CC BY
36
УДК 616.951.1+616 +012+612.017
С.А. Витязева, Т.П. Старовойтова, Л.М. Михайлов, Н.Л. Баранникова, В.И. Дубровина,
Т.Т. Шкаруба
ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКАЯ И ГЕМАТОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗМЕНЕНИЙ В ОРГАНИЗМЕ МОРСКИХ СВИНОК ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ БРУЦЕЛЛЕЗЕ, ВЫЗВАННОМ ВОЗБУДИТЕЛЕМ ИНФЕКЦИИ В L-ФОРМЕ
Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока (Иркутск)
Проведено изучение морфофункционального состояния паренхиматозных органов экспериментальных животных, зараженных возбудителем, бруцеллеза в L-форме на ранних сроках исследования. Иммунную перестройку макроорганизма оценивали по изменению структурных компонентов и клеточного состава селезенки и регионарного лимфатического узла. Токсическое действие Brucella И-6 (L-форма) оценивали по изменению индекса нейтрофильного сдвига и патологической зернистости нейтрофилов периферической крови.
Ключевые слова: L-форма, бруцеллез, кровь, морфометрия
PATHOMORPHOLOGICAL AND HEMATOLOGICAL CHARACTERISTIC OF CHANGES IN GUINEA PIGS’ ORGANISMS AT EXPERIMENTAL BRUCELLOSIS CAUSED BY THE PATHOGEN IN L-FORM
S.A. Vityazeva, T.P. Starovoitova, L.M. Mikhailov, N.L. Barannikova, V.I. Dubrovina,
T.T. Shkaruba
Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East, Irkutsk
Study of morphofunctional state of parenchymatous organs of the experimental animals infected, with the brucellosis agent in L-form was carried out in the early periods of the infection. Immune reorganisation of macroorganism, was estimated, by the change of the structural components and cellular composition, of spleen and of lymph nodes. Toxic action of Brucella I-6 (L-form) was evaluated, by the change of neutrophil shift index and. pathological granularity of peripheral blood, neutrophils.
Key words: L-form, brucellosis, blood, morphometry
Бруцеллез для России и многих зарубежных стран является серьезной проблемой здравоохранения и ветеринарии. Несмотря на значительный научно-практический материал, накопленный к настоящему времени по данной инфекции, многие вопросы, связанные как с возбудителем, так и с патологическими процессами в макроорганизме при бруцеллезе, остаются до конца не изученными. Особенно слабо освещен вопрос о характере взаимодействия макроорганизма с бруцеллезным микробом в измененной, в частности, L-форме. Одним из адаптивных биологических свойств Brucella является полная или частичная утрата ригидной клеткой стенки и S- и R-антигенных комплексов в процессе L-трансформации с сохранением репродуктивной активности. Формы с ослабленной вирулентностью возбудителя способны длительно персистировать в организме и вызывать хроническое течение заболевания и рецидивы [3]. Несмотря на большой интерес, который проявляется в последнее время к L-формам бруцелл [2, 6], знания, касающиеся изучения особенности инфекционного процесса, морфофункционального состояния иммунокомпетент-ных органов, а также их клеточного состава, недостаточны.
Целью работы явилось изучение патоморфологических изменений в органах и периферической крови морских свинок при инфекции, обусловлен-
ной L-формой возбудителя бруцеллеза на ранних сроках исследования.
МЕТОДИКА
Экспериментальной моделью в опытах служили 26 стандартных по условиям содержания и массе (250 — 300 г) морских свинок обоих полов. Животных опытной группы (20 морских свинок) заражали Brucella И-6 (L-форма), выделенной от хронически больного человека, в дозе 109 микробных клеток в 1 мл физиологического раствора подкожно в левую заднюю лапу. Контролем являлись интактные животные (6 особей).
Забор материала для исследования (кровь из вены уха, печень, селезенка, лимфатические узлы, легкое, место введения микробной взвеси) проводили на 7-е и 14-е сутки с момента заражения морских свинок. Животных выводили из эксперимента под наркозом в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (2003) (Приложение к приказу МЗ СССР № 775 от 12.08.1977 г.) и немедленно проводили вскрытие, что обеспечивало близкое к прижизненному состоянию забираемых на гистологическое исследование органов. Фиксированные мазки крови окрашивали стандартными методами [4]. Токсическое действие Brucella И-6 (L-форма) оценивали по изменению индекса нейтрофильного сдвига и патологической зернистости нейтрофилов
периферической крови [1], наличие возбудителя выявляли в мазках, окрашенных по Граму и бактериологическим методом исследования [4].
Патологоанатомический материал фиксировали в 10% нейтральном формалине, заливали в целлоидин. Тканевые срезы толщиной 6 мкм окрашивали гематоксилин-эозином и тионином [5].
В работе использовали методы обзорной микроскопии. Количественную оценку размеров структурных зон иммунокомпетентных органов проводили с помощью компьютерной программы «Motic Images Plus» (версия 2). Автоматический анализ изображения производили с помощью светового микроскопа «Zeiss» (Германия) с видеокамерой «Moticam 2000», разрешение 1392 х 1040 пикселей, об. 100. Количественную оценку клеточного состава лимфатического узла и селезенки проводили с использованием морфоме-трии (при увеличении окуляра — 7, объектив — 10, на площади квадрата сетки 360000 мкм2, в 10 полях зрения). Статистическую обработку полученных данных осуществляли стандартными параметрическими методами с использованием t-критерия Стьюдента и с применением стандартного пакета программ «Statistica», версия 6 (Copyright ©Stat Soft, Inc 19842001, ИПЧИ 31415926535897) и программы Microsoft Excel (2003) корпорации Microsoft. Достоверными считали различия при уровне значимости p < 0,05, p < 0,01.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Установлено, что в месте введения культуры на 7-е, 14-е сутки у большинства морских свинок развивается острое геморрагически-гнойное воспаление в дерме, полнокровие сосудов, отек подкожной клетчатки и мышечного слоя с инфильтрацией полиморфноядерными лейкоцитами и другими клеточными элементами. К 14-м суткам клеточная пролиферация усиливается, образуется крупный очаг воспаления.
В регионарном лимфатическом узле на 7-е сутки отмечается выраженная редукция лимфоидных фолликул, в мозговом слое — полнокровие и пролиферация эндотелия краевых синусов. На 14-е сутки наблюдается гиперплазия фолликулов с развитием герминативных центров, а также умеренная лимфоидная и ретикулярная гиперплазия с инфильтрацией плазмобластами, сегментоядерными нейтрофилами и лимфобластами (табл. 1). В отдаленных лимфатических узлах подобные изменения отсутствуют.
Во все сроки наблюдения в селезенке отмечено диффузное кровоизлияние в паренхиму органа, расширение и кровенаполнение сосудов, гиперплазия фолликулов с увеличением герминативных центров и пролиферацией бластных форм элементов, инфильтрация красной пульпы эозинофилами, ретикулярными и эпителиоидны-ми клетками. На 14-е сутки клеточная пролиферация усиливается, появляются многоядерные гигантские гиалинизированные и плазматические клетки (табл. 2).
При исследовании иммунокомпетентных органов морфометрическим методом выявлены изменения в структурных компонентах лимфатических фолликулов селезенки и регионарном лимфатическом узле. Так, на 7-е сутки в селезенке установлено увеличение общей площади фолликула (в 2,6 раза) и реактивного центра (в 2,0 раза), к 14-м суткам их размеры превышали таковые показатели у животных контрольной группы в 2,8 и 4,0 раза соответственно. В регионарном лимфатическом узле на 14-е сутки площадь фолликула превышает показатели у интактных животных в 3,5 раза, а реактивного центра — в 12,0 раз (табл. 3).
Таким образом, увеличение площади структурных зон иммунокомпетентных органов экспериментальных животных свидетельствует о повышении функциональной активности клеток, сопровождающейся изменением клеточного со-
Таблица 1
Клеточный состав лимфоидного фолликула регионарного лимфатического узла морских свинок при экспериментальном бруцеллезе, вызванном возбудителем инфекции в L- форме (М ± m)
Зоны Клетки Контроль Сроки наблюдения
7-е сутки 14-е сутки
Реактивный центр лимфоциты 58,2 ± 0,7 64,4 ± 0,6 71,5 ± 0,6*
бластные формы клеток 4,6 ± 0,3 9,4 ± 0,9* 12,8 ± 0,5**
ретикулярные клетки 3,4 ± 0,7 5,7 ± 0,2* 6,2 ± 0,3**
макрофаги 1,4 ± 0,2 2,8 ± 0,1* 3,1 ± 0,2**
Корона узелка лимфоциты 62,5 ± 0,3 78,4 ± 0,9 79,1 ± 0,6*
ретикулярные клетки 3,2 ± 0,5 5,9 ± 0,3* 6,0 ± 0,5*
макрофаги 0,8 ± 0,1 3,1 ± 0,4** 3,7 ± 0,4 **
полиморфноядерные лейкоциты 0,3 ± 0,01 2,7 ± 0,6** 3,2 ± 0,2**
эозинофилы - 3,4 ± 0,5** 3,9 ± 0,2**
плазматические клетки 0,3 ± 0,01 5,5 ± 0,3** 6,8 ± 0,6**
Примечание: «-» - клетки отсутствуют; * - p < 0,05; ** - p < 0,01 (по сравнению с контролем).
Таблица 2
Клеточный состав белой пульпы селезенки морских свинок при экспериментальном бруцеллезе, вызванном
возбудителем инфекции в L-форме (М ± m)
Зоны Клетки Контроль Сроки наблюдения
7-е сутки 14-е сутки
Периартериальная зона лимфоциты 51,3 ± 0,8 6,8,9 ± 0,3 71,4 ± 0,3*
бластные формы клеток 5,6 ± 0,2 7,3 ± 0,5 9,4 ± 0,9*
ретикулярные клетки 3,8 ± 0,1 5,4 ± 0,3* 6,7 ± 0,5*
Реактивный центр лимфоциты 42,7 ± 0,3 55,3 ± 0,6 59,8 ± 0,7*
бластные формы клеток 8,4 ± 0,5 12,2 ± 0,8* 12,9 ± 0,6*
ретикулярные клетки 3,5 ± 0,2 8,7 ± 0,3* 12,7 ± 0,6**
макрофаги 0,6 ± 0,1 2,8 ± 0,3** 4,6 ± 0,6**
Мантийная зона лимфоциты 71,3 ± 0,8 82,4 ± 0,7 84,9 ± 0,8
ретикулярные клетки 6,3 ± 0,3 9,6 ± 0,5 11,2 ± 0,5*
макрофаги 0,4 ± 0,1 2,1 ± 0,1** 5,3 ± 0,4**
плазматические клетки 0,6 ± 0,2 8,3 ± 0,5** 9,4 ± 0,4**
полиморфноядерные лейкоциты - 1,9 ± 0,2** 2,4 ± 0,3**
эозинофилы - 3,4 ± 0,2** 4,8 ± 0,5**
Краевая зона лимфоциты 59,7 ± 0,8 68,2 ± 0,9 73,1 ± 0,4*
макрофаги 1,8 ± 0,4 3,2 ± 0,5* 3,9 ± 0,4*
полиморфноядерные лейкоциты - 2,7 ± 0,2** 1,8 ± 0,3*
эозинофилы - 4,7 ± 0,3** 5,2 ± 0,6**
плазматические клетки 0,4 ± 0,1 4,2 ± 0,5** 6,7 ± 0,3**
Примечание: так же, как в таблице 1.
Таблица 3
Площадь фолликула и реактивного центра в селезенке и регионарном лимфатическом узле морских свинок при экспериментальном бруцеллезе, вызванном возбудителем инфекции в L-форме (М ± m)
Сроки исследования Исследуемые зоны (мкм) Селезенка Регионарный лимфатический узел
7-е сутки S фолликула 3,9 ± 0,17* 1,2 ± 0,05
S реактивного центра 0,2 ± 0,01* 0,1 ± 0,01
14-е сутки S фолликула 4,2 ± 0,17** 4,5 ± 0,27**
S реактивного центра 0,4 ± 0,03** 1,2 ± 0,04**
Контроль S фолликула 1,5 ± 0,13 1,3 ± 0,11
S реактивного центра 0,1 ± 0,01 0,1 ± 0,01
Примечание: * - р < 0,05; ** - р < 0,01 - статистическая значимость различий по отношению к контролю.
става фолликул. Так, к 14-м суткам наблюдается тенденция к увеличению бластных форм клеток, плазмоцитов, лимфоцитов и появление полиморфноядерных нейтрофилов.
В легких на 7-е сутки регистрируется клеточная инфильтрация межальвеолярных перегородок, к 14-м суткам развивается васкулит.
Печень экспериментальных животных опытной группы полнокровна (мускатная печень): вены и капилляры резко расширены и полнокровны, стаз, эозинофилия. К 14-м суткам отмечается периваскулярный отек с небольшим фиброзным некрозом сосудистой стенки, также имеет место дистрофия гепатоцитов и нарушение балочного строения, инфильтрация паренхимы лимфоидны-
ми элементами с явлениями пикноза и гиперплазии звездчатых клеток Купфера.
Известно, что характерной особенностью при бруцеллезе является формирование гранулем с беспорядочно расположенными эпителиоидными клетками с примесью эозинофилов и плазматических клеток в паренхиматозных органах. Нами показано, что пролиферация этих клеток в селезенке, лимфатическом узле и печени, а также появление эпителиоидных, многоядерных гигантских клеток может свидетельствовать о возможности формирования гранулем на более поздних сроках инфекционного процесса.
В мазках крови опытных животных во все сроки наблюдения отмечается гипохромная
анемия, лимфоцитопения (25,2 ± 0,3 %) и острый моноцитоз (38,6 ± 0,4 %). Данные изменения усиливаются к 14-м суткам и составляют 14,5 ± 0,2 и 47,0 ± 0,5 % соответственно по сравнению с контролем (лимфоциты — 41 ± 0,9 %; моноциты — 9 ± 0,5 %), а также выявлены бластные формы клеток и большие лимфоциты с вакуолизацией ядра. В большинстве случаев в цитоплазме моноцитов выявлены скопления мелких грамотрицательных овоидных коккобактерий. Показано, что во все сроки наблюдения количество сегментоядерных нейтрофилов резко снижается с 25,0 ± 0,8 до 13,0 ± 0,5 %, содержание молодых клеток (палочкоядерных нейтрофилов, юных и миелоцитов) увеличивается с 4,0 ± 0,1 до 16,0 ± 0,7 % по сравнению с показателями в контрольной группе, а также выявляются единичные плазматические и клетки Курлова.
Показатель индекса нейтрофильного сдвига на 7-е сутки наблюдения составляет 0,40 ± 0,02 усл. ед., к 14-м суткам отмечена тенденция к его снижению до 0,30 ± 0,01 усл. ед., тем не менее, данные показатели превосходят в 6 — 8 раз значения у интактных животных (0,05 ± 0,01 усл. ед.).
При инфекционном процессе, вызванном Brucella И-6 (L-форма) в мазках периферической крови морских свинок, установлено, что индекс патологической зернистости нейтрофилов на 7-е сутки резко возрастает до 65 %, а к 14-м суткам снижается, но, тем не менее, остается достаточно высоким и составляет 18 % от общего числа нейтрофилов. У интактных животных нейтрофилы с патологической зернистостью цитоплазмы отсутствуют.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, изучение морфофункционального состояния паренхиматозных органов экспериментальных животных, зараженных возбудителем бруцеллеза в L-форме, на ранних сроках исследования (7-е и 14-е сутки) показало, что L-формы вызывают инфекционно-аллергическую генерализованную форму бруцеллеза с возможным переходом в хроническую, что подтверждается па-
тологическими изменениями в паренхиматозных органах и выделением возбудителя из крови и селезенки. Выявленные в ходе эксперимента гистологические изменения у зараженных морских свинок характерны для инфекционного процесса, вызванного классическими штаммами бруцелл (серозное воспаление, васкулит, нарушение гемодинамики, дистрофия паренхиматозных органов, клеточная гиперплазия (пролиферация эозинофи-лов, ретикулярных, плазматических клеток), лейкопения, нейтропения с палочкоядерным сдвигом), но в менее выраженной форме.
ЛИТЕРАТУРА
1. Братцев A^., Гордиенко Л.Н. Степень патогенности бруцелл в зависимости от их происхождения и форм существования // Aктуальные проблемы ветеринарной медицины : Сб. науч. тр. — Омск, 2005. — С. 68 — 71.
2. Булдыгин Д.В., Гордиенко Л.Н., Шестаков ВА., Братцев A^. Степень выраженности реакции организма лабораторных животных в зависимости от введенной дозы L-культуры бруцелл // Матер. Всерос. науч. конф. по проблемам хронических инфекций (бруцеллез, туберкулез) : Сб. науч. тр. — Омск, 2001. — С. 86 — 89.
3. Витязева СА., Старовойтова Т.П., Дубровина В.И., Татарников СА. и др. Морфологическая оценка изменений в иммунокомпетентных органах морских свинок, зараженных Francisella tularensis разных подвидов // Бюл. ВСНЦ СО РAМН. — 2009. - № 4 (68). - С. 77-79.
4. Меньшиков В.В. и др. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник. - М., 1987. - 365 с.
5. Меркулов ГА. Курс патогистологической техники. - Л. : Медицина, 1969. - 423 с.
6. Михайлов Л.М., Калиновский АИ., Балахонов С.В. и др. Aктуальные вопросы эпидемиологии и лабораторной диагностики бруцеллеза, обусловленного L-формой возбудителя // Эпидемиология. Вакцинопрофилактика. - 2010. - № 2 (51). -С. 23-29.
Сведения об авторах
Витязева Светлана Александровна - кандидат медицинских наук, научный сотрудник лаборатории патофизиологии Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (664047, г. Иркутск, ул. Три-лиссера, 78; тел.: 8 (3952) 22-01-35, факс: 8 (3952) 22-01-40; e-mail: [email protected])
Старовойтова Татьяна Пантелеевна - научный сотрудник лаборатории патофизиологии Иркутского научноисследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока
Михайлов Леонид Михайлович - кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник отдела зоонозных инфекций Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока
Дубровина Валентина Ивановна - доктор биологических наук, старший научный сотрудник, зав. лабораторией патофизиологии Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока Баранникова Наталья Леонидовна - младший научный сотрудник отдела зоонозных инфекций Иркутского научноисследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока
Шкаруба Татьяна Тимофеевна - научный сотрудник Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока
