CC BY
51
ISSN 0202-5493. МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 1 (146-147), 2011
ПАСПОРТИЗАЦИЯ ПО МИКРОСАТЕЛЛИТНЫМ ЛОКУСАМ ГЕНОТИПОВ ПОДСОЛНЕЧНИКА -ДИФФЕРЕНЦИАТОРОВ УСТОЙЧИВОСТИ К ЗАРАЗИХЕ
С.З. Гучетль,
кандидат биологических наук
Т.А. Челюстникова,
ст. научный сотрудник
Н.А. Сныга,
студент-дипломник
ГНУ ВНИИМК Россельхозакадемии
Россия, 350038, г. Краснодар, ул. Филатова, д. 17
тел. (861) 275-86-53 e-mail: antonova-ts@maiLru
Ключевые слова: подсолнечник, дифференциаторы, заразиха, устойчивость, ПЦР, микроса-теллитные маркеры, паспортизация
УДК 633.854.78:591.151:543.9
Подсолнечник является основной масличной культурой, как в нашей стране, так и во всем мире. В последние годы в мировой прак-
тике ограничивающим фактором его возделывания стал высокий уровень поражения обли-гатным паразитом - заразихой (ОтоЪапске ситапа WaПr.). Многообещающим способом борьбы с заразихой считается использование гербицидов. Но более надёжным методом борьбы является создание устойчивых сортов и гибридов подсолнечника [1].
Нарушения условий выращивания подсолнечника способствуют распространению физиологических рас заразихи. Начиная с 2006 г., в некоторых регионах России были отмечены районы с высоковирулентными расами заразихи [2]. Таким образом, существует необходимость контроля над новыми расами заразихи в регионах России, где занимаются возделыванием подсолнечника. Для этого необходимо использовать линии-дифференциаторы устойчивости к разным расам заразихи. Первые дифференциаторы, идентифицирующие пять вирулентных групп, названных от А до Е, создали Угапсеапи и др. (1980) [3]. За эти годы вирулентность популяций паразита изменилась. За рубежом выявлены источники устойчивости к заразихе разных рас, используемые в селекционных схемах скрещивания. Мы используем их как дифференциаторы, способствующие идентификации новых рас.
Молекулярно-генетические маркеры позволяют паспортизировать линии-дифференциаторы и осуществлять мониторинг их генетической стабильности. Молекулярный маркер, который сцеплен с геном устойчивости к заразихе, может быть полезным инструментом для маркер-опосредованной селекции, обеспечивая средство для быстрой идентификации желательных индивидов или линий.
Целью нашей работы была паспортизация генотипов подсолнечника - дифференциаторов устойчивости к разным расам заразихи и оценка их генетической выравненности с помощью микросателлитных локусов.
Материалы и методы. В качестве объекта исследования использовали следующие образцы: ВК639 - инбредная линия отдела селекции и семеноводства гибридного подсолнечника ВНИИМК, LC1002 - линия, устойчивая к расе D, LC 1007 и 261 - устойчивая к расе E, LC-1093 - к расе F, 16А*25 - гибридная комбинация, устойчивая к расе G (получены из Румынии от М. Pacureanu-Joita), Р96 - линия, устойчивая к
расе F (получена из Испании от J. Melero-Vara).
ДНК выделяли из выращенных в темноте 57-дневных проростков подсолнечника. Выделение проводили по методу Saghai-Maroof et а1. (1984) [4] с модификациями авторов. Для проведения полимеразной цепной реакции использовали 25 мкл реакционной смеси следующего состава: 67 мМ трис-HCl, рН 8,8; 16,6 мМ сульфата аммония; 1,5-3,0 мМ MgC12; 0,01 % Tween 20; по 0,2 мМ дезоксирибонук-леозидфосфатов; по 10 пМ праймеров; 10 нг матричной ДНК и 1 ед. рекомбинантной термостабильной ДНК полимеразы (Москва, ГОСНИИГЕНЕТИКА). Амплификацию проводили в приборе «Терцик» (ДНК-технология, Россия). Для проведения ПЦР использовали следующий терморежим: начальная денатурация при 96 оС в течение 2 мин, затем 30 циклов при соблюдении температурно-временного режима: денатурация при 94 оС - 30 сек, отжиг при 55-60 оС в течение 40 сек, элонгация -1 мин при 70 оС, финальная элонгация - 2 мин при 72 оС.
Электрофорез продуктов амплификации проводили в агарозном геле (1,5 и 2 % агароза, 1х ТАЕ - буфер) с использованием камеры для горизонтального электрофореза (SE.1, ДНК-технология, Россия) в течение 1-1,5 часов при силе тока 50-58 mA и напряжении 80-100 V. Окрашивание геля производили бромистым этидием. Документирование результатов электрофореза обеспечивалось при помощи гель-документирующей видеосистемы BIO-PRINT (Vilber Lourmat, Франция).
Результаты и обсуждение. По 9-и микро-сателлитным локусам, с уже известными параметрами ПЦР, разделения в электрофоре-тическом геле и наследованием [5; 6], нами были паспортизированы дифференциаторы устойчивости подсолнечника к заразихе, несущие разные гены устойчивости - от Or4 до Or7. Эти гены обеспечивают устойчивость подсолнечника к расам от А до G, поэтому мы ставили цель охарактеризовать их по молеку-лярно-генетическим маркерам. При постановке эксперимента для определения аллельного состояния микросателлитных локусов была использована линия ВК639 с уже известным аллельным состоянием микросателлитных маркеров.
Количество полученных аллелей для различных локусов варьировало от 1 до 3 (таблица), среднее число аллелей на локус составило 1,6 (с учетом мономорфных локусов) и 2,2 (без
учета мономорфных локусов). Этот показатель соответствует количеству аллелей на локус, полученному Гучетль с соавторами (20076) [7]. При изучении коллекции инбредных линий ВНИИМК было определено такое же среднее число аллелей на локус (2,2).
Три локуса из исследованных не показали полиморфизма: Наг432, ORS 6 и HNCA2. Соответственно, данные локусы в этой коллекции не различают генотипы.
Наиболее полиморфным оказался локус ORS5 (рисунок). Исследуемые образцы характеризуются по этому локусу 3-мя аллельны-ми состояниями - a, b, c.
По два аллельных состояния показали локу-сы Har 514, Наг1327, Наг1442, Наг1608. По всем 9-и SSR-локусам получены четкие, характерные для микросателлитов электрофо-ретические спектры, которые хорошо воспроизводились при повторных анализах. Размер фрагментов ДНК составлял от 100 до 250 п.н. При анализе электрофоретических спектров шести образцов выявлена индивидуальность аллельного состава каждого из них. Девять пар праймеров выявили полиморфизм у всех исследованных образцов. Таким образом, установлена возможность использования указанных микросателлитных локусов в качестве маркеров для идентификации дифференциаторов устойчивости к заразихе и составления их молекулярно-генетических паспортов. Кроме того, нами было выявлено, что не все образцы являются гомозиготными. Линия LC 1003 показала гетерозиготный генотип по локусу ORS5, что говорит о её недостаточной вырав-ненности. Более типичным гетерозиготное состояние, выявленное по локусам На^14 и ORS5, является для гибридной комбинации 16А*25. Но, вместе с тем, этот гибрид не является выравненным, так как локусы Нат514 и Нат1442 показывают наличие разных типов аллелей: a и ab по локусу Нат514 и a, 0 по локусу Нат1442.
Таким образом, по 9 микросателлитным ло-кусам нами паспортизировано 6 дифференциаторов подсолнечника, различающихся своей устойчивостью к разным расам заразихи. Установлена уникальность каждого из них.
Таблица — Идентификация дифференциаторов подсолнечника с помощью микросателлитных маркеров
Рисунок - Электрофоретические спектры продуктов амплификации ДНК у дифференциаторов подсолнечника по локусу ORS5. А - a, Ь, с - аллели локуса ORS5; М - маркер молекулярного веса 100 bp
Генотип Раса заразихи Л о к у с
Нат432 Шг514 Нат1327 Нат1442 Нат1608 ORS6 ORS5 IUB6 HNCA2
ВК639 а b а 0 c a c a a
LC1002 D b b a a c a b a a
LC 1003 E b a a a c a bc a a
261 E b b a 0 b a c a a
LC1093 F b a a 0 b a c a a
Р96 F b b b 0 c a a a a
16Ах25 G b a, ab a a, 0 c a ab a a
Список литературы
1. Fernandez-Martinez, J.M. Update on breeding for resistance to sunflower broomrape / J.M. Fernandez-Martinez, Dominguez, J.2, Perez-Vich, B. and Velasco, L. // Helia. - 2008. - № 48. С. 73-84.
2. Антонова, Т.С. Распространение и вирулентность заразихи подсолнечной (Orobanche cumana Wallr.) в Ростовской области / Т.С. Антонова, Г.М. Ситало, Н.М. Арасланова, С.З. Гучетль, С.А. Рамазанова, Т.А. Челюстникова // Масличные культуры: Науч.-техн. бюл. ВНИИМК. - Краснодар, 2009. - Вып. № 1 (140). - С. 31-37.
3. Vranceanu, A.V. Virulence group of Orobanche cumana Wallr., differential hosts and resistance sources and genes in sunflower / A.V. Vranceanu, V.A. Tudor, F.V. Stoenescu, N. Parvu / In Proc. 9th Int. Sunflower Conf., Torremolinos, Spain. 8-13 July 1980. Int. Sunflower Assoc. -Paris. - V.1. - P. 74-82.
4. Saghai-Maroof, M.A. Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: Mendelian in
heritance, chromosomal location, and population dynamics / M.A. Saghai-Maroof, K.M. Soliman, R.A. Jorgensen, R.W. Allard // PNAS USA. -1984.- 81. - P. 8014-8018.
5. Челюстникова, Т.А. Полиморфизм микросателлитных локусов в генотипах культурного и дикорастущего подсолнечника // Масличные культуры: Научн.-техн. бюл. ВНИИМК. - Краснодар, 2008. - Вып. 2(139). - С. 19-23.
6. Гучетль, С.З. ДНК-генотипирование на основе RAPD- и SSR-маркеров: апробирование и подбор оптимальных условий для Helianthus annuus L. / С.З. Гучетль, Т.А. Челюстникова, Т.С. Антонова, А.Д. Бочковой // Наука Кубани. - 2007а, № 2. - С. 44-47.
7. Гучетль, С.З. Микросателлитные локусы как маркеры для идентификации и сертификации линий и гибридов подсолнечника селекции ВНИИМК / С.З. Гучетль, Т.А. Челюстникова, Т.С. Антонова, С.А. Рамазанова // Масличные культуры: Научн.-техн.бюл. ВНИИМК, 2007б. - Выпуск № 2(137). - С. 27-32.
