CC BY
39
original article
Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ, в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» (соглашение № 14.604.21.0059 от 27 июня 2014, уникальный идентификатор прикладных научных исследований (проекта) RFMEFI60414X0059).
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
литература
1. Пиотровский Л.Б., Киселев О.И. Фуллерены в биологии. Издательство «Росток»: СПб; 2006.
2. Babakhin A.A., Andrievsky G., DuBuske L.M. Inhibition of systemic and passive cutaneous anaphylaxis by water-soluble fullerene C60. J. Allerg. Clin. Immunol. 2009; 123(2): 118.
3. Андреев С.М., Пургина Д.Д., Башкатова Е.Н., Гаршев А.В., Маерле А.В., Хаитов М.Р. Эффективный способ получения водных нанодисперсий фуллерена С60. Российские нанотехнологии. 2014; 7-8: 11—7.
4. Shershakova N., Baraboshkina E., Andreev S., Purgina D., Struch-kova I., Kamyshnikov O., et al. Anti-inflammatory effect of fullerene С in a mice model of atopic dermatitis. J. Nanobiotechnol. 2016; 14:8 DOI: 10.1186/s12951-016-0159-z.
references
1. Piotrovskiy L.B., Kiselev O.I. Fullerenes in biology. [Fullereny v bi-ologii]. Publishing «Rostov»: St. Petersburg; 2006. (in Russian)
2. Babakhin A.A., Andrievsky G., DuBuske L.M. Inhibition of systemic and passive cutaneous anaphylaxis by water-soluble fullerene С60. J. Allerg. Clin. Immunol. 2009; 123 (2): 118.
3. Andreev S.M., Purgina D.D., Bashkatova E.N., Garshev A.V., Maerle A.V., Khaitov M.R. An effective way to obtain water C60 nanodisper-sions. RossiyskieNanotechnologii. 2014; 7-8: 11—7. (in Russian)
4. Shershakova N., Baraboshkina E., Andreev S., Purgina D., Struch-kova I., Kamyshnikov O. et al. Anti-inflammatory effect of fullerene C60 in a mice model of atopic dermatitis. J. Nanobiotechnol. 2016; 14: 8 DOI: 10.1186 / s12951-016-0159-z.
Поступила 01.08.16 Принята в печать 16.08.16
КЛИНИЧЕСКАЯ ИММУНОЛОГИЯ И ИММУНОПАТОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016
УДК 616-001.35-021.6-092:612.017.1]-078.33-092.9
Саидов М.З., Далгатова А.А., Израилова Г.Р., Курбанов К.З.
ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ КОРРЕЛЯЦИОННЫХ СВЯЗЕЙ ПОКАЗАТЕЛЕЙ АДАПТИВНОГО ИММУНИТЕТА ПРИ СИНДРОМЕ ДЛИТЕЛЬНОГО СДАВЛЕНИЯ
Дагестанская государственная медицинская академия, 367000, г Махачкала
Изучение корреляционных связей между показателями адаптивного иммунитета, уровнем сывороточного кортизо-ла и количеством лимфоцитов в крови и органах иммунной системы позволяет полнее представить иммунопатоге-нез синдрома длительного сдавления (СДС).
Цель исследования — оценить патогенетическое значение корреляционных связей показателей адаптивного иммунитета, кортизолом и количество лимфоцитов в крови и в органах иммунной системы на экспериментальной модели СДС различной степени тяжести.
Модель СДС воспроизводили у крыс путем наложения металлических тисков с площадью сдавливающей поверхности 5—6 см2. Тиски накладывали на 2; 4 и 6 ч на задние лапки под тиопенталовым наркозом и тем самым воспроизводили I, II и III степени тяжести СДС.
Иммунопатогенетическая интерпретация достоверных корреляционных связей между показателями адаптивного иммунитета при СДС I, II и III степени тяжести позволила обосновать положения, согласно которым процесс рабдомиоли-за сопровождается существенной активацией Т-лимфоцитов с сопутствующей гиперпродукцией провоспалительных цитокинов ТНФа, IL-6 и ИФ-у этими клетками и признаками системного воспаления. В-клетки не принимают прямого участия в этом звене. Гиперкортизолемия, достигающая своего пика при III степени тяжести СДС, прямо связана с увеличением сывороточного уровня ТНФа и ИФ-у. На фоне максимального эндотоксикоза при рабдомиолизе определяется реактивное перераспределение клеток иммунной системы, выражающееся: в абсолютной и относительной лимфоцитопении; накоплении В-лимфоцитов в селезенке; увеличении активированных Т-лимфоцитов, продуцентов ИФ-у, в региональных лимфатических узлах при сдавливании нижних лапок крыс; резком увеличении плотности лимфоцитов в пейеровых бляшках при всех степенях тяжести СДС. Но абсолютная и относительная лимфоцитопения при СДС сопровождается увеличением количества циркулирующих активированных лимфоцитов, а увеличение плотности лимфоцитов в пейеровых бляшках происходит также за счет клеток, активно продуцирующих ТНФа, ИФ-у и IL-6.
Ключевые слова: синдром длительного сдавления; корреляционные связи; лимфоциты; кортизол; растворимые
CD3G и CD19; провоспалительные цитокины; ТНФа; IL-6, ИФ-у. Для цитирования: Саидов М.З., Далгатова А.А., Израилова Г.Р., Курбанов К.З. Патогенетическое значение корреляционных связей показателей адаптивного иммунитета при синдроме длительного сдавления. Иммунология. 2016; 37(6): DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-6-331-336
Для корреспонденции: Саидов Марат Зиявдинович, д-р мед. наук, проф., зав. кафедрой патофизиологии Даггосмедакадемии, E-mail: [email protected]
оригинальные статьи
Saidov M.Z., Dalgatova A.A., Izrailova G.R., Kurbanov K.Z.
PATHOGENETIC SIGNIFICANCE OF CORRELATION BETWEEN FIGURE OF ADAPTIVE IMMUNE SYSTEM IN CRUSH SYNDROME
Dagestan State Medical Academy, 367000, Makhachkala
The study of correlations between indicators of adaptive immunity, the level of serum Cortisol and the number of lymphocytes in the blood and organs of the immune system and allows you to better represent the immunopathogenesis of crush syndrome (SDS).
The purpose of the study is to assess the pathogenetic significance of correlations of indicators of adaptive immunity, cortisol and the number of lymphocytes in the blood and in the organs of the immune system in an experimental model of SDS of varying severity.
The SDS model was reproduced in rats by applying the metal vise with the area of compressive surface 5—6 cm2. The grip imposed on 2, 4 and 6 hours for hind legs under anesthesia tiopentalom and thereby reproduced I, II and III degree of severity of SDS.
Immunopathogenetic reliable interpretation of correlation between indices of adaptive immunity in SDS I, II and III degree of severity made it possible to prove the conditions under which the process of rhabdomyolysis accompanied by a significant activation of T-lymphocytes with its hyperproduction of proinflammatory cytokines TNF-a, IL-6 and IF-y by these cells and signs of systemic inflammation. B cells do not participate directly in this link. Hypercortisolemia, reaching its peak at III severity of SDS, is directly related to the increase in serum level of TNF-a and IF-y. Amid maximum of endotoxemia with rhabdomyolysis jet is determined by the redistribution of immune cells, expressed in absolute and relative lymphocytopenia; the accumulation of b lymphocytes in the spleen; increase in activated T-lymphocytes, producers of IF-y in regional lymph nodes by squeezing the lower legs of the rats; a sharp increase in the density of lymphocytes in Peyer's patches in all degrees of severity of SDS. But absolute and relative lymphocytopenia when SDS is accompanied by an increase in the number of circulating activated lymphocytes and an increase in the density of lymphocytes in Peyer's patches occurs also due to cells actively producing TNF-a, IF-y and IL-6.
Keywords: crush syndrome; correlation; lymphocytes; cortisol; soluble CD3G and CD19; proinflammatory cytokines; TNF-a; IL-6, IF-y.
For citation: Saidov M.Z., Dalgatova A.A., Izrailova G.R., Kurbanov K.Z. Pathogenetic significance of correlation between figure of adaptive immune system in crush syndrome. Immunologiya. 2016; 37(6): 331-336. DOI: 10.18821/0206-4952-201637-6-331-336
For correspondence: Saidov Marat Ziyavdinovich, Dr med. Sci., prof., head of the Department of physiology, Dagestan state medical Academy, E-mail: [email protected].
conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Acknowledgments. The study had no sponsorship.
Received 13.05.16 Accepted 07.06.16
Синдром длительного сдавления (СДС, краш-синдром травматический рабдомиолиз) занимает важное место в общей структуре травматизма, поскольку техногенные и геологические катастрофы сопряжены с увеличением случаев сдавливания мягких тканей, прежде всего поперечнополосатых мышц [1]. В основе СДС лежит сильное длительное сдавливание конечностей, ведущее к прекращению кровотока и ишемии тканей. Формирование патофизиологической картины СДС происходит после реперфузии тканей на этапе извлечения пострадавших из-под завалов и характеризуется крайним разнообразием и выраженной тяжестью патологических процессов и состояний. Среди них ведущее место занимают тяжелый генерализованный эндотоксикоз вследствие массивного попадания в кровоток продуктов раб-домиолиза и прежде всего миоглобина, плазмопотеря, болевой шок и полиорганная недостаточность с ведущей ролью острой почечной недостаточности [1, 2]. Патогенетическим базисом СДС служит эндогенная интоксикация продуктами ишемии и реперфузии тканей. Реперфузионная токсемия представлена гипермиоглобулинемией, гиперкалиемией, метаболическим ацидозом, попаданием в кровоток продуктов распада белков, жиров и углеводов, превращением миогло-бина в солянокислый гематин. Последний служит основной причиной развития острой почечной недостаточной при СДС [3]. Кроме этого, хорошо документировано развитие у пострадавших при тяжелых формах СДС синдрома диссемини-рованного внутрисосудистого свертывания, респираторного дистресс-синдрома, воспаления, острой гиповолемии с гемо-концентрацией и с угрозой формирования гиповолемичесого шока, постишемического отека тканей [1, 4].
Безусловно, столь разнообразные тяжелые патологические процессы при СДС оказывают непосредственное воздействие на иммунную систему, что оказывается причиной
выделения важного патогенетического звена СДС, а именно иммунопатогенеза. Показано, что продукты распада тканей, травматическая токсемия, а также микробные антигены активируют клетки иммунной системы, что сопровождается существенным увеличением уровня сывороточных про-воспалительных цитокинов (ГЬ-1, ГЬ-6, ТНФа), активацией клеток макрофагально-моноцитарного ряда, сопряженной с увеличением продукции микробицидной миелопероксидазы (МПО), активацией CD3+CD4+ и CD3+CD8+-клеток [5—7]. Ги-пермиоглобулинемия на этапе реваскуляризации сдавленных тканей сопровождается индукцией патогенетически значимого ответа системы адаптивного иммунитета на этот антиген [2]. Крайне важны результаты исследований экспрессии TLR-рецепторов на клетках врожденного иммунитета (дендритных клетках, макрофагах, естественных киллерах) при СДС. Показано, что при СДС происходит селективная экспрессия TLR2-, TLR4- и TLR9-рецепторов. Эта экспрессия сопряжена с достоверным увеличением пролиферативной активности спленоцитов и продукцией провоспалительных цитокинов (ГЬ-1, ТНФа), Th1+CD4+ субпопуляцией лимфоцитов [8—10]. Эти и другие данные важны с той точки зрения, что индукция антиген-специфического иммунного ответа и продукции провоспалительных цитокинов при СДС возможна при условии активации клеток врожденного иммунитета через упомянутые TLR-рецепторы. Очевидно, что система адаптивного и врожденного иммунитета — важный компонент патогенеза СДС.
Однако интерпретация имеющихся данных об изменениях параметров иммунной системы позволяет оценить колебания показателей в зависимости от степени тяжести и периода развития СДС. Безусловно, иммунопатогенетическая оценка этого тяжелого состояния будет намного полнее при одновременном анализе достоверных корреляционных связей
изученных показателей. Известно, что патофизиологический анализ не может быть достаточно полноценным без учета взаимосвязей и патогенетической интерпретации показателей всех органов и систем организма, в том числе и системы иммунитета. В медицине наиболее удобный метод оценки взаимосвязей — это корреляционный анализ. И хотя известно, что наличие достоверных корреляционных связей еще не доказательство причинно-следственных взаимоотношений, тем не менее их наличие позволяет сделать предварительные выводы о некоторых патофизиологических закономерностях изучаемых явлений [11].
В предыдущей работе на экспериментальной модели СДС мы показали патогенетически важные изменения системы адаптивного иммунитета, выражающиеся в относительной и абсолютной лимфоцитопении, реактивном перераспределении мононуклеаров периферической крови в органах иммунной системы, гиперпродукции провоспалительных цитокинов — ТНФа, ИФ-у, IL-6 и кортизола, увеличении сывороточных уровней растворимых CD3G и CD19. Эти изменения претерпевали этапность в соответствии со степенью тяжести СДС и происходили на фоне несомненных признаков системного воспаления как ответа на эндотоксикоз продуктами рабдомиолиза, достигающего своего максимума на этапе реваскуляризации мышечной ткани. Очевидно, что изучение корреляций между изученными показателями существенно дополнит картину иммунопатогенеза СДС и позволит обосновать рекомендации по применению иммунотропной терапии пострадавших от СДС.
Цель настоящей работы — оценка патогенетического значения корреляционных связей показателей адаптивного иммунитета с кортизолом и количеством лимфоцитов в крови и в органах иммунной системы на экспериментальной модели СДС различной степени тяжести.
Материал и методы
Эксперименты проведены на крысах-самцах линии Вистар в возрасте 8—12 мес массой 150—180 г Животных содержали в стандартных условиях и диете в виварии кафедры патофизиологии ДГМА. Работу с животными проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных. Приложения № 1, 2, 3, 4».
Модель СДС воспроизводили у крыс путем наложения металлических тисков с площадью сдавливающей поверхности 5—6 см2. Тиски накладывали на 2, 4 и 6 ч на задние лапки под тиопенталовым наркозом (0,2—0,3 мл 10% раствора тиопентала на одну особь). При этом сила сдавливания была максимальной, но не нарушающей целостность костей нижних конечностей. Такая модель общепринята и позволяет точно воспроизводить степень компрессионной травмы. Животных выводили из эксперимента путем декапитации под наркозом с последующим забором крови в пробирку с антикоагулянтом и органов системы иммунитета — тимуса, селезенки, пейеровых бляшек и региональных лимфатических узлов.
Экспериментальные животные были разделены на 3 группы: 1-я группа крыс (n = 15) с СДС легкой степени (I степень тяжести), время сдавливания — 2 ч; 2-я группа крыс (n = 15) с СДС средней степени (II степень тяжести), время сдавливания — 4 ч; 3 группа крыс (n = 15) с СДС тяжелой степени (III степень тяжести), время сдавливания — 6 ч, и контрольная группа крыс (n = 10).
После сепарации органов системы иммунитета материал фиксировали в 10% нейтральном формалине в течение 24 ч. Затем кусочки ткани подвергали спиртовой дегидратации, пропитывали в горячем парафине и заливали в блоки. С блоков готовили 4 мкм гистологические срезы и после депарафинизации окрашивали гематоксилин-эозином. Все полученные препараты были подвергнуты морфометрии. Морфометрические показатели определяли путем подсчета
original article
количества нейтрофилов, лимфоцитов и эозинофилов в нескольких полях зрения при ув. 400 с выведением средней арифметической. Для подсчета выбирались наиболее типичные для данного препарата поля зрения.
Подсчет общего количества лейкоцитов проводили с применением стандартной методики, согласно которой после лизиса эритроцитов 3% раствором уксусной кислоты и разведения полученной клеточной взвеси 1:20 подсчитывали абсолютное число клеток в камере Горяева. Относительный уровень нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов и эозинофи-лов в периферической крови крыс подсчитывали на мазках крови после их окрашивания по Романовскому—Гимза при ув. 400.
Уровень CD3G в сыворотке крови определяли методом твердофазного ИФА на наборах Rat T-cell surface glycoprotein CD3 gamma chain ELISA Kit компании CUSABIO, кат. № CSB-EL004933RA.
Сывороточный уровень CD19 определяли на наборах твердофазного ИФА Rat cluster of differentiation 19 (CD19) ELISA Kit компании CUSABIO, кат. № CSB-E14095e
Уровень кортизола в сыворотке крови определяли на наборах твердофазного ИФА Rat cortisol ELISA Kit компании CUSABIO, кат. № CSB-E05112r Результаты анализов CD3G, CD19 и кортизола замеряли на многоканальном спектрофотометре Stat Fax 2600, AWRENESS, Technology Inc. USA в двухволновом режиме, основной фильтр — 450 нм, референс-фильтр — 540 или 570 нм, они выражались в нг/мл.
Сывороточный уровень ТНФа определяли на наборах твердофазного ИФА Rat TNF-а ELISA Kit компании CUSABIO, кат. № CSB-E11987r
Сывороточный уровень ИФ-у определяли на наборах твердофазного ИФА Rat Interferon г (IFN-y) ELISA Kit компании CUSABIO, кат. № CSB-E04579r
Сывороточный уровень IL-6 определяли на наборах твердофазного ИФА Rat Interleukin 6 (IL-6) ELISA Kit компании CUSABIO, кат. № CSB-E04640r Результаты анализов ТНФа, ИФ-у и IL-6 замеряли на многоканальном спектрофотометре Stat Fax 2600, AWRENESS, Technology Inc. USA в двухволновом режиме, основной фильтр — 450 нм, референс-фильтр — 540 или 570 нм, они выражались в пг/мл.
Обработку данных проводили с помощью статистического пакета Statistica (версия 6.0), а также Biostat 4.03. Базу данных создавали с использованием редактора электронных таблиц Microsoft Excel 2007. Непрерывные переменные в исследуемых выборках представлены в виде медианы (Ме) с 25-м, 75-м процентилями. Для определения достоверности различий между двумя сравниваемыми выборками использовали критерий Манна—Уитни. Корреляционную взаимосвязь между изученными параметрами определяли с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена (г). В случаях, когда г равнялся от ± 0,7 до ± 1, связь определяли как сильную, когда г равнялся от ± 0,3 до ± 0,7 как среднюю и при значении г от 0 до ± 0,3 как слабую, г с положительным знаком — прямая связь, г с отрицательным — обратная. Различия считали статистически достоверными при уровне значимости р < 0,05.
Результаты и обсуждение
Как было сказано выше, в предыдущей работе мы показали статистически достоверное увеличение растворимых CD3G, CD19 и сывороточного ТНФа при всех степенях тяжести СДС, а ИФ-у и IL-6 при I степени тяжести СДС. Эти изменения происходили на фоне выраженной гиперкортизолемии и абсолютной лимфоцитопении. Степень инфильтрации лимфоцитами органов иммунной системы при СДС варьировала, обнаруживая тенденцию к снижению клеточной плотности по мере увеличения степени тяжести СДС, но плотность лимфоцитов при всех степенях тяжести СДС достоверно превышала аналогичный показатель в контрольной группе.
оригинальные статьи
Корреляционные связи и уровни растворимых CD3G, CD19 и ТНФа при СДС I, II и III степени тяжести
Таблица 1
Показатель CD3G, нг/мл ТНФа, пг/мл r CD19, нг/мл ТНФа, пг/мл r
I степень СДС, n = 15 0,4 (0,2; 0,5)* 0,73 (0,3; 1,5)* 0,623, p = 0,014 0,32 (0,2; 0,38)* 0,73 (0,3; 1,5)* -0,103, p = 0,705
II степень СДС, n = 15 0,5 (0,45; 0,8)* 0,9 (0,5; 1,7)** 0,547, p = 0,036 0,3 (0,26; 0,4)** 0,9 (0,5; 1,7)** 0,052, p = 0,842
III степень СДС, n = 15 0,5 (0,2; 0,55)* 1,23 (0,5; 1,6)* 0,802, p = 0,000 0,3 (0,28; 0,34)** 1,23 (0,5; 1,6)* 0,231, p = 0,434
Контроль, n = 10 0,25 (0,2; 0,3) 0,2 (0,14; 0,3) -0,524, p = 0,079 0,16 (0,1; 0,2) 0,2 (0,14; 0,3) -0,007, p = 0,974
r — коэффициент ранговой корреляции Спирмена (здесь и далее); показатели CD3 G, CD19 и ТНФ-Р представлены в виде Me (25-й;75-й про-центили); *p < 0,05, **p < 0,01 по сравнению с контрольной группой (t-критерий Манна—Уитни).
Корреляционный анализ проведен между следующими блоками данных: связь между показателями клеточного адаптивного иммунитета с провоспалительными цитокинами; связь между количеством лимфоцитов в крови с показателями клеточного адаптивного иммунитета и провоспалительными цитокинами; связь между плотностью лимфоцитов в органах системы иммунитета с показателями клеточного адаптивного иммунитета и провоспалительными цитокина-ми, и все это в зависимости от степени тяжести СДС.
Патогенетическая интерпретация проведена с учетом, во-первых, статистической достоверности коэффициента корреляции, во-вторых, силы и знака коэффициента корреляции и, в-третьих, появления новых по сравнению с контрольной группой достоверных корреляционных связей.
В табл. 1 представлены результаты оценки корреляционных связей между уровнями растворимых CD3G, CD19 и ТНФа при СДС Г, II и III степени тяжести. Для наглядности помимо коэффициентов корреляции в этой и следующих таблицах указаны количественные уровни изученных показателей.
Видно, что достоверные положительные сильные корреляционные связи прослеживаются между CD3G и ТНФа при СДС I, II и III степени тяжести. В контрольной группе эта связь не определяется. Очевидно, что при СДС активация Т-лимфоцитов, продуцентов ТНФа, тесно сопряжена с сывороточным уровнем этого цитокина. Напротив, отсутствие достоверных связей между CD19 и ТНФа не позволяет предположить патогенетическое участие активированных В-лимфоцитов в гиперпродукции ТНФа при СДС. Таким образом, достоверное увеличение сывороточного уровня ТНФ при СДС можно отнести на счет гиперпродукции этого цито-
кина активированными Т-лимфоцитами, но не B-клетками.
В табл. 2 представлены результаты аналогичного корреляционного анализа, но по отношению к IL-6.
И в этом случае видно, что достоверные положительные средней силы коэффициенты корреляции определяются между растворимыми CD3G и сывороточными уровнями IL-6 (в контроле этой зависимости нет). Одновременно между уровнем CD19 и IL-6 прослеживается достоверная корреляционная связь на фоне достоверного увеличения количественных показателей CD19 и IL-6 при I степени СДС. Однако наличие аналогичной связи в контрольной группе крыс не позволяет сделать вывод о патогенетической роли активированных В-лимфоцитов в гиперпродукции IL-6 при СДС. Очевидно, что основной источник IL-6 при СДС — это активированные Т-лимфоциты.
В табл. 3 представлены результаты оценки корреляционных связей между растворимыми CD3G, CD19 и ИФ-у.
Картина совершенно иная. Видно, что достоверная положительная средней силы корреляционная связь определяется между CD3G и ИФ-у в единственном случае — при III степени СДС. Вероятно, подобная связь может прослеживаться только на фоне максимального эндотоксикоза при рабдомиолизе, который достигается при III степени тяжести СДС. CD19 и в этом случае не имеют достоверных корреляционных связей с сывороточным уровнем ИФ-у, поэтому нет оснований для предположения о патогенетическом участии активированных В-лимфоцитов в гиперпродукции ИФ-у при СДС.
Как известно, компрессионная травма сопровождается развитием всех признаков стресс-реакции. Один из важнейших признаков — резкое увеличение гормонов коры
Таблица 2
Корреляционные связи и уровни растворимых CD3G, CD19 и IL-6 при СДС I, II и III степени тяжести
Показатель CD3G, нг/мл IL-6, пг/мл r CD19, нг/мл IL-6, пг/мл r
I степень СДС, n = 15 0,4 (0,2; 0,5)* 3,4 (2,4; 4,2)* 0,571, p = 0,027 0,32 (0,2; 0,38)* 3,4 (2,4; 4,2)* 0,585, p = 0,023
II степень СДС, n = 15 0,5 (0,45; 0,8)* 3,2 (1,7; 3,5) 0,548, p = 0,036 0,3 (0,26; 0,4)** 3,2 (1,7; 3,5) 0,295, p = 0,342
III степень СДС, n = 15 0,5 (0,2; 0,55)* 2,6 (2,4; 3,4) 0,544, p = 0,038 0,3 (0,28; 0,34)** 2,6 (2,4; 3,4) 0,132, p = 0,630
Контроль, n = 10 0,25 (0,2; 0,3) 2,3 (1,8; 2,8) -0,049, p = 0,869 0,16 (0,1; 0,2) 2,3 (1,8; 2,8) 0,776, p = 0,004
Примечание. Показатели CD3G, CD19 и ТНФа представлены в виде Me (25-й; 75-й процентили).
Таблица 3
Корреляционные связи и уровни растворимых CD3G, CD19 и ИФ-у при СДС I, II и III степени тяжести
Показатель CD3G, нг/мл ИФ-у, пг/мл r CD19, нг/мл ИФ-у, пг/мл r
I степень СДС, n = 15 0,4 (0,2; 0,5)* 0,97 (0,8; 1,2)* 0,162, p = 0,558 0,32 (0,2; 0,38)* 0,97 (0,8; 1,2)* 0,262, p = 0,314
II степень СДС, n = 15 0,5 (0,45; 0,8)* 0,8 (0,6; 1,1) 0,386, p = 0,189 0,3 (0,26; 0,4)** 0,8 (0,6; 1,1) 0,115, p = 0,796
III степень СДС, n = 15 0,5 (0,2; 0,55)* 0,75 (0,5; 1,1) 0,650, p 0,01 0,3 (0,28; 0,34)** 0,75 (0,5; 1,1) 0,396, p = 0,141
Контроль, n = 10 0,25 (0,2; 0,3) 0,7 (0,5; 0,9) -0,329, p 0287 0,16 (0,1; 0,2) 0,7 (0,5; 0,9) 0,552, p = 0,063
Примечание. Показатели CD3G, СЭ19 и ИФ-г представлены в виде Ме (25; 75 процентили); *р < 0,05, **р < 0,01 по сравнению с контрольной группой (Т-критерий Манна—Уитни).
original article
Таблица 4
Корреляционные связи между уровнем сывороточного кортизола и растворимыми CD3G и CD19, а также ТНФ-а, IL-6 и ИФ-у при СДС I, II и III степени тяжести
Показатель CD3G, нг/мл CD19, нг/мл ТНФ a, пг/мл IL-6, пг/мл ИФ y, пг/мл
I степень СДС, n = 15 Кортизол, нг/мл r = -0,046 r = 0,058 r = 0,595 r = -0,348 r = 0,264
p = 0,863 p = 0,832 p = 0,02 p = 0,196 p = 0,333
II степень СДС, n = 15 Кортизол, нг/мл r = -0,097 r = -0,273 r = 0,054 r = -0,112 r = 0,522
p = 0,724 p = 0,32 p = 0,842 p = 0,716 p = 0,05
III степень СДС, n = 15 Кортизол, нг/мл r = 0,353 r = 0,068 r = 0,526 r = 0,275 r = 0,018
p = 0,192 p = 0,802 p = 0,045 p = 0,314 p = 0,507
Контроль, n = 10 Кортизол, нг/мл r = -0,469 r = 0,441 r = 0,273 r = 0,441 r = 0,161
p = 0,121 p= 0,147 p = 0,379 p = 0,147 p = 0,604
надпочечников, в частности кортизола. С учетом непосредственных эффектов кортикостероидов на функциональную активность клеток иммунной системы (индукция апоптоза, лимфоцитопения, вторичный иммунодефицит) весьма интересно было оценить корреляционные связи между уровнем сывороточного кортизола и растворимыми CD3G и CD19, а также ТНФа, ГЬ-6 и ИФ-у при СДС I, II и III степени тяжести. Результаты представлены в табл. 4.
Из данных таблицы видно, что достоверных корреляций между сывороточным уровнем кортизола и уровнем растворимых CD3G и CD19 не наблюдается. Ничего удивительного в этом факте нет, поскольку уровень растворимых CD3G и CD19 отражает степень активированности Т- и В-лимфоцитов, а кортизол подавляет пролиферативную активность и функциональную деятельность лимфоцитов. Совместить указанные противоположные процессы затруднительно, но объяснить отсутствие корреляционных связей вполне возможно. Помимо этого необходимо учитывать известное явление стероид-опосредованного апоптоза лимфоцитов. В наших исследованиях лимфоцитопению, сопутствующую всем степеням тяжести СДС, можно объяснить именно этим процессом. Что же касается провоспалитель-ных цитокинов, то достоверные положительные средней силы связи определяются между уровнем сывороточных кортизола и ТНФ-а при I и III степени тяжести СДС, а также с уровнем ИФ-у при II степени тяжести СДС. Наличие положительного знака г свидетельствует об однонаправленной связи между этими показателями, т. е. увеличению концентрации кортизола сопутствует увеличение уровня ТНФ-а и ИФ-у в сыворотке крови. Наличие подобных связей позволяет констатировать патофизиологический парадокс, а именно: при компрессионной травме одновременно сосуществуют экстремально повышенный сывороточный уровень кортизо-ла как результата стресс-реакции и достоверное повышение провоспалительных цитокинов в циркуляции, причем последний факт сочетается с несомненными признаками си-
стемного воспаления, присутствующими при всех степенях тяжести и периодах развития СДС [7].
Не менее интересно было изучить состояние корреляций между количеством лимфоцитов периферической крови и изученными показателями адаптивного иммунитета. Результаты представлены в табл. 5.
И в этом случае достоверные связи оказались немногочисленными. С точки зрения иммунопатогенеза СДС вполне объяснимо наличие достоверных положительных средней силы корреляционных связей между абсолютным количеством лимфоцитов в периферической крови и растворимыми CD19 и ИФ-у. Очевидно, что количественный уровень и CD19, и ИФ-у в сыворотке крови зависит соответственно от количества активированных лимфоцитов. Несмотря на лим-фоцитопению при СДС, оставшиеся клетки, активируясь, продуцируют те уровни растворимых факторов, которые и определены в наших исследованиях. Парадоксально выглядит корреляционная связь между количеством лимфоцитов и ТНФ-а, г = -0,453, р = 0,05. Согласно знаку коэффициента корреляции, уменьшение количества лимфоцитов в периферической крови должно сочетаться с увеличением сывороточного уровня ТНФ-а. С точки зрения причинно-следственных отношений объяснить этот факт только активностью лимфоцитов затруднительно. Вероятно, в нашем случае ответственность за гиперпродукцию ТНФ-а при СДС несут и клетки макрофагально-моноцитарного ряда, которые также служат источником провоспалительных цитокинов.
Логическим продолжением этого этапа работы была оценка корреляций между плотностью лимфоцитов в органах иммунной системы с растворимыми CD3G, CD19, уровнем провос-палительных цитокинов и количеством лимфоцитов в крови. Достоверных корреляционных связей оказалось немного, и все они отражены в табл. 6.
Наибольшее количество достоверных связей отмечают между плотностью лимфоцитов в пейеровых бляшках с ТНФ-а, ИФ-у, ГЬ-6 и количеством лимфоцитов перифериче-
Таблица 5
Корреляционные связи между количеством лимфоцитов периферической крови и растворимыми CD3G, CD19, ТНФ-а, IL-6 и ИФ-у при СДС I, II и III степени тяжести
Показатель CD3G, нг/мл CD19, нг/мл ТНФ -a, пг/мл IL-6, пг/мл ИФ- Y, пг/мл
I степень СДС, n = 15 Лимфоциты, r = 0,042 r = -0,507 r = -0,453 r = 0,346 r = -0,346
тыс./мкл p = 0,878 p = 0,033 p = 0,05 p = 0,158 p = 0,158
II степень СДС, n = 15 Лимфоциты, r = -0,158 r = -0,258 r = -0,167 r = -0,136, r = 0,209
тыс./мкл p = 0,657 p = 0,448 p = 0,632 p = 0,682 p = 0,527
III степень СДС, n = 15 Лимфоциты, r = 0,436 r = -0,058 r = 0,327 r = 0,286 r = 0,450
тыс./мкл p = 0,191 p = 0,863 p = 0,349 p = 0,074 p = 0,047
Контроль, n = 10 Лимфоциты, r = 0,179 r = 0,024 r = 0,133 r = 0,158 r = 0,039
тыс./мкл p = 0,608 p = 0,946 p = 0,682 p = 0,657 p = 0,919
оригинальные статьи
Таблица 6
Корреляционные связи между плотностью лимфоцитов в органах иммунной системы с растворимыми CD3G, CD19, уровнем провоспалительных цитоки-нов и количеством лимфоцитов в крови при СДС I, II и III степени тяжести
I степень СДС, n = 15
II степень СДС, n = 15
III степень СДС, n = 15
П. б. —
ТНФ-а, r = 0,571, p = 0,05
С. — CD19 r = 0,516 р = 0,05
П.б. — лимфоциты крови r = -0,633 р = 0,003
Л. у. — ИФ-у r = 0,702 p = 0,004
П. б. — IL-6 r = -0,671 р = 0,019
Т — лимфоциты крови r = -0,513 р = 0,022
Л. у. — ИФ-Y r = -0,534, р = 0,05
П. б. — ИФ-y r = 0,597 р = 0,05
Контроль, n = 10
Л. у. — CD19 r = 0,55 р = 0,006
Т. — CD19 r = -0,580 р = 0,049
. б. — ТНФ-а r = 0,664 р = 0,02
П р и м е ч а н и е . Л. лезенка; Т — тимус.
у. — лимфатические узлы; П. б. — пейеровы бляшки; С — се
ской крови. Однако характер этих связей разнородный. Положительная связь средней силы определяется между плотностью лимфоцитов в пейеровых бляшках с уровнем ТНФ-а и ИФ-а, что вполне логично, поскольку лимфоциты служат в том числе продуцентами этих цитокинов. С ТЬ-6 связь обратная. Парадоксально выглядит достоверная отрицательная связь средней силы между плотностью лимфоцитов в пейе-ровых бляшках и количеством циркулирующих лимфоцитов. Вероятно, увеличение плотности лимфоцитов в пейеровых бляшках при СДС III степени тяжести — следствие перераспределения этих клеток из циркуляции в пользу тканевого местоположения.
Положительная достоверная связь средней силы обнаруживается между плотностью лимфоцитов в селезенке и уровнем растворимых CD19 при СДС II степени тяжести, иными словами, увеличение клеточной плотности в селезенке происходит в том числе и за счет активированных В-клеток. Обращает на себя внимание наличие сильной положительной связи между плотностью лимфоцитов в региональных лимфатических узлах и уровнем ИФ-у в сыворотке крови (г = 0,702, р = 0,004) при СДС I степени тяжести. Очевидно, активированные лимфоциты, продуценты ИФ-у, скапливаются в региональных лимфоузлах при сдавливании нижних лапок крыс. Подобное реактивное перераспределение лимфоцитов служит одним из признаков реакции системы иммунитета на сывороточные продукты начальных этапов рабдомиолиза. Нельзя не обратить внимание на интересный факт — наличие отрицательной достоверной корреляционной связи (г = -0,580, р = 0,049) между клеточной плотностью лимфоцитов в тимусе и уровнем сывороточных CD19 в контроле, что подтверждает известное явление — территория тимуса служит местом созревания и дифференцировки Т-лимфоцитов.
Таким образом, патогенетическая интерпретация достоверных корреляционных связей между показателями адаптивного иммунитета при СДС I, II и III степени тяжести позволила обосновать положения, согласно которым процесс рабдомиолиза сопровождается существенной активацией Т-лимфоцитов с сопутствующей гиперпродукцией провоспа-лительных цитокинов ТНФ-а, ТЬ-6 и ИФ-у этими клетками и признаками системного воспаления. В-клетки не принимают прямого участия в этом звене патогенеза. Гиперкортизоле-мия, достигающая своего пика при III степени тяжести СДС, прямо связана с увеличением сывороточного уровня ТНФ-а и ИФ-у. На фоне максимального эндотоксикоза при рабдомио-лизе определяется реактивное перераспределение клеток им-
мунной системы, выражающееся в абсолютной и относительной лимфоцитопении накоплении В-лимфоцитов в селезенке, увеличении активированных Т-лимфоцитов, продуцентов ИФ-у, в региональных лимфатических узлах при сдавливании нижних лапок крыс; резком увеличении плотности лимфоцитов в пейеровых бляшках при всех степенях тяжести СДС. Но абсолютная и относительная лимфоцитопения при СДС сопровождается увеличением количества циркулирующих активированных лимфоцитов, а увеличение плотности лимфоцитов в пейеровых бляшках происходит также за счет клеток, активно продуцирующих ТНФ-а, ИФ-у и ТЬ-6.
Очевидно, что изучение иммунопатогенеза СДС — перспективное направление, поскольку знание этих механизмов позволит обосновать применение средств селективной иммунокор-рекции и тем самым повысить клиническую эффективность комплексного лечения пострадавших на всех этапах развития СДС.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
литература
11.
Гуманенко Е.К. Военно-полевая хирургия. М.: 2004; 177—86. Мизиев И.А., Махов М.Х., Жигунов А.К. и др. Индивидуальный прогноз острого повреждения почек у больных с сочетанной травмой. Медицина катастроф. 2014; 88(4): 18—20. Власов В.В. Эпидемиология. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2006: 272—6.
references
1. Gumanenko E.K. Military Surgery. [Voenno-polevaya khirurgiya]. Moscow; 2004: 177—87. (in Russian)
2. Zimmerman J.L., Shen M.C. Rhabdomyolysis. Chest. 2013; 144(3): 1058—65.
3. Miziev I.A., Makhov M.Kh., Zhigunov A.K. et al. Personal prognosis of acute kidney injury in patients with concomitant trauma. Med-itsina katastrof. 2014; 88(4): 18—20. (in Russian)
4. Manson J., Thiemermann C., Brohi K. Trauma alarmins as activators of damage-induced inflammation. Br. J. Surg. 2012; 99(Suppl. 1): 12—20.
5. Flohe S.B., Flohe S., Schade F.U. Invited review: deterioration of the immune system after trauma: signals and cellular mechanisms. Innate Immun. 2008; 14(6): 333—44.
6. Stoecklein V.M., Osuka A., Lederer J.A. Trauma equals danger — damage control by the immune system. J. Leukoc. Biol. 2012; 92(3): 539—51.
7. Menzel C.L., Pfeifer R., Darwiche S.S. et al. Models of lower extremity damage in mice: time course of organ damage (crush-syn-drom) and immune response. J. Surg. Res. 2011; 166(2): 149—56.
8. Darwiche S., Ruan X., Hoffman M.K. Selective roles for Toll-like receptors 2, 4 and 9 in the systemic inflammation and immune dysfunction following peripheral tissue injury. J. Trauma Acute Care Surg. 2013; 74(6): 1454—61.
9. Yang H., Hreggvidsdottir H.S., Palmblad K. et al. A critical cysteine is required for HMGB1 binding to Toll-like receptor 4 and activation of macrophage cytokine release. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010; 107(26): 11942—7.
10. Levy R.M., Prince J.M., Yang R. et al. Systemic inflammation and remote organ damage following bilateral femur fracture requires Toll-like receptor 4. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2006; 291(4): 970—6.
11. Vlasov V.V. Epidemiology. [Epidemiologiya]. Moscow: GEOTAR-Media; 2006; 272—6. (in Russian)
Поступила 13.05.16 Принята в печать 16.08.16
