CC BY
85
УДК 54.057:547.96:615.273.5
ПЕПТИДНЫЕ ИНГИБИТОРЫ АГРЕГАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ
© 2013 А. А. Алексеев1, М. И. Брылёв2, В. Л. Королёв3, Д. С. Лоторев4, А. Ю. Лизунов5, Е. А. Батуев6, Л. А. Павлова7
1 аспирант лаборатории биологически активных соединений e-mail: [email protected] 2лаборант-исследователь лаборатории биологически-активных соединений e-mail: [email protected] 3докт. хим. наук, ведущий науч. сотрудник лаборатории биологически-активных соединений e-mail: [email protected] 4канд. хим. наук, ведущий науч. сотрудник лаборатории биологически-активных соединений e-mail: [email protected] 5ст. преподаватель каф. высшей математики Московского физико-технического института (гос. университета)
6аспирант каф. органической химии Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова 7канд. фарм. наук, зав. лабораторией биологически-активных соединений
e-mail: [email protected].
НИИ Фармации ГБОУВПО ПервыйМГМУ им. И.М. Сеченова
В статье представлены данные математического моделирования молекул пептидов -антагонистов GPIIb/IIIa рецепторов тромбоцитов. Синтез смоделированных пептидов выполнен твердофазным способом на автоматическом пептидном синтезаторе, очистка произведена на препаративном хроматографе. Структура полученных соединений подтверждена методами хромато-масс-, ЯМР 1Н- и двумерной ЯМР 1Н/1Н (COSY, NOESY)-спектроскопии. Выполнена оценка специфичности действия синтезированных соединений.
Ключевые слова: математическое моделирование, пептиды, агрегация тромбоцитов, рецепторы тромбоцитов
В связи с высокой частотой сердечно-сосудистых заболеваний и их летальными последствиями, вопросу предупреждения патологического образования внутрисосудистого тромба уделяется пристальное внимание.
Известно, что агрегация тромбоцитов происходит за счет связывания фибриногена с их GPIIb/IIIa (интегрин aIIb/p3) рецепторами [Tomiyama et. al. 1992; Ruoslahti et. al. 1987; Plow et. al. 1986]. На поверхности тромбоцита, находящегося в спокойном состоянии, располагается около 40 000 - 80 000 рецепторов GP IIb/IIIa, также примерно 20000 - 40000 рецепторных комплексов находится на мембранах а-гранул и кальциевой системы внутри тромбоцита [Newman et. al. 1995].
Гетеродимер IIb/IIIa представляет собой комплекс двух субъединиц. Субъединица GPIIb состоит из ковалентно связанных дисульфидной связью тяжелой (116 кД) и легкой (22 кД) цепей. Тяжелая цепь находится на поверхности тромбоцита, в то время как легкая является трансмембранным белком. Субъединица GPIIIa представляет собой
гликозилированный полипептид с массой 92 кД, который состоит из трех доменов -внеклеточного на N-конце, трансмембранного и цитоплазматического домена на С-конце (рис.) [Weisel et al. 1992].
Механизм действия GP IIb/Ша-рецепторов тромбоцитов заключается в способности распознавать две аминокислотные последовательности. Первая аминокислотная последовательность представляет собой Arg-Gly-Asp и находится в вибронектине, фибронектине, факторе фон Виллебранда. Вторая аминокислотная последовательность обнаружена на карбоксильном конце у-цепей фибриногена и представляет собой последовательность Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val [Newman et. al. 1995; Farrell et. al. 1992]
Существенный интерес среди антиагрегантов представляют антагонисты GPIIb/IIIa рецепторов, имеющие пептидную природу.
В современном процессе разработки лекарств широко используется математическое молекулярное моделирование [Хёльтье и др. 2009]. Целью данной работы явилось проведение виртуального скрининга пептидов - потенциальных ингибиторов агрегации тромбоцитов - синтез пептидов и оценка специфичности действия синтезированных соединений in vitro на крови здоровых доноров.
Материалы и методы
Моделирование взаимодействия белка интегрин aIIb/p3 с пептидами проводилось с помощью программы «Алгокомб», модифицированной для учета внутренних нековалентных взаимодействий лиганда и явного учета молекул воды в сайте связывания.
Расчет оценки связывания с белком проводился для пептидов структуры А-В-C-Asp-D, где «A», «В», «С», «D» - L-аминокислотные остатки. В процессе моделирования в качестве аминокислоты «С» рассматривались глицин или аланин. Остаток аспарагиновой кислоты на четвертой позиции может образовывать ионную связь с ионом магния в активном сайте белка интегрин aIIb/p3, тем самым увеличивается сродство пептида к белку. В результате было рассмотрено около 20 000 пептидов, для каждого из которых рассчитывалась оценка связывания с белком-мишенью.
Синтез наиболее эффективных (по результатам компьютерного моделирования) пептидов осуществляли методом твердофазного синтеза на автоматическом пептидном
Алексеев А. А., Брылёв М. И., Королёв В. Л., Лоторев Д. С., Лизунов А. Ю., Батуев Е. А., Павлова Л. А.
Пептидные ингибиторы агрегации тромбоцитов
синтезаторе ABI 433A Peptide Synthesizer (AppliedBiosystems, США) с использованием Fmoc-стратегии. В синтезе использовались аминокислоты, реагенты и растворители фирмы AppliedBiosystems.
Очистку пептидов осуществляли с помощью высокоэффективного препаративного жидкостного хроматографа PuriFlash 450 (InterChim).
Условия ВЭЖХ: катридж Interchim PF-C18 (20g), 15 мкм. Могут использоваться другие обращенные катриджи С18 или С8.
a. Детекторная ячейка: препаративная
b. Скорость потока - 20.0 мл/мин
c. Длина волны: диапазон 200 - 400 нм
d. Диапазон детектирования: 2 AUFS
e. Величина петли: 2 мл (объем инжекции 1.5 - 1.8 мл образца)
f. Элюент А: 5.0% ацетонитрила, 0.1% трифторуксусной кислоты в воде
g. Элюент В: 0.1% трифторуксусной кислоты в ацетонитриле
h. Градиент: 10-90% В в течение 12 мин.
Строение синтезированных соединений подтверждали методами хромато-масс-спектрометрии и ЯМР ^-спектроскопии (в том числе с привлечением двумерных методик 1Н/1Н -спектров COSY, показывающих ближнее взаимодействие атомов, и 1Н/1Н -спектров NOESY, основанных на дальних взаимодействиях). Спектры ЯМР 1Н регистрировали на приборе «Broker Avance 600 mhz», химические сдвиги измеряли относительно сигнала растворителя (ДМСО-dfe 5н 2.5 м.д.).
Хромато-масс-спектрометрический анализ проводили на приборе Waters MSD SQD - ESI с УФ- и масс-спектрометрическими детекторами: длина волны 220 нм, температура пробоотборника 15оС, температура термостата колонок 40оС. MSD -параметры: температура источника 130оС, температура газа 400оС, напряжение на капилляре 3kV; колонка Waters Acquity 1.7 |im 2.1 • 50 mm. Градиент от 5 до 100% В за 4 мин. (А: 0.1% муравьиной кислоты в воде; В: 0.1% муравьиной кислоты в ацетонитриле).
Оценку специфической активности антиагрегационного действия пептидов проводили in vitro с использованием крови здоровых доноров. Взятие крови проводили непосредственно перед исследованием, используя в качестве антикоагулянта водный раствор цитрата натрия (3.8%). Соотношение антикоагулянт : кровь соответствует 1 : 9. Антиагрегационная активность полученных соединений изучалась на богатой тромбоцитами плазме с использованием АДФ в качестве индуктора агрегации тромбоцитов.
Для приготовления богатой тромбоцитами плазмы кровь центрифугировали в течение 10 мин. при 1000 об/мин., после чего отбирали верхний слой плазмы, а остаток центрифугировали в течение 20 мин. при 3000 об/мин для получения безтромбоцитарной плазмы. Все процедуры проводили в полистирольной посуде, обладающей тромборезистентными свойствами. В течение всего периода исследования богатая и безтромбоцитарная плазма находились при комнатной температуре, а запись агрегации тромбоцитов осуществляли при 37°С [Zou, Schmaier 2005].
Для исследования специфической антиагрегационной активности пептида руководствовались требованиями к доклиническим исследованиям фармакологических веществ данного класса, утвержденными Фармакологической службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития.
Исследование агрегации проводили по методу Борна [Born 1962]. Для проведения исследования применяли двухканальный лазерный анализатор агрегации тромбоцитов/счетчик 230 LA-2 (НПФ «Биола»). Объем пробы составлял 300 мкл. Время проведения измерения - 8
мин. В качестве индуктора использовали АДФ в концентрации 50 мкМ. Получаемые агрегатограммы представляют собой зависимость степени агрегации от времени, прошедшего после добавления индуктора агрегации. Изучаемые соединения (в виде водного раствора, при необходимости содержащего ДМСО до 0.2 %) добавляли в пробу до внесения индуктора агрегации (АДФ).
Результаты и их обсуждение
Нами выполнено моделирование эффективности связывания белка интегрин aIIb/ß3 с пептидами с использованием программы «Алгокомб». Проведен расчет эффективности связывания с белком для 20 000 пептидов.
Для всех рассматриваемых пептидов был проведен докинг и рассчитана оценка связывания с конформациями белка aIIb/ß3, представленными в комплексах 2vdp и 2vc2 [RCSB Protein Data Bank (PDB)]. Для каждой конформации белка были выбраны вещества с наилучшими оценками связывания. Оценки связывания при докинге в комплекс 2vdp изменяются от 16.52 (лучшее вещество) до 13.89; при докинге в комплекс 2vc2 оценка связывания изменяется от 10.78 до 8.04. С учетом результатов рассчитанных оценок связывания пептиды существенно лучше располагаются в сайте комплекса 2vdp.
Серия наиболее эффективных, согласно прогнозу, соединений (табл. 1) была нами синтезирована на пептидном синтезаторе Applied Biosystems 433А с использованием стратегии FastMoc 0.25 [Atherton et. al. 1989].
Таблица 1
Оценка связывания пептидов с активным сайтом белка интегрин aIIb/ß3, полученная с использованием программы «Алгокомб»
№ Пептид Оценка связывания
1 Lys-His-Ala-Asp-Asp 16.52
2 Arg-Trp-Gly-Asp-Trp 16.19
3 Arg-Val-Gly-Asp-Arg 15.94
4 Cys-His-Ala-Asp-Asp 15.92
5 Arg-Ile-Gly-Asp-Trp 15.89
Стратегия FastMoc 0.25 подразумевает последовательное присоединение остатков аминокислот к нерастворимой полимерной подложке. Базовая лабильная группа Бшос - 9-флуоренилметоксикарбонил используется для защиты К-групп каждого аминокислотного остатка. Остатки, которые имеют потенциально реактивные боковые цепи, защищены кислотонеустойчивыми группами.
После удаления группы Бшос пиперидином следующую защищенную аминокислоту добавляют, используя или реактив сцепления, или предварительно активированное по карбоксильной группе производное аминокислоты.
В качестве активатора первой аминокислоты в Бшос-стратегии в реакции присоединения ее к смоле выступает дициклогексилкарбодиимид (ОСС). Реакция протекает в
Алексеев А. А., Брылёв М. И., Королёв В. Л., Лоторев Д. С., Лизунов А. Ю., Батуев Е. А., Павлова Л. А.
Пептидные ингибиторы агрегации тромбоцитов
присутствии 4-диметиламинопиридина (DCC/DMAP), который играет роль катализатора процесса.
В качестве активатора второй и последующих аминокислот в Fmoc-стратегии выступает 1-гидроксибензотриазол в присутствии дициклогексилкарбодииимида (HOBt/DCC). Реакция протекает с образованием активированной аминокислоты и N,N -дициклогексилмочевины (DCU).
Все вышеперечисленные операции протекают в пептидном синтезаторе.
Для снятия пептида со смолы в вытяжном шкафу в полипропиленовой пробирке готовили смесь со следующим соотношением компонентов: TAN (тианизол) - 2.5%, TIPS (триизопропилсилан) - 2.5%, EDT (этандитиол) - 5%, TFA (трифторуксусная кислота) - 90%. Приготовленную смесь помещали на лед до остывания на 20-30 мин. Затем в холодную смесь для снятия пептида помещали пептид-смолу (смолу с пришитым пептидом) и перемешивали. Помещали пробирку с пептид-смолой в полипропиленовую пробирку, закрывали и выдерживали на качалке в течение 4 часов.
Экстракция пептида со смолы проводилась на стеклянном фильтре-воронке в вытяжном шкафу. Воронка предварительно ополаскивалась дважды МТВЕ (метилтретбутиловый эфир). По окончании снятия пептида со смолы смесь сливали на фильтр Шотта. Промывали пробирку, в которой шла реакция TFA, смыв сливали на фильтр. Фильтровали при небольшом вакууме до осушения смолы. Добавляли холодный МТВЕ, тщательно промывали смолу и фильтровали до осушения. Промывали пробирку, в которой находилась пептид-смола, трижды холодным МТВЕ и добавляли смыв к основному сливу. Тщательно перемешивали взвесь, оставляли не менее чем на 1 час при -20оС. Осадок отфильтровывали, сушили.
Очистку пептидов осуществляли с помощью высокоэффективного препаративного жидкостного хроматогрофа PuriFlash 450 (InterChim).
Строение синтезированных соединений подтверждено методами хромато-масс-спектрометрии, ЯМР ^-спектроскопии с привлечением двухмерных методик 1Н/1Н-спектров COSY и NOESY.
Оценка специфической активности пептидов свидетельствует о способности полученных соединений уменьшать агрегацию тромбоцитов. Результаты исследований на крови здоровых доноров представлены в таблице 2.
Таблица 2
Результаты исследования специфической антиагрегационной активности
синтезированных соединений
№ Пептид IC50, мкМ
1 Lys-His-Ala-Asp-Asp 11.1
2 Arg-Trp-Gly-Asp-Trp 70.3
3 Arg-Val-Gly-Asp-Arg 17.6
4 Cys-His-Ala-Asp-Asp 55.2
5 Arg-Ile-Gly-Asp-Trp 50.1
Полученные результаты показывают наличие доз-зависимого ингибирования АДФ -индуцированной агрегации тромбоцитов крови здоровых доноров. Выявлено, что наиболее активным ингибитором оказался пентапептид Lys-His-Ala-Asp-Asp, что хорошо соответствует результатам прогноза выполненного математического моделирования.
Выводы
1. С применением программного комплекса «Алгокомб» выполнено математическое моделирование молекул пептидов - антагонистов GPIIb/IIIa рецепторов тромбоцитов.
2. Синтез наиболее эффективных смоделированных соединений проведен твердофазным способом на автоматическом пептидном синтезаторе по стандартному протоколу стратегии FastMoc 0.25. Очистка произведена на препаративном хроматографе. Строение синтезированных соединений подтверждено методами хромато-масс-, ЯМР 1Н-спектроскопии с привлечением двухмерных методик 1Н/1Н -спектров COSY и NOESY.
3. Выполнена оценка специфичности действия синтезированных соединений in vitro на крови здоровых доноров и показано доз-зависимое снижение АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов.
Библиографический список
Хёльтье Х.-Д., Зиппель В., Роньян Д., Фолькерс Г. Молекулярное моделирование: теория и практика. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. 318 с.
Atherton E., SheppardR.C. Solid Phase peptide synthesis: a practical approach. Oxford, England. 1989, Р. 459-541.
Born G.V. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal // Nature. 1962. V. 194. P. 927-929.
FarrellD.H., Thiagarajan P., ChungD.W., Davie E.W. Role ot fibrinogen alpha and gamma chain sites in platelet aggregation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 10729-10732.
NewmanP.J., PonczМ. Inherited disorders of platelets. N.Y., 1995. V. 3. P. 3335-3367.
Plow E.F., Loftus J.C., Levin E.G., Fair D.S., Dixon D., Forsyth J., Ginsberg M.H. Immunologic relationship between platelet membrane glycoprotein GPIIb/IIIa and cell surface molecules expressed by a variety of cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1986. V. 83. P. 6002-6024.
RCSB Protein Data Bank (PDB). Электронная база данных расшифрованных трехмерных структур белковых комплексов PDB [Электронный ресурс] // [сайт the Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB)]. [2003-2013]. URL: http://www.rcsb.org/pdb/ (дата обращения: 15.07.2012)
Ruoslahti E., Pierschbacher M.D. New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins // Science. 1987. V. 238. P. 491-515.
Tomiyama Y., Tsubakio T., Piotrowicz R.S., Kurata Y., Loftus J.C., Kunicki T.J. The Arg-Gly-Asp (RGD) recognition site of platelet glycoprotein IIb-IIIa on nonactivated platelets is accessible to high-affinity macromolecules // Blood. 1992. V. 79. P. 2303-2312.
Weisel J.W., Nagaswami C., Vilaire G., Bennett J.S. Examination of the platelet membrane glycoprotein IIb-IIIa complex and its interaction with fibrinogen and other ligands by electron microscopy // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 16637-16643.
Zou L., Schmaier A.H. Platelet Aggregation Testing in Platelet-Rich Plasma // Am J Clin Pathol. 2005. P. 172-183.
