7
В яЫй&И-5 12/23. 109 32.4 67.6 53.8 2.6 8.2 3.0 22.0
В.БиЪЬШБ И-5 12/23. 108 35.5 64.5 55.7 2.9 4.4 1.5 25.6
В Ыегороги В1 101. 109 32.4 67.6 50.1 4.2 7.8 5.5 22.0
В Ыегороги В1 101. 108 36.6 63.4 51.1 3.9 5.3 3.1 26.9
Максим КС, стандарт, 0.2 л/т 30.0 70.0 54.1 3.5 8.3 4.1 19.3
НСР 0.95 2.3 5.4 6.6 0.4 1.4 0.2
Таким образом, анализ результатов опыта показал, что обработка клубней образцами биопрепаратов перед закладкой на хранение в картофелехранилище уменьшала количество больных грибными и бактериальными болезнями клубней и повышала выход здорового картофеля в 2.62.7 раза. Биологическая эффектив-ность образцов биопрепаратов на основе отселектированных штаммов В. БиЫШБ И5-12/23 и В. Швговроги В1 101 в отношении кольцевой гнили, сухой гнили и фитофтороза достигала 55-90% и была существенно выше эффективности стандартного препарата максим КС (табл. 4).
Наиболее высокие показатели хозяйственной эффективности по сравнению с контролем были отмечены в варианте с применением образцов биопрепаратов на основе штаммов В. БиЫШБ И5-12/23 в обеих концентрациях рабочего раствора и В. ЫЬегоБрогиБ В1 101 при титре 108 КОЕ/мл. Хозяйственная эффективность достигала 107.1-110.9%.
Эти варианты опыта характеризовались самыми низкими потерями массы клубней в период хранения. Естественная убыль массы клубней была в 1.5 раза ниже, чем в контроле (табл. 5).
Таблица 4. Биологическая эффективность образцов биопрепаратов в сдерживании развития возбудителей болезней клубней картофеля в период хранения _(06.09.2012 - 26.03.2013)_
Варианты (титр клеток в рабочем растворе образца биопрепарата, КОЕ/мл) Биологическая эффективность в отношении возбудителей (%)
кольцевая гниль фито-фтороз сухая гниль
Контроль, вода - - -
В. БиЫШБ М-22, 109 35.1 28.0 40.8
В. БиЫШБИ-5 12/23. 109 64.9 30.5 80.3
В.БиЪ1 И-5 12/23. 108 60.8 62.7 90.1
В. 1а ЬегоБрогиБ В1 101. 109 43.2 33.9 63.8
В. 1а ЬегоБрогиБ В1 101. 108 47.3 55.1 79.6
Максим КС, стандарт, 0.2 л/т 52.7 29.7 73.0
Таблица 5. Влияние изучаемых образцов биопрепаратов на сохранность клубней картофеля _в период хранения (06.09.2012 - 26.03.2013)_
Варианты опыта, титр клеток в рабочем растворе образца биопрепарата, КОЕ/мл Масса клубней Хозяйственная эффективность, %
здоровых потери массы,%
кг % всего в том числе
технические отходы абсолютная гниль естественная убыль
Контроль, вода 3.66 73.2 26.8 8.0 8.4 10.4 100
В. БиЫШБ М-22, 109 3.04 60.7 39.3 6.2 18.3 14.8 83.1
В. БиЫШБ И-5 12/23, 109 3.92 78.5 21.5 7.3 4.2 10.0 107.1
В.БиЫШБ И-5 12/23, 108 4.06 81.3 18.7 4.6 7.7 6.4 110.9
В. 1а ЬегоБрогиБ ВШ 101, 109 3.64 72.9 27.1 6.3 12.0 8.8 99.4
В. 1а ЬегоБрогиБ В1 101, 108 3.97 79.4 20.6 5.0 8.4 7.2 108.5
Максим КС, стандарт, 0.2 л/т 3.69 73.9 26.1 5.3 7.2 13.6 100
НСР 0,95 0.02 1.3 1.1 2.1 0.9
Таким образом, проведенные исследования показали высокую эффективность лабораторных образцов препаратов на основе отобранных штаммов в отношении комплекса болезней картофеля при хранении. Механизм действия бацилл на фи-топатогенные виды, как правило, обусловлен комплексом факторов. К ним относятся высокая скорость размножения и конкурентоспособность, позволяющие не только выживать в меняющихся природных условиях в течение длительного времени, но и эффективно сдерживать нарастание плотности популяций фитопа-тогенов, а также способность синтезировать биологически активные соединения различной природы: гидролитические ферменты, антибиотики, сидерофоры и т.д. (Юдина, Егоров, 1996; Карпунина и др., 1997, 2003). Известно, что ряд споро-образующих бактерий рода Bacillus синтезирует биологически активные соединения, подавляющие развитие фитопато-генных грибов (Azizbekyan, 2004). Наиболее хорошо изучены фунгицидные факторы у штаммов B. subtilis. Так, известен микобациллин - циклический полипептид с широким противогрибным спектром действия (De Lucca et al, 1999). Класс ли-попептидных фунгицидов объединяет активные пептиды семейств итуринов, ба-цилломицинов, сурфактинов и фенгици-нов (Klich et al., 1991; Егоров, 1994; Azizbekyan, 2004). Выявлено стерол-фосфолипидное взаимодействие итуринов
и бацилломицинов с биомембранами грибов (Mhammedi et al., 1982). Мембранное действие этих веществ состоит в выходе из клеток катионов K+ и других ионов, что приводит к лизису клеток.
В ряде случаев фунгицидную активность бациллярных штаммов связывают с наличием у них поверхностно-активных веществ (ПАВ) (Volpon et al., 1999). Сур-фактины - сходные по строению с итури-нами анионные гидрофобные циклопепти-ды (Ahimou et al., 2000). В отличие от иту-ринов и бацилломицинов, молекулы сур-фактинов содержат аминокислоты с гидрофобными радикалами и бета-гидрокси-жирную кислоту. Спектр антагонистической активности сурфактинов сходен с таковым итуринов, причем отмечен синергизм их антигрибного действия при одновременном продуцировании бациллами. Сурфактины - одни из самых активных биосурфактантов, обладающих поверхностно-активными свойствами. Фенгицины (плипастатины) - антигрибные антибиотики - липопептиды, содержащие 10 аминокислотных остатков и N-концевую жирную кислоту (New, Poralla, 1990). Установлено ингибирующее действие факторов этого семейства фунгицидов на активность фосфолипазы А(2) (Hbid et al., 1996). Из нескольких штаммов B. licheniformis выделены низкомолекулярные полипептиды и липопептиды, обладающие фунгицидным эффектом (Gal-vez et al., 1993; Volpon et al., 2000). Штамм
B. cereus продуцирует звиттермицин А -линейный аминополиольный антибиотик, который эффективно подавляет развитие фитопатогенных грибов, бактерий и простейших (Oita et al., 1996). Этот бациллярный штамм секретирует также аминогли-козидный антибиотик канозамин, действующий в ряде случаев как синергист звиттермицина (Silo-Suh et al., 1998). Из штамма B. thuringiensis var. kurstaki выделены курстакины - катионные циклические липогептапептиды, обладающие фунгицидной активностью против Sstachybotris charatum (Broderick et al., 2000).
Таким образом, большая часть бациллярных антибиотиков и фунгицидов - пептиды и липополипептиды, которые принято классифицировать по механизму их действия. Группа пептидных антибиотиков вызывает лизис клеток. Лизирующие пептиды могут быть амфипатическими, нейтральными и гидрофобными молекулами, которые связываются с мембранной поверхностью и разрушают структуру мембраны без проникновения через нее (Hathout et al., 2000). Большинство пептидов, продуцируемых бациллами, - мембрано-активные соединения, способные встраиваться в биологические мембраны клеток-мишеней и вызывать их дезорганизацию, приводящую в конечном итоге к гибели клеток (Wieprecht et al., 1997; Hancock, Lehrer, 1998). Другие проходят через мембрану и специфически взаимодействуют с некоторыми молекулами (Saberwal, Nagaraj, 1994).
Некоторые амфипатические пептиды, агрегируя особым способом, формируют поры различных размеров, через которые происходит перенос ионов и других молекул. Мембранотропным действием обладают, кроме ферментов и поверхностно-активных веществ, и порообразующие цитолизины (Shai, 1995). Порообразующие цитолизины найдены у ряда бактерий, в том числе у бацилл. Эти вещества взаимодействуют с
цитоплазматическими мембранами
клеток-мишеней, вызывая образование в них пор определенного диаметра и, тем
самым, нарушают их целостность и барьерную функцию. Известно, что одна из функций интактных мембран клеток состоит в поддержании разницы состава внутриклеточной и внешней среды. При мембранных повреждениях внутрь клетки под действием сил осмотической природы поступают вода, ионы и молекулы. В результате происходит набухание клеток и последующий их лизис (Billington еЬ а1., 2000). Таким образом, очевидно, что наиболее активные бациллы-антагонисты способны
синтезировать комплексы БАВ различной химической природы, обладающие разными механизмами действия на клетки чувствительных микроорганизмов, что в целом обеспечивает эффективное подавление размножения фитопатогенных видов.
В последние годы разработаны технологии производства и применения ряда новых биопрепаратов на основе штаммов бацилл для защиты картофеля от болезней в период вегетации. В частности, в полевых и производственных опытах (ОПХ Суйда, Каложицы, Ленинградская область) показана высокая биологическая эффективность биопрепарата алирина-Б в отношении комплекса болезней картофеля - фитофтороза и альтернариоза по сравнению с химической защитой, включающей обработку растений препаратами ридомил, дитан, опсихом. Как показали наши исследования, основной антибиотик, синтезируемый штаммом-продуцентом, относится к группе бактериоцинов (Шенин и др., 1995). Предпосадочная обработка клубней и двукратное опрыскивание растений препаратом алирин-Б эффективно подавляли развитие фитофтороза в течение всего периода вегетации. Биологическая эффективность биопрепарата по сравнению с системой химической защиты составляла 45-60%. Еще более высока была эффективность алирина-Б в отношении альтернариоза: развитие болезни снижалось более чем на 50-70% по сравнению с контролем. Применение алирина-Б сдерживало распространенность фи-тофтороза на 50-65% в первый период ве-
Вестник защиты растений, 4, 2013 гетации и на 30-35% на более поздних сроках. Алирин-Б эффективно снижал распространенность альтернариоза: на 70% в первый период вегетации и на 40% на более поздних сроках. Применение алирина-Б увеличивало урожайность картофеля на 15 т/га, или на 5-15% по сравнению с контролем (химическая защита).
Показана перспективность использования в защите картофеля от фитофторо-за и альтернариоза комплексных биопрепаратов на основе композиций хитозана, иммобилизированных клетками штаммов микробов-антагонистов: B. subtilis B-10 -продуцента алирина-Б и B.subtilis M-22 -продуцента гамаира (Павлюшин и др., 2008). Биологическая эффективность композиций в полевых опытах (Тосненская станция СЗР ВИЗР) в отношении фитофтороза и макроспориоза составила 30-50%, прибавка урожая - 27-29%.
Недавно для защиты картофеля от ри-зоктониоза, фитофтороза и альтернариоза зарегистрирован и рекомендован для применения в России новый полифункциональный биопрепарат гамаир. Широкий спектр антагонистической активности штамма Bacillus subtilis M-22 - продуцента биопрепарата для защиты растений от грибных и бактериальных инфекций и по-
вышения урожайности сельскохозяйственных культур обусловлен сложным компонентным составом активного комплекса, включающего соединения различного химического состава: гамаир А- полипептид, близкий к бациллину, гамаир В- гексаеновый антибиотик, отнесенный к подгруппе 1А (медиоцидина), гамаиры С и Д также представляют собой гексаеновые антибиотики (Новикова, Шенин, 2011).
На основании проведенных испытаний в «Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных для применения на территории РФ» для защиты картофеля. включены следующие разработанные специалистами ГНУ ВИЗР и ЗАО «Агробиотехнология» биопрепараты: гамаир СП. алирин-Б СП. алирин-Б таб. алирин-Б Ж, витаплан СП. стернифаг СП. трихоцин СП. Тем не менее, до сих пор ни один биопрепарат не зарегистрирован для защиты картофеля от болезней при хранении, что обусловливает существенную значимость полученных результатов,
свидетельствующих о перспективности разработки эффективных биопре-паратов на основе отобранных штаммов микробов-антагонистов.
Выводы
Образцы биопрепаратов на основе от-селектированных штаммов В. БиЫШБ -И5-12/23 и В. 1аЬегоБрогиБ В1 101 в лабораторных модельных опытах показали высокую биологическую эффективность против возбудителей грибных болезней картофеля - ризоктониоза и серебристой парши, которая составила 42.2-77.8%.
Использование образцов биопрепаратов при хранении в картофелехранилище оказывало оздоравливающий эффект, что приводило к уменьшению количества
больных грибными и бактериальными болезнями клубней и повышало выход здорового картофеля в 2.6-2.7 раза. Биологическая эффективность образцов биопрепаратов на основе отселектированных штаммов В.БиЬ"Ш1Б И5-12/23 и В. 1аЬегоБрогиБ В1 101 в отношении кольцевой гнили, сухой гнили и фитофтороза достигала 55-90% и была существенно выше эффективности стандарта максима, КС. Хозяйственная эффективность применения образцов биопрепаратов увеличивалась на 7.1-10.9%.
Азаматова А.Б., Габрилович И.М. Об ингибитор-ном действии Bacillus subtilis и B. brevis на гнилостные микроорганизмы в процессе хранения овощей и фруктов / / Тез. конф. «Микроорганизмы-стимуляторы и ингибиторы роста раст. и жив.», Ташкент, 1989, с. 8.
Бельская С.И., Шабашова Т.Г., Новикова Л.М.
Изучение разнообразия и антагонистической активности эпифитных штаммов картофеля // Защита раст. в усл. реформирования АПК, тез. докл., 1995, СПб, с. 284.
Дорожкин Н.А., Новикова Л.М., Бельская С.И., Викторчик И.В. Антагонистические бактерии, перспективные для защиты картофеля от болезней //
Докл. АН БССР, 1991, 35, 11, с. 1037-1038.
Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках // Издательство Московского университета, 1994, с. 422-423.
Жученко А.А. Стратегия адаптивной интенсификации сельского хозяйства (концепция) / / Пущи-но, 1994, 148 с.
Жученко А.А., Кудеяров В.Н., Глазко В.И., Соколов М.С. Адаптивное растениеводство (эколого-генетические основы). М., Агрорус, 2008, 2009. т. 1, 814 с., т. 2, 1098 с., т. 3, 958 с.
Карпунина Л.В., Пономарева Е.Г., Соболева Е.Ф., Никитина В.Е. Изучение бактерицидных и фунгицидных свойств белков-агглютининов (лектинов) почвенных азотфиксирующих бактерий // Биотехнология, 1997, 3. 1, с. 10-13.
Карпунина Л.В., Мельникова У.Ю., Суслова Ю.В., Мухачева Е.С., Игнатов В.В.. Бактерицидные свойства лектинов азотфиксирующих бацилл // Микробиология, 2003, 72, 3, с. 343-347.
Козачко И.А., Вьюницкая В.А., Бережницкая Т.Г., Резник С.З., Смирнов В.В. Эндофитные бактерии рода Bacillus - перспективные культуры для создания биологических средств защиты растений от болезней / / Микробиол. журнал, 1995, 57, 5, с. 69-78.
Коробкова Т.П., Иваницкая Л.П., Дробышева Т.Н. Современное состояние и перспективы применения антибиотиков в сельском хозяйстве // Антибиотики и медицинская биотехнология // 1987. 8. c. 563-571.
Новикова И.И., Шенин Ю.Д. Выделение, идентификация и антигрибная активность метаболитов комплекса гамаир, образуемого штаммом Bacillus subtilis М-22 - продуцентом биопрепарата для защиты растений от микозов и бактериозов / / Биотехнология, 2011, 47, 2, с. 45-58.
Павлюшин В.А., Тютерев С.Л., Новикова И.И., Попова Э.В., Быкова Г.А., Бойкова И.В., Хацкевич Л.К. Композиция для защиты овощных культур от грибных и бактериальных болезней / / Патент РФ № 2322060 от 20.04.2008.
Попов Ф.А., Бельская С.И., Шабашова Т.Г. Bacterium mycoides - перспективный агент биологического контроля на овощных культурах и картофеле // Защита раст. в усл. реформирования АПК, тез. докл., 1995, СПб, с. 359.
Попов Ф.А. Коммерческие препараты на основе Bacillus subtilis / / Защита растений. Минск, Ураджай, 1990, с. 120-128.
Смирнов В.В., Сорокулова И.Б., Бережницкая Т.Г., Ваньянц Г.М., Менликиев М.Я., Недорезков В.Д., Мине-ев М.И., Вахитов В.А., Байгузина Р.М. Биопрепарат фи-тоспорин для защиты растений от болезней // Патент РФ, № 2109947, 1998.
Шенин ЮД, Новикова ИИ, Крутикова Л.Ф., Капьгаэ Г.В Характеристика алирина Б, основного компонента фунгицид-ного препарата, продуцируемого штаммом Bacillus subtillis-10-ВИЗР / / Антибиотики и химиотерапия, 1995, 40. 5. с. 3-7.
Юдина Т.Г., Егоров Н.С. Антимикробная активность белковых включений различных бактерий // Докл. АН СССР. 1996. 349. 2. с. 289-289.
Ahimou F.. Jacques P.. Deleu M. Surfactin and itu-rin A effect on Bacillus subtilis surface hydrophobility // Enzyme Microb. Technol.. 2000. 27. p. 749-754.
Azizbekyan R. The Fungicidal Activity of Spore-Forming Bacteria //In Bacterial Spore Formers. Pro-
biotics and Emerging Applications, Horizon Bioscience, Norfolk UK, ds. E.Ricca, A. Henrigues, S. Cutting, 2004, р .229-237.
Berdian G. Biologishe Bekämpfung ausgewählter Gemusekrankheiten mittels Trichoderma harzianum // D. Pflanzenschutztag., 23-26 Sept., 1996. "Mitt. Biol. Bundesanst. Land- und Forstwirt.Berlin-Dahlem", 1996, 321, p. 456-457.
Billington S. J., Jost B. H., Songer J. G. Thiol-activated cytolysins: structure, function and role in pathogenesis // FEMS Lett., 2000, v.182, p. 197-205.
Broderick N.A., Goodman R.M., Raffa K.F., Han-delsman J. Synergy between zwittermicin A and Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki against gypsy moth (Lepidoptera: Lymantriidae). // Environ. Entomol., 2000, 29, p. 101-106.
Burkhard F., Folker L., Fugmann B. et. al. Antibiotics for plant protection // Chem. Unserer Zeit., 1991, 25, p. 317-330.
Centurion M.A.P., Kimati C., Pereira G.T. Mecanismos de atuacao de antagonistas selecionados para o controle biologico da ferrugem do feijpeiro (Uromy-ces phaseoli (Reben.) Wint.) // Cientifica, 1994, 22, 2, p. 174-175.
Clulow S.A., Stewart H.E., Dashwood E.P., Wastie R.L. Tuber surface microorganisms influence the suspepti-bility of potato tubers to late blight / / Ann. Appl. Biol., 1995, 126, 1, p. 33-43.
Collins D., Stevens C., Khan V., Nightengale S. Commercial biopreparations of Bacillus subtilis // Phytopathology, 1994, 4, 10, p. 1114-1119.
De Lucca A.J., Walsh T.J. Antifungal peptides: novel therapeutic compouds against emerging pathogens // Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1999, 43, p. 1-11.
Dolej S., Bochow H. Phytosanitare Wirkungen von Bacillus subtilis - Kulturfiltraten im Pathosystem Tomate - Fusarium oxysporum / / Mitt. Biol. Bundesanst. Land- und Forstwirt.Berlin-Dahlem, 1996, 321, p. 459463.
Galvez A.M., Maqueda M., Martinez-Bueno M., Lebbadi M., Valdivia E. Isolation and physico-chemical characterization of an antifungal and antibacterial peptide produced by Bacillus licheniformis A 12 // Appl. Microbiol. Biotechnol., 1993, 38, p. 438-442.
Hancock R.E.W., Lehrer R. Cationic peptides as a new source of antibiotics // Trends Biotechnol., 1998, 16, p. 82-88.
Hathout Y.H., Ho Y., Ryzhov V., Demirev P., Fenselau C. Kurstakins: a new class of lipopeptides isolated from Bacillus thuringiensis // J. Nat. Prod., 2000, 63, p. 1492-1496.
Hbid C., Jacques P., Razafindralambo H., Mpoyo M.K. Influence of the production of two lipopeptides, iturin A and surfactin S1, on oxygen transfer during Bacillus subtilis fermentation // Appl.Biochem. Biotech., 1996, 57/58, p. 571-579.
Klich M.A., Lax A.R., Bland J.M. Inhibition of some mycotoxigenic fungi by iturin A, a peptidolipid produced by Bacillus subtilis // Mycopathology, 1991, 116, p. 77-80.
Kurzawinska H. The effect of fungal communities in soil environment of potato crop on the growth of pathogens Fusarium sulfureum Schl. And F. coerule-um (Sacc.) booth // Phytopathol. Pol. Poznan, 1992, 4,
Вестник защиты растений, 4, 2013 p. 15-16.
Liu D.Q., Anderson N.A., Kinkel L.L. Biological control of potato scab in the field with antagonistic Strep-tomyces scabies / / Phytopathology, 1995, 85, 7, p. 827831.
Liu D.Q., Anderson N.A., Kinkel L.L. Selection and Characterization of Strains of Streptomyces Supres-sive to the Potato Scab Pathogen / / Can. J. Microbiol., 1996, 42. p. 487-502.
Marrone P.G., Heins S., Manker D. // Biological control of plant fungal infections / / Патент США № 6004774, 1999.
Mhammedi A.F., Peypoux F., Besson F., Michel G. Bacillomycin F, a new antibiotic of iturin group. Isolation and characterization // J. Antibiot., 1982, 35, p. 306-311.
New T.R., Poralla K. Emulsifing agents from bacteria isolated during screening for cells with hydropho-bic surfaces / / Appl. Microbiol.Biotechnol., 1990, 32, p. 521-525.
Oita S. Horita M., Yanagi S.O. Purification and properties a new chitin-binding antifungal CB-1 from Bacillus licheniformis M-4 // Biosci. Biotech. Biochem., 1996, 60, p. 481-483.
Phae C.G., Sasaki M., Shoda M., Kubota H. Characteristics of Bacillus subtilis isolated from composts suppressing phytopathogenic microorganisms // Soil sci. plant nutrit., 1990, 36, 4, p. 575-586.
Saberwal G., Nagaraj R. Cellolytic and antibacteri-
al peptides that act by perturbing the barrier function of membranes: facets of their conformation features, structure-function correlations and membrane-perturbing abilities // Biochem. Biophys. Acta, 1994, 1197, p. 109-131.
Schisler D.A., Naseem I.K., Boehm M.J. Biological control of Fusarium Head Blight of Wheat and Deox-ynivalenol Level in Grain Via Use of Microbial Antagonists // Mycotoxins and Food Safety: proceedings of the American Chemical Society, 2000, 504, p. 53-71.
Shai Y. Molecular recognition between membrane-spanning polypeptides // TIBS, 1995, 20, p. 460-464.
Silo-Suh L.A., Stabb E.V., Raffel S.J., Handelsman J. Target range of zwittermicin A, an aminopolyol antibiotic from Bacillus cereus // Current Microbiol., 1998, 37, p. 6-11.
Volpon L., Besson F., Lancelin J. NMR structure of active and inactive forms of the sterol-dependent antifun-gal antibiotic bacillomycin L. // Eur. JBiochem., 1999, 263, p. 1-12.
Volpon L., Besson F., Lancelin J. NMR structure of antibiotics plipastatins A and B from Bacillus subtilis inhibitors of phospholipase A2 // FEMS Lett., 2000, 485, p. 76-80.
Wieprecht T., Dathe M., Krause E., Beyerman M., Molloy W.L., MacDonald D.L., Bienert M. Modulation of membrane activity of amphipathic, antibacterial pep-tides by slight modifications of the hydrophobic moment // FEBS Lett., 1997, 417, p. 135-140.
НИР выполнена в соответствии с календарным планом Государственного контракта
№16.M04.12.0027.
APPLICATION PERSPECTIVES FOR BIOPREPARATIONS BASED ON MICROBE-ANTAGONISTS FOR POTATO DISEASE CONTROL AT STORAGE I.I.Novikova, I.V.Boikova, V.A.Pavlyushin, V.N.Zeyruk, S.V.Vasilieva, R.R.Azizbekyan, N.I.Kuznetsova
Efficacy of biopreparation samples based on selected strains of Brevibacillus lateros-porus Bl 101, Bacillus subtilis M-22 and Bacillus subtilis - I5-12/23 is estimated in vitro and in potato long storage experiment. In laboratory trials biopreparation samples showed high biological efficiency against such causing agents of potato diseases as rhi-zoctoniosis and silver scab (42.2-77.8%). Tuber processing before the storage starting reduced the number of tubers with fungal and bacterial diseases and increased the output of health potato more than twice (2.6-2.7 times). Biopreparation samples efficiency concerning ring rot, dry rot and phytophthorosis reached 55-90%, and was significantly higher than the chemical standard Maxim KS efficiency. Economic efficiency of bioprep-aration samples' application increased by 7.1-10.9%.
Keywords: microbe-antagonist, biopreparation, phytopathogenic fungi and bacteria, biological efficiency, potato tuber disease.
Н.И.Кузнецова к.б.н., [email protected] Р.Р.Азизбекян, д.б.н., [email protected] С.В.Васильева, к.б.н., [email protected] И.И.Новикова, д.б.н., [email protected] И.В.Бойкова, к.б.н., [email protected] В.А.Павлюшин, академик, [email protected] В.Н.Зейрук, к.б.н., [email protected]
