CC BY
24
УДК 574.3:598.115.33
ПАРАМЕТРЫ ЛЕЙКОЦИТАРНОЙ СИСТЕМЫ КРОВИ ГАДЮК VIPERA BERUS BERUS, V. B. NIKOLSKII И V. RENARDIBASHKIROVI В СЕРПЕНТАРИИ
© 2018 Е.Б. Романова1, Е.И. Соломайкин1, А.Г. Бакиев2, А.Л. Маленёв2, Р.А. Горелов2
1 Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского, Нижний Новгород 2 Институт экологии Волжского бассейна РАН, Тольятти
Статья поступила в редакцию 04.04. 2018
Изучены лейкоцитарные показатели крови гадюк: родивших в условиях серпентария самок и их потомства Vipera berus berus и V. b. nikolskii, а также содержавшихся в серпентарии самок V. renardi bashkirovi. Сеголетки V. b. berus отличались от родивших их самок пониженным содержанием ге-терофилов, сеголетки V. b. nikolskii - азурофилов. Лейкоцитарный профиль самок V. b. berus и V. b. nikolskii статистически значимо не различался, что свидетельствовало о формировании сходных адаптивных реакций двух подвидов V. berus. Интегральные лейкоцитарные индексы были использованы для выявления специфической адаптивной реакции к условиям серпентария самок V. r. bashkirovi - таксона, совмещающего признаки V. berus и V. renardi. У V. r. bashkirovi по сравнению с V. b. berus статистически значимо ниже - доля гетерофилов в лейкоцитарной формуле, значения индекса сдвига лейкоцитов и индекса соотношения гетерофилов и лимфоцитов, выше - значения лимфоцитарно-гранулоцитарного индекса и индекса соотношения лимфоцитов и эозинофилов. Статистически значимых различий V. b. berus с V. b. nikolskii и V. b. nikolskii с V. r. bashkirovi ни по одному лейкоцитарному показателю не выявлено.
Ключевые слова: Vipera berus berus, Vipera berus nikolskii, Vipera renardi bashkirovi, лейкоцитарная формула, иммунный статус.
ВВЕДЕНИЕ
Изучение закономерностей функционирования и динамики живых систем является важнейшей проблемой биологии. Разработка теории формирования адаптивных стратегий на основе комплексных исследований экологии, физиологии и морфологии животных (в частности, змей) приобретает особую значимость при их искусственном содержании и разведении. Хорошо известно, что змеи обладают развитым гуморальным иммунным ответом на антигены [1, 2], и в адаптации пресмыкающихся к специфическим условиям обитания непосредственным образом участвует чувствительная индикаторная система крови. Изменения иммуногемато-логических параметров отражают адаптивный потенциал и физиологическое состояние организма рептилий [3-5 и др.]. При этом в доступных источниках нам удалось найти лишь единственную работу [6], в которой применен аутэкологический анализ системы крови гадюк
Романова Елена Борисовна, доктор биологических наук, профессор. E-mail: [email protected] Соломайкин Евгений Игоревич, магистр. E-mail: [email protected]
Бакиев Андрей Геннадьевич, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник. E-mail: [email protected]
Маленёв Андрей Львович, кандидат биологических наук, заведующий лабораторией. E-mail: [email protected] Горелов Роман Андреевич, инженер-исследователь. E-mail: [email protected]
рода Vipera (а именно - обыкновенной гадюки V. berus) не только в естественных, но и в тер-рариумных условиях. Между тем, применение иммуногематологического подхода позволяет вплотную подойти к решению важнейших задач факториальной экологии, связанных с выяснением механизмов адаптации живых организмов к антропогенно измененным условиям среды, а также к оптимизации условий содержания, разведения и эксплуатации ядовитых змей.
Целью работы являлась оценка интегральных лейкоцитарных показателей крови гадюко-вых змей рода Vipera в условиях серпентария.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
По четыре самки гадюк были отловлены в июле 2017 г.: обыкновенная гадюка номинативного подвида Vipera berus berus - в Красноглин-ском районе г. Самара; гадюка Никольского V. Ь. nikolskii - в Лысогорском районе Саратовской области, окрестности д. Старая Красавка; гадюка Башкирова Vipera пт^ bashkirovi - в Сергиевском районе Самарской области, окрестности с. Ендурайкино. Пойманные змеи были размещены в серпентарии Института экологии Волжского бассейна РАН, г. Тольятти. Все работы проводили в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» [7]. В условиях серпентария 4 самки гадюки обыкновенной и 4 самки гадюки Никольского при-
несли потомство с 10.08 по 28.08. Самки гадюки Башкирова потомства не дали. В период с 21.08 29.08 у всех 12 самок и части родившихся гадюк (гадюка обыкновенная - 13, гадюка Никольского - 24) была взята кровь для анализа. Для получения образцов крови животных обездвиживали путём захвата, после чего делали пункцию верхнечелюстной вены иглой, смоченной в растворе гепарина. По общепринятым гематологическим методикам от каждого животного готовили по три мазка (окраска по Романовскому-Гимзе). Готовые мазки просматривали с иммерсией, при увеличении ><1600, с дифференцированным подсчётом лейкоцитов [8]. С учетом морфологических особенностей определяли шесть типов лейкоцитарных клеток (в %): гранулоциты (гете-рофилы, базофилы, эозинофилы) и агранулоци-ты (азурофилы, моноциты, лимфоциты).
На основании лейкоцитарной формулы крови были рассчитаны интегральные лейкоцитарные индексы (отн. ед.):
1) индекс сдвига лейкоцитов,
^ гранулоцитов
ИСЛ =
агранулоцитов
2) индекс соотношения лимфоцитов и эози-
Л
нофилов, ИСЛЭ --
Э
3) индекс соотношения гетерофилов и эози-
Г
нофилов, ИСГЭ = — I
4) лимфоцитарно-гранулоцитарный индекс, Л • 10
ИЛГ =
Э + Г + Б
5) индекс соотношения гетерофилов и лимфоцитов, ИСГЛ = — ,
Л
где Л - лимфоциты; Э - эозинофилы; Г - гетеро-филы; Б - базофилы.
Анализ данных проводили методами непараметрической статистики с расчетом критериев Краскела-Уоллиса (Н) (при множественном сравнении независимых групп по одному признаку), Манна-Уитни (Ц (при сравнении независимых групп по одному признаку), Данна (О) (множественный критерий при попарном сравнении групп) в пакете прикладных программ «Статистика». Классификацию выборок проводили кластерным анализом. За величину статистической значимости принимали а=0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Известно, что обыкновенные гадюки из Самарской и Саратовской областей обладают
смешанными признаками двух подвидов - номинативного подвида V. Ь. Ьегыз и лесостепного подвида V. Ь. шкокки [9]. В наших выборках у гадюк из Самары превалировали признаки номинативной формы, а у гадюк из Саратовской области - признаки гадюки Никольского. По нашим данным, лейкоцитарный профиль и интегральные показатели лейкограмм самок V. Ь. Ьегыз и V. Ь. шкокки, содержащихся в условиях серпентария, статистически значимо не отличались (табл. 1 и 2), что свидетельствовало о формировании сходных адаптивных реакций в организме самок двух подвидов.
По лейкоцитарному составу крови сеголетки обыкновенной гадюки отличалась от родивших их самок пониженным содержанием гетерофи-лов (Ц=2,40, а=0,01). В отношении других показателей лейкоцитарного состава значимых отклонений не выявлено (табл. 1). Пониженная доля гетерофилов у родившихся особей отразилась на показаниях расчетных интегральных индексов крови. Так, индекс соотношения гетерофи-лов к лимфоцитам (ИСГЛ) молодых обыкновенных гадюк был в 1.8 раза ниже по сравнения с самками, что свидетельствовало о более высокой функциональной активности неспецифической защитной системы крови у взрослых самок после родов по сравнению с молодью. Отметим, что гадюки обыкновенные, отловленные в лесопарковой городской зоне Самары, по опубликованным нами ранее данным, имели более низкие показатели ИСЛ - 0,27±0,02 (2013-2014 гг.) [5] и 0,29±0,01 (2014-2015 гг.) [10]. Повышение этого показателя у самок V. Ьвтпз, обусловленное повышением содержания в крови эозинофилов и перераспределением соотношения доли гра-нулоцитов и агранулоцитов, вероятно, связано с напряженностью компенсаторных процессов организма и снижением адаптивных реакций иммунитета при относительно длительном содержании в условиях серпентария.
Сеголетки V. Ь. шкокки по сравнению с родившими их самками характеризовались пониженным содержанием в периферической крови азурофилов (Ц=2,50, р=0,01) (табл. 2). Отношение гетерофилов к лимфоцитам (ИСГЛ) у молодых гадюк Никольского, как и у молодых обыкновенных гадюк, оказалось значимо ниже по сравнению с самками (Ц=2,04, р=0,04), что косвенно свидетельствовало о возрастании специфической реактивности организма неполовозрелых особей в условиях серпентария.
Различия по лейкоцитарным показателям крови между сеголетками гадюк V. Ь. Ьетыз и V. Ь. шкокки были слабо выражены и статистически незначимы.
Кластерный анализ с использованием дистанции Махаланобиса позволил сравнить лейкоцитарные показатели крови исследованных
Таблица 1. Лейкоцитарный состав периферической крови родивших самок (п=4) и сеголеток (п=13) гадюки обыкновенной Vipera berus berus
Статистические показатели Гете-рофи -лы, % Базо- филы, % Эози-нофи -лы, % Азу-рофи -лы, % Моноциты, % Лимфо -циты, % ИСЛ, отн. ед. ислэ, отн. ед. ИСГЭ, отн. ед. илг, отн. ед. исгл, отн. ед.
Самки
М 9,25 7,75 13,50 8,75 5,75 55,00 0,44 4,07 0,69 18,14 0,17
т 0,96 0,25 0,28 1,49 1,81 2,73 0,02 0,18 0,06 1,30 0,02
Сеголетки
М 5,07 11,15 12,84 7,92 5,92 57,23 0,41 5,15 0,43 22,12 0,09
т 0,73 1,18 1,28 0,91 0,92 3,35 0,04 0,71 0,07 2,90 0,01
Различия самок и сеголеток
и 2,40 1,66 1,08 0,34 0,05 0,45 0,51 0,84 1,58 0,39 1,98
Р 0,01 0,09 0,27 0,73 0,95 0,65 0,60 0,39 0,11 0,69 0,04
Примечание: M - среднее арифметическое, m - ошибка среднего арифметического, U - критерий Манна-Уитни; p - достигнутый уровень значимости; жирным шрифтом выделены статистически значимые различия ^=0,05)
Таблица 2. Лейкоцитарный состав периферической крови родивших самок (п=4) и сеголеток (п=24) гадюки Никольского Vipera berus nikolskii
Статистические показатели Гете-рофи -лы, % Базо- филы , % Эози-нофи -лы, % Азу-рофи -лы, % Моноциты, % Лимфо -циты, % ис, отн. ед.Л ИСЛЭ, отн. ед. ИСГЭ, отн. ед. ИЛГ, отн. ед. ИСГЛ, отн. ед.
Самки (4)
М 7,00 7,25 13,5 10,75 7,00 54,50 0,39 4,05 0,53 19,83 0,13
т 0,41 1,11 0,29 0,63 0,41 0,96 0,03 0,13 0,03 1,28 0,008
Сеголетки (24)
М 5,33 11,70 13,62 6,87 6,70 55,75 0,45 4,64 0,46 20,53 0,09
т 0,41 1,47 0,82 0,52 0,81 2,31 0,03 0,44 0,06 2,03 0,008
Различия самок и сеголеток
и 1,50 0,98 0,09 2,50 0,46 0,42 0,49 0,03 0,75 0,68 2,04
Р 0,13 0,32 0,92 0,01 0,64 0,66 0,62 0,97 0,45 0,49 0,04
Примечание: M - среднее арифметическое, m - ошибка среднего арифметического, U - критерий Манна-Уитни; p - достигнутый уровень значимости; жирным шрифтом выделены статистически значимые различия ^=0,05)
подвидов змей в разные фазы онтогенеза. Один выделенный кластер (рисунок) составили сеголетки двух подвидов обыкновенной гадюки (V Ь. berus и V. Ь. т^кИт) и половозрелые самки гадюки Башкирова (V. г. bashkirovl). По совокупности исследованных иммуногематологических показателей молодые особи гадюки Никольского и гадюки обыкновенной оказались наиболее сходны, что подтверждалось наименьшим расстоянием Махаланобиса.
Сравнение лейкоцитарных показателей крови исследованных подвидов змей в разные фазы онтогенеза кластерным анализом на основании дистанции Махаланобиса (относительной связи) показало выделение двух кластеров (рисунок). Один кластер составляли сеголетки двух подвидов обыкновенной гадюки (V. Ь. berus и V. Ь. т^кИт) и половозрелые самки гадюки Башкирова (V. г. bashkirovi). По совокупности исследованных иммуногематологических по-
казателей молодые особи гадюки Никольского и гадюки обыкновенной оказались наиболее сходны, что подтверждалось наименьшим расстоянием относительной связи.
Самки V. г. bashkirovi располагались на достаточном расстоянии от неполовозрелых особей, что свидетельствовало о специфической адаптивной реакции гадюки Башкирова. Эта форма, описанная в качестве подвида восточной степной гадюки, совмещает признаки V. berus и V. [11]. В пользу гибридогенного проис-
хождения гадюки Башкирова свидетельствует доказанная естественная гибридизация гадюк восточной степной и обыкновенной [12].
В отдельный кластер вошли взрослые самки V. Ь. berus и V. Ь. nikolskii, что подтверждало схожесть адаптивных реакций системы крови двух подвидовых форм. Как уже было отмечено, по лейкоцитарному составу самки этих подвидов гадюк между собой были сходны, при этом не-
Мрега Ьегиэ гнко1зкм, самки
Мрега Ьегиэ Ьегиэ, самки Мрега renardi ЬавМИгом, самки
Мрега Ьегиэ п1ко1эсеголетки
Мрега Ьегиэ Ьегиэ, сеголетки
123456789 10 Расстояние связи
Рис. Дендрограмма сходства выборок гадюк по гематологическим показателям
которые показатели крови V. Ь. Ьегш статистически значимо различались с аналогичными показателями V. г. ЬазЬМтти Так, самки номинативной формы обыкновенной гадюки характеризовались повышенным содержанием в крови гетерофилов Б1-3=2,50, р=0,03), высокими показателями интегральных индексов (ИСЛ и ИСГЛ) и низкими показателями индексов (ИСЛЭ
и ИЛГ) по сравнению с самками гадюки Башки-рова (табл. 3).
Известно, что доля гетерофилов в крови возрастает в ответ на инфекции, воспаление и раздражающие внешние воздействия [13, 14 и др.]. Отношение гетерофилов к лимфоцитам (ИСГЛ) рассматривается как составная мера реакции на стресс [4]. Отметим, что доля лимфоцитов в
Таблица 3. Лейкоцитарный состав периферической крови самок гадюк
Статистические показатели Гете-рофи-лы, % Базо- филы, % Эози-нофи-лы, % Азуро-филы, % Моно ци-ты, % Лимфоциты, % ИСЛ, отн. ед. ИСЛЭ, отн. ед. ИСГЭ, отн. ед. ИЛГ, отн. ед. ИСГЛ, отн. ед.
1. У1рега Ъегив Ъегив
М 9,25 7,75 13,50 8,75 5,75 55,00 0,44 4,07 0,69 18,14 0,17
т 0,96 0,25 0,28 1,49 1,81 2,73 0,02 0,18 0,06 1,30 0,02
2. У1рега Ъегив шкокки
М 7,00 7,25 13,5 10,75 7,00 54,50 0,39 4,05 0,53 19,83 0,13
т 0,41 1,11 0,29 0,63 0,41 0,96 0,03 0,13 0,03 1,28 0,008
3. У1рега гепагШ ЪавИк1гоу1
М 5,50 7,00 9,00 8,25 7,25 63,00 0,27 7,47 0,66 29,74 0,09
т 0,86 1,00 1,35 0,75 0,48 1,83 0,02 1,06 0,14 2,63 0,01
Статистические различия
Н 6,71 1,01 6,34 3,29 1,57 6,33 7,90 7,42 3,55 8,03 7,79
Р 0,03 0,50 0,04 0,19 0,46 0,04 0,02 0,02 0,17 0,02 0,02
Б1-з 2,50 - - - - - 2,64; 2,45 - 2,74; 2,75
Р 0,03 - - - - - 0, 02 0,04 - 0,01 0,01
Примечание: М - среднее арифметическое, т - ошибка среднего арифметического, Н- критерий Краскелла-Уоллеса, Б - критерий Данна, р - достигнутый уровень значимости; жирным шрифтом выделены статистически значимые различия (а=0,05)
крови самок змей изменялась незначительно и составляла 50-65% от всех форменных элементов белой крови. Однако повышенное значение интегрального индекса ИСЛ (0,44±0,02, D1-3=2,64, a=0,02) у самок V. b. berus по сравнению с самками V. r. bashkirovi свидетельствовало о признаках снижения адаптивных реакций иммунной системы организма, что, по-видимому, компенсировалось повышением функциональной активности неспецифической защитной системой крови (содержанием гетерофилов) в условиях серпентария.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Показано, что параметры лейкоцитарной системы крови молодых змей рода Vipera отличались от показателей крови взрослых особей. Более выраженные различия выявлены в долевом составе гранулоцитов. Молодые особи гадюки обыкновенной V. b. berus характеризовались пониженным содержанием гетерофилов, неполовозрелые особи V. b. nikolskii - азурофи-лов. Более низкие показатели индекса соотношения гетерофилов к лимфоцитам (ИСГЛ) у молодых особей по сравнению с самками отражали хороший адаптивный ответ и устойчивое функционирование организма. По интегральным лейкоцитарным показателям крови неполовозрелые особи двух подвидов обыкновенной гадюки (V. b. berus и V. b. nikolskii) между собой статистически значимо не различались. Кластерный анализ подтвердил сходство эко-лого-физиологических механизмов адаптации неполовозрелых особей и адаптивных реакций системы крови взрослых самок номинативного подвида гадюки обыкновенной и гадюки Никольского в условиях серпентария. С помощью расчета интегральных лейкоцитарных индексов показана специфическая адаптивная реакция самок гадюки Башкирова V. r. bashkirovi к условиям серпентария.
Aвторы благодарят B.K. Шитикова за прочтение рукописи и сделанные замечания.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Hussein M.F., Badir N., Ridi R., Deeb S. Effect of seasonal variation on lymphoid tissues of the lizards, Mabuya quinquetaeniata Licht. and Uromastyx aegyptia Forsk. // Dev. Comp. Immunol. 1978. V. 2. P. 469-478.
2. Work T.M., Balazs G.H., Rameyer R.A., Chang S.P. Assessing humoral and cell-mediated immune response in Hawaiian green turtles, Chelonia mydas // Vet. Immunol. Immunopathol. 2000. V. 74. P. 179-194.
3. Coico R., Sunshine G., Benjamini E. Immunology: A Short Course. Hoboken, NJ: Wiley-Liss Publications,
2003. 500 p.
4. Davis A. K., Maney D. L., Maerz J. C. The use of leukocyte profiles to measure stress in vertebrates: a review for ecologists // Functional Ecology. 2008. V. 22. P. 760-772.
5. Романова Е.Б., Соломайкин Е.И., Бакиев А.Г., Горелов Р.А., Клёнина А.А. Иммуногематологические показатели ядовитых и неядовитых на территориях Волжского бассейна с разной антропогенной трансформацией // Изв. Самар. НЦ РАН, 2017. Т. 2. № 2. С. 54-61.
6. Павлов А.В. Эколого-морфологическая характеристика обыкновенной гадюки (Vipera berus L.) в зависимости от условий естественной и искусственной среды: дис. ... канд. биол. наук. Казань, 1998. 174 с.
7. International Guding Principles for Biomedical Research Involving Animals. 2012. URL: https://grants.nih.gov/grants/olaw/guiding_ principles_2012.pdf (дата обращения 17.03.2018).
8. Соколина Ф.М., Павлов А.В., Юсупов Р.Х. Гематология пресмыкающихся. Методическое пособие к курсу герпетология, большому практикуму и спецсеминарам. Казань: Казан. гос. ун-т, 1997. 31 с.
9. Гадюки (Reptilia: Serpentes: Viperidae: Vipera) Волжского бассейна. Часть 1 / Бакиев А.Г., Гаранин В.И., Гелашвили Д.Б. [и др.]. Тольятти: Кассандра, 2015. 234 с.
10. Романова Е.Б., Соломайкин Е.И., Бакиев А.Г., Горелов Р.А. Сравнительные данные о лейкоцитарном составе крови гадюки обыкновенной (Vipera berus) и гадюки восточной степной (Vipera renardi) // Современная герпетология. 2017. Т. 17. № 1-2. С 51-55.
11. Гаранин В.И., Павлов А.В., Бакиев А.Г. Степная гадюка, или гадюка Ренарда Vipera renardi (Christoph, 1861) // Змеи Волжско-Камского края / Бакиев А.Г., Гаранин В.И., Литвинов Н.А., Павлов А.В., Ратников В.Ю. Самара: Изд-во СамНЦ РАН,
2004. C. 61-90.
12. Павлов А.В., Зиненко А.И., Йогер У. [и др.] Естественная гибридизация гадюк восточной степной Vipera renardi и обыкновенной V. berus // Изв. Самар. НЦ РАН. 2011. Т. 13. № 5. С. 172-178.
13. Jain N.C. Essentials of Veterinary hematology. Blackwell Publishing, Philadelphia (Pa.): Lea and Febiger, 1993. 417 p.
14. Campbell T.W. Clinical pathology // Reptile Medicine and Surgery. Philadelphia (Pa.): W.B. Saunders Company, 1995. P. 248-257.
PARAMETERS OF LEUCOCYTAL BLOOD SYSTEM OF VIPERS - VIPERA BERUS BERUS, V. B. NIKOLSKII AND V. RENARDI BASHKIROVI IN THE SERPENTARIUM
© 2018 E.B. Romanova1, E.I. Solomaykin1, A.G. Bakiev2, A.L. Malenyov2, R.A. Gorelov2
1 Nizhny Novgorod's Lobachevsky State University, Nizhny Novgorod 2 Institute of Ecology of the Volga River Basin of RAS, Togliatti
The leukocytal blood indices of the vipers: females of Vipera berus berus and V. b. nikolskii, who gave birth in the serpentarium and their posterity, and females of V. renardi bashkirovi kept in the serpentarium have been studied. The underyearlings of V. b. berus differed from females that gave them birth with a reduced content of heterophils, the underyearlings of V. b. nikolskii differed with a reduced content of azurophils. The leukocytal profile of V. b. berus and V. b. nikolskii females statistically did not differ, that indicated formation of the similar adaptive reactions of two subspecies of V. berus. Integral leukocytal indices were used to identify the specific adaptive reaction to the serpentarium conditions for females of V. r. bashkirovi - the taxon combined the characteristics of V. berus and V. renardi. V. r. bashkirovi compared with V. b. berus has statistically much lower part of heterophiles in the leukocytal formula, values of the leukocyte shift index and the ratio index of heterophiles and lymphocytes, and much higher part of the values of lymphocyte-granulocytal index and the ratio index of lymphocytes and eosinophils. Statistically significant differences in the leukocytal blood parameters of V. b. berus compared with V. b. nikolskii and V. b. nikolskii compared with V. r. bashkirovi are not revealed.
Keywords: Vipera berus berus, Vipera berus nikolskii, Vipera renardi bashkirovi, leukogram, immune status.
Elena Romanova, Doctor of Biology, Professor of Ecology Department. E-mail: [email protected] Evgeniy Solomaykin, Magister of Ecology. E-mail: [email protected]
Andrey Bakiev, Candidate of Biology, Senior Research
Fellow. E-mail: [email protected]
Andrey Malenyov, Candidate of Biology, Head of Laboratory.
E-mail: [email protected]
Roman Gorelov, Research Engineer.
E-mail: [email protected]
