CC BY
0OECD+WoS: 1.06+QU (Microbiology), 4.01+AM (Agronomy) https://doi.org/10.31993/2308-6459-2024-107-4-16713
Краткое сообщение
ПЕКТОЛИТИЧЕСКИЕ БАКТЕРИИ РОДА PSEUDOMONAS ИЗ ПОРАЖЁННЫХ МОКРОЙ ГНИЛЬЮ КЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ
В.А. Платонов1, О.И. Хасбиуллина2, В.М. Андреевская3,4, Г.Л. Филатова5, С.Н. Еланский13, Е.М. Чудинова1*
'Российский университет дружбы народов, Аграрно-технологический институт, Москва 2Камчатский научно-исследовательский институт сельского хозяйства - филиал ФИЦ «Всероссийский институт генетических ресурсов растений имени Н.И. Вавилова», с. Сосновка, Камчатский край 3Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Москва 4Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии, Большие Вяземы, Московская область 5Научно-исследовательский институт проблем хранения Росрезерва, Москва
*ответственный за переписку, e-mail: [email protected]
При обследовании промышленных картофелехранилищ в Костромской области и Камчатском крае из клубней картофеля, пораженных мокрой гнилью, были выделены в чистую культуру и идентифицированы пектолитические бактерии рода Pseudomonas. Выделенные штаммы различались между собой и отличались от штаммов пектолитических Pseudomonas, выделенных из картофеля ранее, по последовательностям гена 16S рибосомной РНК, участку гена субъединицы В ДНК-гиразы и фрагмента гена сигма-фактора ДНК-зависимой РНК-полимеразы. На основании анализа последовательностей можно отнести выделенные бактерии к группе P fluorescens. Выделенные бактерии вызывали мацерацию тканей клубней картофеля при температурах 10 °С и 25 °С, причем пораженный участок ткани картофеля интенсивно флуоресцировал при освещении ультрафиолетом. При температуре 37 °С рост бактерий полностью ингибировался. LOPAT профиль соответствовал группе IVa фитопатогенных Pseudomonas.
Ключевые слова: Solanum tuberosum, мягкая гниль картофеля, бактериальные болезни картофеля, хранение картофеля
Поступила в редакцию: 02.10.2024 Принята к печати: 06.12.2024
Введение
Бактериальные болезни картофеля особенно опасны в случаи, когда возбудителями мокрой гнили картофеля яв-период хранения. Из-за высокой скорости развития болез- лялись другие бактерии. В Китае было зарегистрировано ни и отсутствия эффективных химических бактерицидов поражение клубней картофеля Lelliottia amnigena (Osei et фитопатогенные бактерии способны вызвать значитель- al., 2022), а также отмечено поражение клубней фитопа-ные потери продукции в послеуборочный период. Самы- тогенными бактериями рода Pseudomonas: P. marginalis ми распространенными видами, вызывающими мокрую в Китае (Li et al., 2007) и Иране (Ghasemi et al., 2024) и гниль картофеля, являются пектолитические энтеробак- P palleroniana в Китае (Zhang et al., 2022), P. fluorescens терии, включая виды Pectobacterium spp. и Dickeya spp. в Кении (Muturi et al., 2018). Пектолитические бактерии, (Игнатов и др., 2018, Czajkowski et al., 2015, Ignatov et al., относящиеся к роду Pseudomonas, были впервые обнару-2018, Charkowski et al., 2020, Voronina et al., 2021, Bastas, жены нами на пораженных клубнях картофеля в период 2023, Vasilyeva et al., 2024). Тем не менее, хорошо известны хранения на территории Российской Федерации.
Материалы и методы
Для исследования отбирали клубни картофеля с при- соавторами (Lelliott et al., 1966). Тест на образование лева-знаками начальной стадии развития бактериальной мо- на проводили на среде СМ3 с добавлением 5% сахарозы. крой гнили. Бактерии рода Pseudomonas отбирали на Тест на растениях табака проводили в теплице ВНИИФ, среде Кинга Б (King et al., 1954) по их способности флуо- в третий и четвертый лист растения табака с помощью ресцировать в ультрафиолетовом свете. Для оценки пекто- шприца закалывали суспензию бактерий в концентрации литической активности 15 мкл водной суспензии бактерий 108 КОЕ/мл, приготовленную из 48-часовой культуры, (109 КОЕ/мл, приготовленную из 48-часовой культуры, выращенной на питательном агаре Кинга Б. Тест на при-выращенной на питательном агаре Кинга Б) наносили сутствие оксидазы и аргининдигидролазы проводили с на ломтик картофеля, помещенного во влажную камеру. помощью набора реагентов №1 «Системы индикаторные Опыт проводили при температурах 10 °С и 25°С. Резуль- бумажные для идентификации микроорганизмов» (АО таты анализировали через 20 часов. «НПО» «Микроген»).
LOPAT тест проводили следующим образом. Тест на Изоляты пектолитических бактерий рода Pseudomonas
образование левана и тест на гиперчувствительность характеризовали с помощью секвенирования универсаль-табака проводили так как описано в статье Лелиотта с ных таксономических маркеров: почти полного фрагмента
© Платонов В.А., Хасбиуллина О.И., Андреевская В.М., Филатова, Г.Л., Еланский С.Н., Чудинова Е.М. Статья открытого доступа, публикуемая Всероссийским институтом защиты растений (Санкт-Петербург) и распространяемая на условиях Creative Commons Attribution License 4.0 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).
гена 16S рибосомной РНК (праймеры 27f и 1492r) (Lane, 1991), участка субъединицы В гена ДНК-гиразы (gyrB) (праймеры gyrB-F и gyrB-R) (Agaras and Valverde, 2018) и участка гена сигма фактора ДНК-зависимой РНК-поли-меразы (rpoD) (праймеры PsEG30F и PsEG790R) (Mulet et al., 2009). Амплификацию фрагментов генов проводили в соответствии с опубликованными ранее протоколами (Lane, 1991; Agaras and Valverde, 2018; Mulet et al., 2009). Полученные ПЦР фрагменты секвенировали в компании Евроген (Москва, Россия).
Результаты
Изоляты флюоресцирующих бактерий рода Pseudomonas, обладающие пектолитической активностью, были выделены из клубней c признаками бактериальной мокрой гнили поражения из двух промышленных картофелехранилищ, расположенных в Камчатском крае и
Полученные последовательности диагностических генов сравнивали с гомологичными последовательностями из базы NCBI, найденными с помощью программы BLAST (Altschul et al., 1990) Выравнивание последовательностей ДНК проводили с помощью алгоритма ClustalW (Larkin et al, 2007), филогенетический анализ проводили с помощью метода maximum likelihood, основанный на модели Tamura-Nei в программе MegaX с параметрами по умолчанию (Kumar et al., 2018) Бутстреп-анализ достоверности филогенетической группировки был проведен для 1000 итераций (Tamura and Nei, 1993).
и обсуждение
Костромской области. После видовой идентификации три штамма были сохранены в коллекции фитопатогенных микроорганизмов РУДН им. Патриса Лумумбы, а соответствующие им последовательности таксономически-важ-ных генов депонированы в Генбанк NCBI (таблица 1).
Таблица 1. Места сбора клубней и номера, депонированных в Генбанк NCBI последовательностей участков генов 16S рибосомной РНК (16S), субъединицы В ДНК-гиразы (gyrB), и сигма-фактора ДНК-зависимой РНК-полимеразы (rpoD)
Table 1. Place of tuber collection and NCBI database sequence numbers of gene regions: 16S ribosomal RNA (16S), DNA gyrase subunit B (gyrB), sigma factor of DNA-dependent RNA polymerase (rpoD)
Название штаммов Место сбора клубней NCBI 16S NCBI gyrB NCBI RpoD
B23Kam9B Камчатский край PP422961 PP429243 PP429244
203_3 Костромская область PQ459469 PQ461830 PQ461829
203 4 Костромская область PQ459470 PQ461831 PQ497111
При описании фитопатогенных бактерий рода Pseudomonas стандартным тестом является LOPAT. При исследовании штаммов выяснилось, что они обладают профилем - L+O+P+A+T- (таблица 2). Полученный профиль соответствует группе IVa фитопатогенных Pseudomonas (Lelliott et al., 1966), такие же характеристики были отмечены у P. marginalis pv. marginalis, вызывающей мягкую гниль у картофеля (Li et al, 2007).
Tаблица 2. LOPAT профиль для выделенных штаммов (L- образование левана, O-тест на наличие оксидазы, P - мацерация ломтиков картофеля, A - присутствие аргининдигидролазы, T - гиперчувствительность табака при уколе суспензией бактерий); «+» - наличие признака, «-» - отсутствие признака
Table 2. LOPAT profile for isolated strains (L - Levan formation, O - Oxidase production, P - Pectinolytic activity,
A - Arginine dihydrolase production, T - Tobacco hypersensitivity); "+" - presence of a sign, "-" - absence of
a sign
Название штаммов L O P A T
B23Kam9B + + + + -
203_3 + + + + -
203 4 + + + + -
Все штаммы проявляли пекголигическую активность как при температуре 10 °С, так и при 25 °С, причём при 10 °С поражение было менее интенсивным. При 37 °С рост бактерий ингибировался как на ломтиках картофеля, так и на питательном агаре. При освещении ультрафиолетом бактерии флюоресцировали в зеленом спектре на среде Кинга В и на ломтиках картофеля (рис.1).
Для подтверждения патогенности мы выделили бактерии с зараженных в лабораторных условиях ломтиков
Рисунок 1. Тест на пекголигическую активность штаммов B23Kam9B (сверху) и 203_3 (снизу) при дневном освещении (слева) и освещении светом ультрафиолетового спектра (справа)
Figure 1. Pectolytic activity test of strains B23Kam9B (top) and 203_3 (bottom) under daylight (left) and ultraviolet light (right) картофеля. Все проверенные флюоресцирующие на агаре Кинга Б штаммы обладали пектолитической активностью и флуоресценцией при повторном тестировании.
По всем трем генам штамм B23Kam9B (из Камчатки) и штаммы 203_3 и 203_4 были родственны видовому комплексу Pseudomonas fluorescens. По участкам генов gyrB, rpoD и 16S рРНК, штамм B23Kam9B был соответственно на 99,35%; 99,59%; 99,86% сходен с гомологичными генами штамма P. fluorescens CFBP2392 (полногеномная последовательность CP133209.1).
Штаммы из Камчатки и Костромы отличались друг от друга по участкам генов gyrB, rpoD и 16S рРНК на 97,55%, 97,76% и 98,75% соответственно. Штаммы 203_3 и 203_4 были идентичны друг другу и больше всего похожи по последовательности гена 16S (99,93% идентичности) на штамм P fluorescens VSMKU3054 (GenBank № MH443348), по последовательностям генов gyrB и rpoD - на P crudilactis UCMA 17988 (99,64% идентичности с
последовательностью MT080625; 99,55% - с MT080623 соответственно).
Ранее были описаны патогенные для картофеля бактерии, относящиеся к роду Pseudomonas: P. fluorescens (Muturi et al., 2018), P. marginalis (Cuppels and Kelman, 1980, Li et al., 2007, Ghasemi et al., 2024 ) и P palleroniana (Zhang et al., 2022). Сравнение последовательностей гена 16S рРНК показало отличие наших штаммов от штаммов этих бактерий, причем штаммы B23Kam9B, 203_3 и 203_4 группируются на фоне близкородственных штаммов вместе, несмотря на некоторые различия в последовательностях (рис. 2). На основании анализа последовательностей и LOPAT теста можно отнести выделенные бактерии к группе P fluorescens.
7ñ
IS
PQ459469 203 3 PQ459470 203 4 MH443348 P. fluorescens strain VSMKU3054
-KU977136 P. fluorescens strain yangyueP7 Juglans regia
CP133209 P. fluorescens strain CFBP2392 * PP422961 B23kam9B KT695823 P. fluorescens strain 36G2 MC461471 P. fluorescens strain LBUM570
-LC333833 P. mediterránea MAFF 311148 Solanum lycopersicum
17
50
45
66
40
CP092411 P. palleroniana strain Q1 Solanum tuberosum OQ559538 P. palleroniana strain SC15 KM527837 P. fluorescens strain TRB
- 00790025 P. tolaasii strain GZDX02 Morchella sextelata
MT583077 P. marginalis strain PMK1 Solanum tuberosum
-JABUHT000000000 P. allii strain MAFF301514 Allium cepa
MT579307 P. marginalis strain PM3 Solanum tuberosum — JAJOZGOOOOOOOOO P. petroselini strain MAFF311094 Petroselinum crispum -JAFHKIOOOOOOOOO P. lactucae MAFF301380 Lactuca sativa
У
PP373795 P. marginalis strain L1 Solanum tuberosum PP373796 P. marginalis strain L1-2 Solanum tuberosum MT579308 P. marginalis strain PM4 Solanum tuberosum PQ216342 P. corrugata strain ICMP 10135 Solanum lycopersicum
93
95 ' PQ216341 P. corrugata strain ICMP 10133 Solanum lycopersicum
100
JAAHBU000000000 P. brassicae strain MAFF212427 Brassica oleracea var, italica
_I AB724294 P. cichorii strain: SUPP 178 Solanum lycopersicum
KP295477 P. cichorii strain MabIA Solanum lycopersicum
99 L
NP. 074597 P. syringae strain DC3000 Solanum lycopersicum
0.0050
Рисунок 2. Дерево, построенное на основе анализа 28 последовательностей гена 16S рРНК пектолитических бактерий
рода Pseudomonas методом максимального правдоподобия на основе генетических расстояний, определенных по модели Тамуры-Нея (Tamura and Nei, 1993). Рядом с ветвями показано значение бутстреп-анализа, рассчитанного для 1000 повторений. Изоляты 203_3, 203_4 и B23kam9B (отмечены зелеными точками) получены в представленной работе
Figure 2. Tree constructed from the analysis of 28 16S rRNA gene sequences of pectolytic bacteria of the genus Pseudomonas by the maximum likelihood method based on genetic distances determined by the Tamura-Nei model (Tamura and Nei, 1993). The bootstrap value calculated for 1000 repetitions is shown next to the branches. Isolates 203_3, 203_4 and B23kam9B
(marked with green dots) were obtained in the presented work
Род Pseudomonas - обширная группа, обитающая в самых разнообразных экологических нишах, включающая в себя как виды, используемые для биотехнологических приложений, так и патогенные виды для животных и растений. Пектолитические штаммы флюоресцирующих Pseudomonas могут вызывать поражение корней и прикорневой части у широкого круга растений, и ранее их относили к P marginalis и ряду родственных видов (P virigiflava, P. allii, и др.). При развитии молекулярных методов филогенетического анализа, выяснилось, что
штаммы, определенные ранее как P. marginalis, довольно гетерогенны и могут принадлежать разным видам (Sawada et al., 2023).
Пектолитические бактерии рода Pseudomonas, вызывающие мягкую гниль клубней картофеля, мало изучены, между тем эти бактерии могут быть причиной значительных потерь при хранении. По-видимому, эти бактерии отличаются высоким генетическим разнообразием и нуждаются в дальнейшем исследовании.
Благодарности
Исследование выполнено при поддержке РНФ (грант № 23-26-00069)
Библиографический
Игнатов АН, Панычева ЮС, Воронина МВ, Джалилов ФСУ (2018) Бактериозы картофеля в Российской Федерации. Картофель и овощи. 1: 3-7 Agaras BC, Valverde C (2018) A novel oligonucleotide pair for genotyping members of the pseudomonas genus by single-round pcr amplification of the gyrb gene. Methods and Protocols 1(3): 24. https://doi.org/10.3390/mps1030024 Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ (1990) Basic local alignment search tool J. Mol. Biol. 215:403-410 Bastas KK (2023) Bacterial diseases of potato and their control. In: Qaliskan ME, Bakhsh A, Jabran K. (eds) Potato Production World wide. Cambridge: Academic Press. 179-197.
Charkowski A, Sharma K, Parker ML, Seco GA, Elphinstone J (2020) Bacterial diseases of potato. In: The Potato Crop (Campos H., Ortiz O., eds). Springer: Cham. 351-388. Cuppels DA, Kelman A (1980) Isolation of pectolytic fluorescent pseudomonads from soil and potatoes. Phytopathology 70: 1110-1115 Czajkowski R, Perombelon M, Jafra S, Lojkowska E et al (2015) Detection, identification and differentiation of Pectobacterium and Dickeya species causing potato blackleg and tuber soft rot: a review. Ann Appl Biol. 166: 18-38. https://doi.org/10.1111/aab.12166 Ghasemi S, Khodaygan P, Acimovic SG, Basavand E (2024) First report of Pseudomonas marginalis causing tuber soft rot of potato in Iran. Journal of Plant Protection Research. https://doi.org/10.24425/jppr.2024.150255 Ignatov AN, Lazarev AM, Panycheva JS, Provorov NA, Chebotar VK (2018) Potato phytopatogens of genus Dickeya - a mini review of systematics and etiology of diseases. Agricultural Biology. 53: 123-131. King EO, Ward MK, Raney DE (1954) Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin. J. Lab. Clin. Med. 44:301-307 Kumar S, Stecher G, Li M, Knyaz C, Tamura K (2018) MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across Computing Platforms. Mol Biol Evol. 35(6):1547-1549 Lane DJ (1991) 16S/23S sequencing. In: Stackebrandt E, Goodfellow M editors. Nucleic Acid Technologies in Bacterial Systematics. Wiley: Chichester. 115-
список (References)
Lelliott RA, Billing E, Hayward AC (1966) A determinative scheme for the fluorescent plant pathogenic pseudomonads. J Appl Bacteriol. 29(3):470-89 Li J, Chai Z, Yang H, Li G, Wang D (2007) First report of Pseudomonas marginalis pv. marginalis as a cause of soft rot of potato in China. Australasian Plant Disease Notes. 2: 71-73. https://doi.org/10.1071/DN07029 Mulet M, Bennasar A, Lalucat J, Garcia-Valdés E (2009) An rpoD-based PCR procedure for the identification of Pseudomonas species and for their detection in environmental samples Mol. Cell. Probes. 23: 140-147. https://doi.org/10.1016/j.mcp.2009.02.001 Muturi P, Yu J, Li J, Jiang M, et al (2018) Isolation and characterization of pectolytic bacterial pathogens infecting potatoes in Nakuru County, Kenya. J Appl Microbiol. 124(6): 1580-1588. https://doi.org/10.1111/jam.13730 Osei R, Yang C, Cui L, Ma T, et al (2022) Isolation, identification, and pathogenicity of Lelliottia amnigena causing soft rot of potato tuber in China. Microb Pathog. 164: 105441. https:// doi.org/10.1016/j.micpath.2022.105441 Sawada H, Fujikawa T, Satou M (2023) Dismantling and reorganizing Pseudomonas marginalis sensu lato. Plant Pathology. 72: 654-666. https://doi.org/10.1111/ppa.13690 Tamura K, Nei M (1993) Estimation ofthe number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees. Molecular Biology and Evolution. 10: 512-526. https://doi.org/10.1093/oxfordjournals.molbev. a040023
Vasilyeva AA, Evseev PV, Ignatov AN, Dzhalilov FS-U (2024) Pectobacterium punjabense causing blackleg and soft rot of potato: the first report in the Russian Federation. Plants. 13: 2144. https://doi.org/10.3390/plants13152144 Voronina MV, Lukianova AA, Shneider MM, Korzhenkov AA, et al (2021) First report of Pectobacterium polaris causing soft rot and black leg of potato in Russia. Plant Dis. 105(6):1851. https://doi.org/10.1094/PDIS-09-20-1864-PDN Zhang Y, Peng S, Ren Y, Yao T, et al (2022) First report of Pseudomonas palleroniana causing potato soft rot in China. Plant Dis. 553. https://doi.org/10.1094/ PDIS-04-22-0816-PDN
Translation of Russian References
Ignatov AN, Panycheva YuS, Voronina MV, Dzhalilov FSU (2018) [Bacterioses of potato in Russian Federation]. Kartofel i ovoshchi. 1: 3-7 (In Russian)
Plant Protection News, 2024, 107(4), p.
OECD+WoS: 1.06+QU (Microbiology), 4.01+AM (Agronomy) https://doi.org/10.31993/2308-6459-2024-107-4-16713
Short communication
PECTOLYTIC BACTERIA OF THE GENUS PSEUDOMONAS FROM DISEASED POTATO TUBERS V.A. Platonov1, O.I. Khasbiullina2, V.M. Andreevskaya34, G.L. Filatova5 S.N. Elansky13, E.M. Chudinova1*
1Peoples' Friendship University of Russia, Agrarian and Technological Institute, Moscow, Russia 2Kamchatka Research Institute of Agriculture - branch of the Federal Research Center "All-Russian Institute of Plant Genetic
Resources named after N. I. Vavilov", Sosnovka, Kamchatka, Russia 3Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia 4All-Russian Research Institute of Phytopathology, Bolshie Vyazemy, Moscow oblast, Russia 5Research Institute for Problems of Storage of Rosrezerv', Moscow, Russia
*corresponding author, e-mail: [email protected]
During the examination of industrial potato storage facilities in the Kostroma Region and Kamchatka Krai, potato tubers with soft rot symptoms were collected. Pectolytic bacteria of the genus Pseudomonas were isolated and identified. The isolated pectolytic Pseudomonas strains differed from each other and from other isolated from potatoes in the sequences of the 16S ribosomal RNA gene, a region of the B subunit gene of DNA gyrase, and a fragment of the sigma factor gene of DNA-dependent RNA polymerase. Based on the analysis of the sequences, the isolated bacteria can be attributed to the P fluorescens group. The isolated bacteria caused maceration of potato tuber tissues at a temperature of 10 °C and 25 °C. The affected potato tissue intensely fluoresced when illuminated with ultraviolet light. At a temperature of 37 °C bacterial growth was completely inhibited. The LOPAT profile corresponds to group IVa of phytopathogenic Pseudomonas.
Keywords: Solanum tuberosum, soft rot of potato, bacterial diseases of potato, storage of potatoes Submitted: 02.10.2024 Accepted: 06.12.2024
© Platonov VA., Khasbiullina O.I., Andreevskaya VM., Filatova G.L. Elansky S.N., Chudinova E.M., published by All-Russian Institute of Plant Protection (St. Petersburg). This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License 4.0 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).
