CC BY
114
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Персонализированная клеточная терапия в офтальмологии. I. Метод получения и цитофенотип аутогенного клеточного продукта
С.Э. Аветисов 1, А.М. Суббот12, А.И. Антохин 2, Е.А. Каспарова 1, А.А. Каспаров 1, А.С. Павлюк12
1 Научно-исследовательский институт глазных болезней РАМН
2 Российский государственный медицинский университет им. Н.И. Пирогова
Personalized cell therapy in ophthalmology. I. Method for obtaining and phenotype of autologous product
S.E. Avetisov1, A.M. Subbot12, A.I. Antochin 2, E.A. Kasparova 1, A
1 State Research Institute of Eye Diseases RAMS;
2 The Russian State Medical University
Разработан метод получения аутогенных лейкоцитов из периферической крови с активацией их in vitro полиадениловой-полиурациловой кислотой (полиА:У) для лечения заболеваний роговицы. Метод позволяет получить продукт с достаточным для проведения персонализированной клеточной терапии (ПКТ) содержанием жизнеспособных ядросодержащих клеток (до 3х10в клеток/мл) в процес-сированной аутологичной сыворотке (ПАС). Исследован клеточный состав полученного продукта — содержание мононуклеарной фракции снижено в 1,3 раза, увеличена доля гранулоцитов. Содержание субпопуляций лимфоцитов в клеточном продукте соответствует составу периферической крови за исключением В-лимфоцитов, количество которых снижено в 5 раз. В составе продукта идентифицированы клетки с фенотипом CD14/CD34low, считающиеся способными к мультилинейной дифференцировке. Применение клеточного продукта, полученного по разработанной методике, может быть перспективным в клинике, так как метод отличается минимальной травматичностью для пациента и простотой исполнения.
Ключевые слова: заболевания роговицы, регенерация, клеточная терапия, персонализированная клеточная терапия, полиА:У, CD14/CD34low.
Введение
Клеточная терапия (КТ) — это применение аутогенных, аллогенных или ксеногенных живых клеток с целью регенерации поврежденной ткани.
В настоящее время применение КТ в клинике является нетривиальным выбором для лечащих врачей. Проведение КТ требует решения ряда вопросов: необходимо иметь постоянно доступный источник клеток, использовать безопасный и экономичный метод их выделения и процессинга, исключить или в крайнем случае минимизировать возможность развития иммунологического конфликта, обеспечить полную биологическую безопасность для пациента, реально оценивать техническую сложность применяемых методов, материальных затрат и законодательных и этических ограничений.
e-mail: [email protected]
A. Kasparov1, A.S. Pavliuk 12
The method for obtaining activated in vitro by poly A:U autologous leucocytes from peripheral blood for corneal diseases treatment is developed. Method allows us to obtain a product with sufficient content of viable nucleated cells (up to 3x10B cell/ml). Cellular composition of the product was determined. Mononuclear fraction decreased in 1,3 times and granulocyte portion is increased. Phenotype of lymphocytes in the cell product is the same as in peripheral blood, with selective loss of B-lymphocytes. The presence of CD14+/34low cells, which are considered to be progenitors, is defined in the product. Using of cell product, obtained by designed technique, may be promising in clinic, because of it minimal traumatism for the patient and simplicity.
Key words: cornea disorders, regeneration, cellular therapy, personalized cellular therapy, poly A:U, CD14/CD34low.
Решением вышеперечисленных проблем являются технологии персонализированной клеточной терапии (ПКТ), в которых для лечения пациента используются его собственные (аутогенные) клетки, полученные и сохраненные заранее либо полученные непосредственно перед проведением ПКТ [1]. Естественно, что для каждой конкретной клеточной технологии будет характерен уникальный алгоритм получения, хранения, процессинга и применения аутогенных клеток или клеточного продукта.
Периферическая кровь относится к доступным источникам материала для клеточной терапии. Клетки крови продуцируют широкий спектр биологически активных соединений (цитокины, факторы роста, гормоны, нейромедиаторы и др.). Кровь является источником различных функционально активных
клеток (лимфоцитов) и клеток, имеющих способность к дифференцировке по различным направлениям: гемопоэтических стволовых клеток, мульти-потентных мезенхимальных клеток периферической крови, мультипотентных взрослых прогениторных клеток (multipotent adult progenitor cells — МАРС) а также клеток моноцитарного происхождения, способных дифференцироваться в нефагоцитирующие линии — фиброциты, мезенхимальные прогениторы моноцитарного происхождения (monocyte-derived mesenchymal progenitors — MOMP), ранние эндотелиальные предшественники (early EPC) и клетки с фенотипом CD14+CD34low [2]. Вышеперечисленные производные моноцитов представляют большой интерес для клеточной терапии, так как они доступнее, чем костномозговые мезенхимальные стволовые клетки, их количество в периферической крови несравнимо больше, чем CD34+ или CD133+ клеток, а спектр полученной in vitro дифференцировки очень широк — эндотелиальные клетки, кардиомиоциты, остеобласты, гепатоциты, адипоциты, нейроны [3]. Среди них популяция клеток CD14+CD34low отличается тем, что она выделена исследователями без предварительного культивирования, в свежеполучен-ной фракции МНК. Однако сложность заключается в том, что экспрессия CD34 на этих клетках не выявляется при стандартном цитометрическом анализе, а требует использования технологий усиления слабого сигнала: применения липосом, конъюгированных с антителами (antibody-conjugated magnetofluorescent liposomes — ACMFL), или дополнительных реагентов в технологии Fluorescence Amplification by Sequential Employment of Reagents (FASER) [4].
Введение аутологичного клеточного препарата (КП) в переднюю камеру глаза во время операции на роговице, когда нарушается биологическая герметичность тканевой ниши позволяет значительно усилить лечебный эффект ПКТ. В настоящее время такое применение КТ получило название «интраопе-рационная клеточная терапия» [5].
Исключительно важным условием проведения регенеративной терапии в офтальмологии, является отсутствие в КП субстанций, которые могут оказать токсическое действие на эндотелий роговицы при введении в переднюю камеру глаза. Технология получения КП должна предоставлять условия, обеспечивающие отсутствие в нем антикоагулянтов, антибиотиков, криопротекторов [6]. Благоприятной особенностью проведения ПКТ на переднем отрезке глаза (интракамеральное введение КП) является возможность использования небольшого количества клеток, для обеспечения терапевтического эффекта — 3—4х10в кл/мл [7].
Спектр стимуляторов, используемых для проведения КТ, ограничен теми субстанциями, применение которых разрешено законодательно. В случае интраоперационной ПКТ в офтальмологии, препарат должен быть разрешен к внутриглазному введению.
Важнейшим требованием при проведении КТ является характеристика и стандартизация клеточного продукта [8].
Цель работы — разработать метод получения аутогенных жизнеспособных ядросодержащих клеток из периферической крови человека для интраопера-ционной персонализированной клеточной терапии в офтальмологии, без использования в процессе полу-
чения не разрешенных к клиническому применению препаратов, а также метод их активации и охарактеризовать состав полученного клеточного продукта.
Материал и методы исследования
Протокол исследования одобрен этическими комитетами ГОУ ВПО РГМУ Росздрава и НИИ ГБ РАМН. У всех включенных в исследование было получено информированное добровольное согласие.
В качестве активатора мы использовали применяющийся в офтальмологии и разрешенный к внутриглазному введению раствор препарата «Полудан», который представляет собой комплекс полиадени-ловой и полиурациловой кислот (полиА:У, polyA:U), является структурным аналогом двухспиральной вирусной РНК и лигандом Толл-подобных рецепторов
3 типа (Toll-Like Receptors — TLR-3) [9]. Показано, что полиА:У способен индуцировать синтез клетками крови широкого спектра цитокинов: ИЛ-1,-6,-8, ИФН-у, ФНО-а [10]. Получены экспериментальные доказательства антиапоптотической активности полиА:У [11]. Кроме того, есть данные о том, что через активацию TLR можно влиять на механизмы дифференцировки клеток [12].
Лейкоциты из периферической крови можно получать разными способами: выделением на градиенте плотности фиколла или осаждением эритроцитов желатином [13,14].
Нами разработан метод получения лейкоцитов, заключающийся в их сборе из периферической крови, собранной без антикоагулянтов, после завершения процессов свертывания, в результате которых большая часть эритроцитов фиксируется в фибриновом сгустке, а часть лейкоцитов остается вне сгустка. Эти лейкоциты собирали вместе с сывороткой крови, которая является составной частью КП.
В составе сыворотки, инкубированной 4 ч при 37°С в присутствии стимулятора (полиА:У) присутствуют синтезированные de novo цитокины, а также эндогенные (фибриноген) и экзогенные (полиА:У) лиганды TLR. В силу этого такая сыворотка принципиально отличается от свежеполученной нативной сыворотки, используемой в диагностических целях и тем более от плазмы крови. Для ее обозначения мы используем термин «процессированная аутологичная сыворотка» (ПАС).
Получение КП осуществляли следующим образом — 200 ЕД Полудана растворяли в 2,0 мл воды для инъекций и переносили в стерильную пробирку на 10 мл. Из локтевой вены пациента в пробирку с раствором набирали 8 мл крови, закрытую пробирку инкубировали 4 ч при температуре 37°С, затем центрифугировали в течение 10 мин при 3000 об/мин (центрифуга Elmi СМ-6М). Взвесь клеток в сыворотке собирали, обводя иглой шприца вокруг фибринового сгустка, и переносили полученную клеточную суспензию в стерильную пробирку.
В камере Горяева подсчитывали количество ядросодержащих клеток и эритроцитов в полученной суспензии. Оценку жизнеспособности клеток проводили с использованием окрашивания трипановым синим.
Морфологическую характеристику (оценку содержания гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов) приготовленного КП получали микроскопическим исследованием мазков, окрашенных по Романовскому — Гимзе.
Содержание гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов определяли также на проточном цитофлюори-метре BD FACSAria (BD biosciences, США) по параметрам светорассеяния. В рамках определенной популяции лимфоцитов проводили оценку субпо-пуляционного состава КП — определяли процентный состав клеток, экспрессирующих следующие комбинации поверхностных маркеров: CD3/CD4 — Т-лимфоциты хелперы, CD3/CD8 — Т-лимфоциты цитотоксические, CD19 — В-лимфоциты, CD16/CD56 — NK-клетки. Для иммуноцитохимического окрашивания использовали моноклональные антитела к указанным поверхностным маркерам, коньюгированные с флюорохромами (BD biosciences, США). В качестве контроля использовали изотипические антитела, меченные соответствующими красителями. Для сравнительного анализа измерения проводили в пробах цельной крови.
С помощью проточной цитометрии определяли наличие в КП популяции клеток, с фенотипом CD14+CD34low. После иммуноцитохимического окрашивания с использованием моноклональных антител к CD14 и CD34, коньюгированных с флюорохромами (BD biosciences, США), проводили дополнительную окраску с использованием усилителя флюоресценции слабого сигнала FASER (Miltenyl biotech, ФРГ) для увеличения интенсивности флюоресценции от CD34+-клеток. Для этого клетки инкубировали с реагентом, блокирующим FcR, и активирующим реагентом 10 мин при температуре 4°C в темноте, отмывали клетки и инкубировали с реагентом, блокирующим FcR и усиливающим реагентом 10 мин при температуре 4°C в темноте, затем тщательно отмывали клетки, проводили повторное окрашивание теми же реагентами и анализировали клетки на проточном цитофлюориметре BD FACSAria с использованием пакета программ BD FACSDiva Software. Для сравнительного анализа измерения проводили в пробах цельной крови, полученных стандартным способом с использованием антикоагулянта.
Результаты и обсуждение
Используя разработанный метод сбора клеток, из 8 мл крови получали 5—6 млн ядросодержащих клеток с жизнеспособностью 70—90%. Объем КП (взвесь лейкоцитов в ПАС) составлял 2—4 мл. Концентрацию ядросодержащих клеток в КП доводили до рабочей (3х10в кл/мл) путем центрифугирования и отбора соответствующего объема ПАС.
Предлагаемый метод сбора клеток в аутологичной сыворотке вокруг сгустка свернувшейся крови позволяет получить КП с высоким содержанием жизнеспособных клеточных элементов, достаточным для ПКТ в офтальмологии. Образовавшийся излишек ПАС, используют для промывания передней камеры во время интраоперационнй ПКТ непосредственно перед введением КП.
ПАС в дальнейшем хранится при -20°С и используется для капельных инстилляций или субконъюнкти-вальных инъекций.
Следует подчеркнуть, что процесс коагуляции крови является дополнительным пусковым механизмом для активации лейкоцитов, так как имитирует течение ранних стадий раневого процесса, в ходе которых высвобождаются эндогенные лиганды ТИЗ, запускающие и усиливающие регенераторные механизмы в клетках [15].
Добавление стимулятора непосредственно при заборе крови, позволяет сократить время и число манипуляций, необходимое для получения КП.
Количество эритроцитов в КП составило 0,76±0,43х10в кл./мл. Малое содержание эритроцитов позволяет избежать прокрашивания роговицы и побочных эффектов продуктов распада гемоглобина [16].
По результатам морфологического и цитофлюори-метрического анализа установлено, что в КП соотношение гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов отличается от соотношения в цельной крови — содержание мононуклеарной фракции снижено в 1,3 раза и увеличена доля гранулоцитов. Процентное содержание клеточных популяций приведено в табл. 1 и 2.
Таблица 1. Процентное содержание популяций лейкоцитов в КП и крови по результатам морфологического анализа (M±sd)
Клеточная популяция Кровь N = 7 Клеточный препарат N = 7 Индекс КП/кровь
Г ранулоциты 60,6±5,0 74,4±9,1 1,23
Лимфоциты 22,8±6,4 13,8±5,3 0,61
Моноциты 15,9±7,3 11,8±6,7 0,74
Таблица 2. Процентное содержание популяций лейкоцитов в КП и крови по результатам проточной цитометрии (M±sd)
Клеточная популяция Кровь N = 7 Клеточный препарат N = 7 Индекс КП/кровь
Г ранулоциты 37,7±10,8 49,8±19,9 1,32
Лимфоциты 38,2±16,6 21,2±19,9 0,55
Моноциты 8,6±5,1 5,4±1,5 0,63
Показатели процентного содержания гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов были разными в зависимости от метода оценки — при оценке на мазках гранулоцитов и моноцитов наблюдалось больше, чем при цитофлюориметрическом анализе, однако индекс КП/кровь, отражающий изменение содержания этих популяций в КП по сравнению с кровью был одинаковым.
Из табл. 3 следует, что T-хелперы, T-цитотоксичес-кие и NK-клетки присутствуют в КП в тех же пропорциях, что и в периферической крови, тогда как содержание В-лимфоцитов снижено почти в 5 раз.
В результате применения технологии усиления слабого сигнала (FASER) при использовании мето-
да проточной цитометрии нами было установлено наличие в КП клеток с поверхностной экспрессией Сй14/34'°“ в количестве ~2% от моноцитов (0,1% от всех лейкоцитов). Иллюстрация результата представлена на рис. 1. Количество региструемых Сй14/34'°“ клеток оказалось меньше, чем в работе Потадпапі с соавт. (2005) (0,6—8,5% от всех лейкоцитов), при этом мы не наблюдали массивного сдвига моноцитарного гейта в область Сй34 положительных значений. Возможно, такая разница обусловлена разными условиями пробоподготовки. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы достоверно оценить содержание Сй14/34'°“ клеток в периферической крови и КП.
Таблица 3. Процентное содержание популяций лимфоцитов в КП и крови по результатам проточной цитометрии (M±sd)
Клеточная популяция Кровь N = У Клеточный препарат N = У Индекс КП/кровь
Т-хелперы CD3/CD4 42±7,35 42±8,97 1
Т-цитотоксические CD3/CD8 17±5,3 17±5,19 1
B-клетки CD19 7±2,85 1,5±0,65 0,21
NK-клетки CD16/CD56 16±9,1 18±5,24 1,13
A
Blood FACS
Blood FACS + FASER
В
cells FACS + FASER
<
ó
0.
<
CO
Q
О
CD14 PE-A
CD14 PE-A
M“ 1Ґ
CD14 PE-A
Рис. 1. Поверхностная экспрессия CD34 на моноцитах (CD14+), зарегистрированная в цельной крови с помощью классической цитометрии (А), в цельной крови с использованием техники усиления слабого сигнала FASER (Б), в клеточном препарате с использованием техники усиления слабого сигнала FASER (В). В процентах указано количество моноцитов, экспрессирующих CD34, зарегистрированное в прямоугольном гейте
Заключение
Для современной регенеративной медицины проблема выбора и получения материала для проведения клеточной терапии является приципиальным условием ее практического применения в клинической практике.
Персонализированная клеточная терапия с использованием аутогенных клеточных продуктов, открывает новые возможности для лечения широкого спектра социально значимых заболеваний, в том числе и в офтальмологии, решая ряд имеющихся на сегодняшний день проблем (источник и способ получения клеточного материала, иммунологическая совместимость, правовые, этические и технические аспекты).
Разработанный нами метод проведения ПКТ, позволяющий получить из небольшого объема периферической крови пациента клеточный препарат, представляющий из себя взвесь аутологичных лей-
коцитов в насыщенной цитокинами (процессиро-ванной) сыворотке, прошел успешную клиническую апробацию и на практике доказал тепапевтическую эффективность и безопасность в офтальмологической клинике.
Метод получения КП отличается простотой выполнения, позволяет получить достаточное количество клеток для проведения интраоперационной ПКТ. Полученные данные о клеточном составе продукта имеют важное значение не только для стандартизации метода при его тиражировании, но и открывают перспективы дальнейшего его совершенствования с целью улучшения «потребительских» свойств.
Авторы выражают благодарность н.с. лаборатории клеточной биологии Института биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича РАМН П.А. Каралкину за помощь при проведении проточной цитофлюоро-метрии и анализе полученных результатов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Patel S.A., King C.C., Lim P.K. et al. Personalizing stem cell research and therapy: the arduous road ahead or missed opportunity? Curr. Pharmacog. Person Med. 2010; 8(1): 25—36.
2. Romagnani P., Lasagni L., Romagnani S. Peripheral blood as a source of stem cells for regenerative medicine. Expert. Opin. Biol. Ther. 2006; 6(3): 193-202.
3. Seta N., Kuwana M. Human circulating monocytes as multipotential progenitors. Keio. J. Med. 2007; 56(2): 41-7.
4. Romagnani P., Annunziato F., Liotta F. et al. CD14+CD34low cells with stem cell phenotypic and functional features are the major source of circulating endothelial progenitors. Circ. Res. 2005; 97(4): 314-22.
5. Bader A., Macchiarini P. Moving towards in situ tracheal regeneration: the bionic tissue engineered transplantation approach. J. Cell. Mol. Med. 2010; 14(7): 1877-89.
6. Parikh C.H., Edelhauser H.F. Ocular surgical pharmacology: corneal endothelial safety and toxicity. Curr. Opin. Ophthalmol. 2003; 14(4): 178-85.
7. Alvarado J.A., Katz L.J., Trivedi S. et al. Monocyte modulation of aqueous outflow and recruitment to the trabecular meshwork following selective laser trabeculoplasty. Arch. Ophthalmol. 2010; 128(6): 731-7.
8. Бурунова В.В. Проблемы стандартизации при получении кле-
точных культур мезенхимального происхождения: экспериментальный и теоретический анализ (диссертация). Москва; 2011.
9. Sugiyama T., Hoshino K., Saito M. et al. Immunoadjuvant effects of polyadenylic:polyuridylic acids through TLR3 and TLR7. Int. Immunol. 2008; 20(1): 1-9.
10. Суббот А.М., Каспарова Е.А., Каралкин П.А. и соавт. // Стволовые клетки и регенеративная медицина /под редакцией В.А. Ткачука. М.: МАКС ПРЕСС, 2011.- С. 162-172.
11. Ковальчук Л.В., Павлюк А.С., Синюхин В.Н. и др. Анализ фармакологических средств на модели апоптоза лимфоцитов человека in vitro в норме и при иммунопатологии Аллергология и иммунология 2000; 1: 24-30.
12. Kavai T., Akira S. TLR signaling. Cell Death Differ. 2006; 13(5): 816-25.
13. Boyum A. Separation of lymphocytes, lymphocyte subgroups and monocytes: a review. Lymphology 1977; 10(2): 71-6.
14. Coulson A.S., Chalmers D.G. Separation of viable lymphocytes from human blood. Lancet 1964; 1: 468-9.
15. Zhang Z., Schluesener H.J. Mammalian toll-like receptors: from endogenous ligands to tissue regeneration. Cell Mol. Life Sci. 2006; 63(24): 2901-7.
16. Jaremko K.M., Chen-Roetling J., Chen L. et al. Accelerated hemolysis and neurotoxicity in neuron-glia-blood clot co-cultures. J. Neurochem. 2010; 114(4): 1063-73.
Поступила 15.11.2010
