CC BY
35
20 ^ НЕЙРОХИРУРГИЯ И НЕВРОЛОГИЯ КАЗАХСТАНА №4 (49), 2017
УДК 616.832-001.33 : 616-008.9-092.18 : 616-092.4
Б.Б. Жетписбаев, Т.Т. Керимбаев (д.м.н.), В.Г. Алейников, А.О. Кожахметова АО «Национальный центр нейрохирургии», г. Астана, Казахстан
ПАТОМОРФОЛОГИЯ РЕГЕНЕРАЦИИ СПИННОМОЗГОВОЙ ТРАВМЫ
В ЭКСПЕРИМЕНТЕ У КРЫС
Введение. Повреждение спинного мозга является одной из самых разрушительных травм и может приводить к тяжелым осложнениям. Лекарственная терапия, рекомендуемая для лечения травматических повреждений спинного мозга, используется, но малоэффективна. В последнее время в экспериментальных лабораторных исследованиях перспективной стратегией для лечения спинномозговой травмы считают подсадку периферических нервов с нейротрофическими факторами и трансплантацией стволовых клеток. Цель исследования: выявить патоморфологические признаки регенерации спинномозговой травмы в эксперименте у крыс, которым оперативным путем была проведена подсадка периферического нерва пропитанного гидрогелем.
Материалы и методы. Эксперименты проведены на 30 аутбредных крысах-самцах линии Вистар весом 180200 грамм. 7 животных были выведены из эксперимента путем декапитации, на 60 сутки эксперимента. Область повреждения спинного мозга подвергалась патоморфологическому и иммуногистохимическому исследованию.
Заключение. В нейронах в месте установки аутотрансплантанта из периферического нерва, имбибированного гидрогелем имели место явления регенерации аксонов, клинически проявляющиеся признаками частичного восстановления утраченных сенсомоторных функций спинного мозга.
Ключевые слова: спинномозговая травма, патоморфология, иммуногистохимия, аксон, эксперимент.
Введение. Повреждение спинного мозга является одной из самых разрушительных травм и может приводить к тяжелым осложнениям. Регенерация спинномозговой травмы процесс длительный и зачастую заканчивается потерей функций спинного мозга. В настоящее время лекарственная терапия, рекомендуемая для лечения травматических повреждений спинного мозга, используется, но малоэффективна [1, 2, 3, 4, 5].
В последнее время в экспериментальных лабораторных исследованиях перспективной стратегией для лечения спинномозговой травмы считают подсадку периферических нервов с нейро-трофическими факторами и трансплантацией стволовых клеток [6, 7].
В морфогенезе регенерации спинномозговой травмы большую роль играет пролиферация аксонов, глиоцитов, шванновских клеток мигрирующих в область повреждения, разрастание грануляционной ткани, формирование глиоме-зодермального рубца [8, 9]. Для восстановления функций спинного мозга необходима регенерация аксонов нервных клеток, которая выявляется иммуногистохимически маркерами нейрональной дифференцировки: нейрон-специфическая энолаза (NSE), нейрональный ядерный антиген ^еи^, ассоциированный с микротрубочками белок 2 (МАР2) [10, 11, 12].
Цель исследования: выявить патоморфоло-гические признаки регенерации спинномозговой травмы в эксперименте у крыс, которым оперативным путем была проведена подсадка перифери-
ческого нерва пропитанного гидрогелем на основе гиалуроновой кислоты (НА), термостабилизиро-ванной хондроитиназы ABC (ChABC), аутологичных мезенхимальных стволовых клеток (МСК) и нейро-трофических факторов.
Материалы и методы: Эксперименты проведены на 30 аутбредных крысах-самцах линии Вистар весом 180-200 грамм. Животные подразделялись на контрольную и основную группы, содержались в стандартных условиях со свободным доступом к воде и корму. Моделирование полного повреждения спинного мозга проводилось на уровне шейно-грудного отдела позвоночника. В стерильных условиях под внутривенной анестезией и микроскопическим контролем проводился разрез кожи и мягких тканей животного, скелетировались позвонки. Производилась ламинэктомия двух-трех позвонков, мобилизировался спинной мозг. Далее, под визуальным контролем производилось моделирование травмы спинного мозга путем его максимальной компрессии анатомическим зажимом Микулича в трех направлениях (под углом 90, 45 и 0 градусов). Накладывались послойные швы на рану.
После операции проводилась оценка неврологического статуса, электронейромиографическое исследование для установления полного повреждения спинного мозга. Для контрольной группы животных оперативное вмешательство на этом заканчивалось.
Для основной группы животных (после оценки неврологического статуса и инструментальной
Б.Б. Жетписбаев, e-mail: [email protected]
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Рисунок 1 - Место соединения спинного мозга и нерва.
Х 100. Окраска гематоксилином и эозином
верификации травмы спинного мозга) проводился 2 этап операции. В стерильных условиях под внутривенной анестезией и использованием микроскопа производился разрез длиной около 3 см. по внутреннему краю плечевой кости, мобилизовались крупные нервы обеих верхних конечностей (локтевой и срединный). Под микроскопом проводилось пропитывание приготовленным гидрогелем на основе НА нервов - трансплантатов (в количестве четырех). Пропитывание нервов осуществлялось инсулиновым шприцом по всей длине трансплантата. Проводился разрез по старому рубцу и осуществлялся доступ к поврежденному ранее участку спинного мозга на уровне шейно-грудного отдела позвоночника. Вскрывалась твердая мозговая оболочка. Спинной мозг мобили-зировался в краниальном и каудальном направлениях до неповрежденной ткани. Производилось рассечение мягкой мозговой оболочки в проекции кортикоспинального тракта с обеих сторон выше и ниже участка повреждения, микродиссекторами раздвигалась ткань спинного мозга на глубину до 2-3 мм, устанавливались пропитанные гидрогелем на основе НА нервы-трансплантанты (по 2 с обеих сторон в краниальном и каудальном направлениях). Они фиксировались викриловыми швами (10/0) к мягкой мозговой оболочке. Накладывались послойные швы на рану.
Ранее в динамике 23 крысы были выведены из эксперимента путем декапитации на 14, 21, 30 и 60 сутки эксперимента: 10 животных из контрольной группы на 14, 21 и 60 сутки и 13 животных из основной группы на 21, 30 и 60 сутки. Данные патоморфологического исследования этих крыс показали начальные признаки регенерации спинномозговой травмы [13, 14, 15, 16].
Оставшиеся 7 крыс из основной группы, были выведены из эксперимента на 60 сутки.
На патоморфологическое исследование забирался фрагмент спинного мозга длинной 3-4см (по 1,5-2 см в ростральном и каудальном направлении от эпицентра повреждения), вместе с позвонками. Материал был фиксирован в течении 24 часов в 10% нейтральном формалине, с после-
Рисунок 2 - Место соединения спинного мозга и нерва.
Х 200. Окраска гематоксилином и эозином
дующей традиционной проводкой. Применялась окраска гематоксилином и эозином. Иммуногисто-химическое исследование проводилось с применением антител - GFAP (RTU), NSE (RTU), NeuN (RTU), BrdU (RTU), MAP2 (RTU). Патоморфологическое исследование осуществлялось при помощи микроскопа Axioskop 40, Carl Zeiss, Germany, при общем увеличении Х 100, Х 200.
Результаты и обсуждения. При гистологическом исследовании в месте соединения ткани спинного мозга и нерва определялся неравномерно выраженный отек, очаговая лимфогисти-оцитарная инфильтрация с примесью единичных плазмоцитов и эозинофилов (рис. 1 и 2).
При иммуногистохимическом исследовании с применением нейрон-специфической енолазы (NSE) в месте соединения спинного мозга и нерва среди воспалительных клеток определялись скопления нейронов с отростками (рис. 3).
Рисунок 3 - Нейроны с отростками. Х 100.
Иммуногистохимия: позитивная реакция с NSE
При иммуногистохимическом исследовании с применением NeuN и Map 2 в нейронах отмечались признаки полной и неполной функциональной регенерации аксонов, образование новых отростков с направлением их к нерву-трансплантанту (рис. 4 и 5).
Заключение. Таким образом, патоморфологическое и иммуногистохимическое иссле-
¿LJJ^
НЕЙРОХИРУРГИЯ И НЕВРОЛОГИЯ КАЗАХСТАНА
№4 (49), 2017
Рисунок 4 - Нейрон с явлениями регенерации аксона. Х 200. Иммуногистохимия: позитивная реакция с NeuN
Рисунок 5 - Нейрон с явлениями регенерации аксона. Х 200. Иммуногистохимия: позитивная реакция с Map 2
дование спинного мозга крыс позволяют сделать вывод что в нейронах в месте установки аутотрансплантанта из периферического нерва, имбибированного гидрогелем имеют место явления полной и неполной функциональной регенерации аксонов, образование новых отростков с направлением их к нерву-трансплантанту. Регенерация аксонов клинически прояв-
лялась признаками частичного восстановления утраченных сенсомоторных функций спинного мозга. Полученные результаты у подопытных животных могут послужить основой для разработки нового метода лечения у пациентов с последствиями позвоночно-спинномозговых травм, что безусловно, будет иметь большое практическое значение.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Кривицкая Т.Н. Патоморфология позвоночно-спинномозговой травмы. Нейротравматология: Под ред. А.Н. Коновалова, Л.Б. Лихтермана, А.А. Потапова. - М.: Вазар-Ферро, 1994 - С.276-277.
2. Bekbolsynov D.A., Ogay V.B., Raimagambetov E.K., Mukhambetova A.E. Mesenchymal stem cells in hyaluronic acid scaffold as a therapeutic tool for osteoarthritis - pleminary report // Вестник КазНУ: Серия биологическая. - 2012. - №4(56). -С. 355-358.
3. Prestwich G.D. Hyaluronic acid-based clinical biomaterials derived for cell and molecule delivery in regenerative medicine // J Control Release. - 2011. - Vol. 155(2). - P. 193-9.
4. Jain A., Kim Y.T., McKeon R.J., Bellamkonda R.V. In situ gelling hydrogels for conformal repair of spinal cord defects, and local delivery of BDNF after spinal cord injury // Biomaterials. - 2006. - Vol. 27(3). - P. 497-504.
5. Mothe A.J., Tam R.Y., Zahir T., Tator C.H., Shoichet M.S. Repair of the injured spinal cord by transplantation of neural stem cells in a hyaluronan-based hydrogel // Biomaterials. - 2013. - Vol. 34(15). - P. 3775-83.
6. Seo J.H., Cho S.R. Neurorestoration induced by mesenchymal stem cells: potential therapeutic mechanisms for clinical trials // Yonsei Med J. -2012. - Vol. 53(6). - P. 1059-67.
7. Vawda R., Fehlings M.G. Mesenchymal cells in the treatment of spinal cord injury: current & future perspectives // Curr Stem Cell Res Ther. - 2013. -Vol. 8(1). - P. 25-38.
8. Жетписбаев Б.Б., Керимбаев Т.Т., Алейников В.Г., Кожахметова А.О. Патоморфология и морфогенез начальной стадии регенерации спинномозговой травмы в эксперименте у крыс // Нейрохирургия и неврология Казахстана. -2017. - № 1(46). - C. 16-20.
9. Жетписбаев Б.Б., Керимбаев Т.Т., Алейников В.Г., Кожахметова А.О. Морфогенетические аспекты начальной регенерации спинномозговой травмы в эксперименте у крыс // XVI всероссийская научно-практическая конференция «Поленовские чтения», СПб, 2017 г.
10. Мухамедшина Я.О., Шаймарданова Г.Ф., Мухитов А.Р., Салафутдинов И.И., Ризванов А.А., Зарубина В.Н., Челышев Ю.А. Выживание и дифференцировка мигрирующих в спинной мозг эндогенных шванновских клеток под влиянием нейротрофических факторов. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VII, № 3, 2012.
11. Далина А.Д., Мухамбетова А.Е., Батпенов Н.Д., Раймагамбетов, Е.К., Огай В.Б. Влияние ростовых факторов TGF-P1, IGF-I, BMP-2 и BMP-4 на хондрогенную дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из синовиальной оболочки человека // Биотехнология: теория и практика. - 2013. - № 2. - С. 12-15.
12. Tom V.J., Sandrow-Feinberg H.R., Miller K., Santi L., Connors T., Lemay M.A., Houle J.D. Combining peripheral nerve grafts and chondroitinase promotes
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
4-л
functional axonal regeneration in the chronically injured spinal cord // J Neurosci. - 2009. - Vol. 29(47). - P. 14881-90.
13. Tom V.J., Sandrow-Feinberg H.R., Miller K., Domi-trovich C., Bouyer J., Zhukareva V., Klaw M.C., Le-may M.A., Houle J.D.. Exogenous BDNF enhances the integration of chronically injured axons that regenerate through a peripheral nerve grafted into a chondroitinase-treated spinal cord injury site // Exp Neurol. - 2013. - Vol. 239. - P. 91-100.
14. Fehlings M.G., Vawda R. Cellular treatments for spinal cord injury: the time is right for clinical trials // Neurotherapeutics. - 2011. - Vol. 8(4). - P. 704-20.
15. Parr A.M., Tator C.H., Keating A. Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells for the repair of central nervous system injury // Bone Marrow Transplant. - 2007. - Vol. 40(7). - P. 609-19.
16. Macaya D., Spector M. Injectable hydrogel materials for spinal cord regeneration: a review // Biomed Mater. - 2012. - Vol. 7(1). - P. 012001.
ТТЙ1НДЕМЕ
Б.Б. Жетписбаев, Т.Т. Керимбаев (M.F.d.), В.Г. Алейников, А.О. Кожахметова «¥лттык нейрохирургия орталыгы» AK,, Астана к,., К,азак,стан
ЕГЕУК¥ЙРЫКТАРГА ТЭЖ1РИБЕ ЖАСАУДА Ж¥ЛЫН ЖАРАКАТЫН РЕГЕНЕРАЦИЯЛАУ ПАТОМОРФОЛОГИЯСЫ
Kipicne. Жулынды закымдау ец ауыр жаракат болып саналады жэне ауыр аскынуларта экеледК Жулынныц жаракаттык закымдануларын емдеу Yшiн усынылатын дэрЫк терапия колданылады, бiрак т^мдтИ аз. Соцты кездерi тэжiрибелiк зертханаларда жулын жаракатын емдеу Yшiн келешекте стратегия болып нейротрафиялык факторлармен бiрге шеткi нервтердi отыртызу жэне батаналык жасушаларды трансплантациялау болып есептеледК
Зepттeудiц мацсаты: операциялык жолмен гидрогельмен аадр^ген шеткi нервтердi отыртызу етюзтген егеукуйрыктарта эксперимент жасауда жулын жаракатын регенерациялаудыц патоморфологиялык белгiлерiн шытару.
Материалдар жэне эдстер. Эксперименттер салматы 180-200 грамм Вистар линиясындаты аутбредтi 30 аталык егеукуйрыкка еткiзiлдi. 7 жануарта эксперименттщ 60-шы тэулiгiнде декапи-тация жолымен эксперименттен шытарылды. Жулынныц закымдалу мацы патоморфологиялык жэне иммуногистохимиялык зерттеуге алынды.
Корытынды. Имбибирленген гидрогельмен шетк нервтен аутопрансплантант орнатылтан жердегi нейрондарда жулынныц шытындалтан сенсомоторлык функцияларын белшектеп калпына келтiру белгiлерiнiц клиникалык бЫнут, аксондардыц регенерациясыныц шыту орны бар.
Непзп свздер: жулын жаракаты, патоморфо-логия, иммуногистохимия, аксон, эксперимент.
SUMMARY
B.B. Zhetpisbayev, T.T. Kerimbayev (D.Med.Sci.), V.G. Aleinikov, A.O. Kozhakhmetova JSC National Centre for Neurosurgery, Astana, Republic of Kazakhstan
PATHOMORPHOLOGY OF REGENERATION OF SPINAL INJURY IN
EXPERIMENT IN RATS
Introduction. The spinal cord injury is one of the most destructive injuries and can lead to serious complications. Drug therapy, recommended for the treatment of traumatic spinal cord injuries, is used, but ineffective. Recently, in experimental laboratory studies, a promising strategy for treating spinal cord injury is peripheral nerve grafting with neurotrophic factors and stem cell transplantation.
The aim of the study was to reveal the pathomorphological signs of regeneration of spinal cord injury in an experiment in rats, which had surgically applied grafting of the peripheral nerve impregnated with hydrogel.
Materials and methods. The experiments were performed on 30 outbred male Wistar rats weighing 180-200 grams. 7 animals were withdrawn from the experiment by decapitation, on the 60th day of the experiment. The area of spinal cord injury was subjected to pathomorphological and immunohistochemical studies.
Conclusion. In neurons in the place of installation of an autograft from the peripheral nerve, imbibized with hydrogel, there were the phenomena of axon regeneration, clinically manifested as signs of partial restoration of the lost sensorimotor functions of the spinal cord.
Keywords: spinal trauma, pathomorphology, immunohistochemistry, axon, experiment.
