CC BY
58
ВЕСТНИК УДМУРТСКОГО УНИВЕРСИТЕТА БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
УДК 577.3 М.В. Малахов
ПАРАМЕТРЫ БИОИМПЕДАНСНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ ОТМЫТЫХ И ОБРАБОТАННЫХ ТРИПСИНОМ ЭРИТРОЦИТОВ
Изучены параметры биоимпедансной спектроскопии (БИС) суспензий неотмытых, отмытых и обработанных трипсином эритроцитов. Электрические измерения суспензий проводились на аппарате АВС-01 «Медасс». Установлено, что изменения параметров БИС после отмывки обусловлены структурными изменениями мембран эритроцитов, а после инкубации с трипсином - сближением эритроцитов, увеличением их объёма и изменением однородности суспензий.
Ключевые слова: биоимпедансная спектроскопия, отмывка эритроцитов, трипсин, мембрана эритроцита.
Одним из методов оценки показателей крови является биоимпедансная спектроскопия (БИС) [1]. Метод БИС позволяет определить гематокрит [2; 3], содержание гемоглобина, концентрацию эритроцитов [4]. Следует отметить, что на параметры БИС крови существенное влияние оказывает адсорбция белков плазмы на поверхности форменных элементов [5; 6], что уменьшает точность определения гематологических показателей методом БИС.
Известно, что на мембране эритроцитов находится слой сиаловых кислот, который обусловливает поверхностный отрицательный заряд красных клеток крови. Заряд на поверхности эритроцитов влияет на адсорбцию белков на их мембране, а также на агрегацию форменных элементов [7; 8]. Показатели БИС крови связаны с процессом агрегации эритроцитов [6]. Таким образом, поскольку устранение отрицательного заряда с мембраны эритроцитов приводит к усилению процесса агрегации и уменьшению адсорбции некоторых белков, можно предположить, что обработка эритроцитов трипсином вызовет изменение показателей БИС крови. Уменьшение количества белков на мембране эритроцитов, вероятно, приведёт к снижению сопротивления и ёмкости мембран. В доступной нам литературе исследований, посвящённых электрическим свойствам обработанных трипсином эритроцитов, нет. Вместе с тем изучение этого вопроса представляет интерес.
Целью нашего исследования было выяснить, как влияют адсорбированные на мембране эритроцитов белки на параметры БИС эритроцитарных суспензий, а также установить, как изменяются показатели биоимпедансной спектроскопии суспензий красных клеток крови в результате устранения отрицательного заряда с мембраны эритроцитов.
Материалы и методика исследования
Приготовление суспензий эритроцитов. Были приготовлены концентрированные суспензии неотмытых, отмытых и обработанных трипсином эритроцитов. Образцы венозной крови (п=8) объёмом 9 мл центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин на центрифуге ОПн-8, затем надосадочную жидкость полностью удаляли. Полученную суспензию эритроцитов делили на 3 равные порции. Первую порцию использовали для измерений как неотмытые эритроциты, а вторую и третью отмывали трёхкратным центрифугированием по 10 мин при 3000 об/мин в 6 мл 0,9%-го раствора хлорида натрия. После третьего центрифугирования надосадочную жидкость полностью удаляли. Затем вторую порцию суспензии использовали для измерений как отмытые эритроциты, а третью инкубировали в растворе трипсина (10 мг кристаллического трипсина в 6 мл 0,9% -го раствора №С1) в течение часа. После инкубации с трипсином эритроциты вновь отмывались трёхкратным центрифугированием в 0,9%-м растворе хлорида натрия, как было описано выше. Затем надосадочную жидкость полностью удаляли и использовали третью порцию для измерений как обработанные трипсином эритроциты.
Гематокрит (Щ) всех суспензий эритроцитов контролировался центрифугированием в гемато-критном капилляре при 5000 об/мин в течение 10 мин.
Биоимпедансная спектроскопия. Электрические измерения суспензий эритроцитов выполнялись при комнатной температуре (21+1оС) на биоимпедансном анализаторе «АВС-01 Медасс» в диапазоне частот 5 - 500 кГц. Исследуемые образцы объёмом 1 мл помещали в измерительную камеру, которая представляет собой пластиковую трубку с двумя парами потенциальных и токовых электродов. Методика измерения подробно описана в нашей предыдущей работе [4]. С использованием про-
2010. Вып. 3 БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
граммного обеспечения «АВС01-024 Медасс» определялись параметры биоимпедансной спектроскопии: сопротивление внеклеточной (Re) и внутриклеточной (Ri) жидкости, характеристическую частоту (Fchar), параметр Alpha.
Статистика. Для выявления достоверности различий между параметрами БИС неотмытых, отмытых и обработанных трипсином суспензий эритроцитов использовался парный критерий t-Стьюдента.
Результаты и их обсуждение
Установлено, что гематокрит измеряемых суспензий был стандартным (табл. 1) и, следовательно, не оказывал влияния на их электрические свойства.
Таблица 1
Гематокрит суспензий эритроцитов
Неотмытые эритроциты Отмытые эритроциты Эритроциты, обработанные трипсином
Ht, % 97,б+2,б 97,4+1,З 9б,З+2,1
Можно предположить, что параметры БИС в нашем исследовании были связаны с изменением объёма и формы клеток, сближением эритроцитов, наличием на их поверхности отрицательного заряда, изменением степени однородности суспензий.
Влияние отмывки эритроцитов на параметры БИС суспензий. Значения показателей био-импедансной спектроскопии суспензий неотмытых и отмытых эритроцитов представлены в табл. 2.
Таблица 2
Значения показателей биоимпедансной спектроскопии суспензий эритроцитов
Эритроциты Re, Ом Ri, Ом Fchar, кГц Alpha
Неотмытые 8З8,б+1З7,0 78,8+б.2 1б7,б+18,7 0,З1б+0,002
Отмытые б47,1+11б,4** б9,0+З,0*** 227,2+З- З,9*** 0,З1З+0,002*
* p<0,05; **, - р <0,01; *** р - <0,001 по сравнению с неотмытыми эритроцитами.
Известно, что отмывка эритроцитов приводит к удалению белков с их поверхности, изменению структуры мембран, а также к незначительному уменьшению объёма клеток [9]. Белки плазмы влияют как на сопротивление крови, так и на ёмкостные свойства мембран эритроцитов [5; 6]. В работе [5] указывается, что после отмывки эритроцитов в фосфатно-буферном растворе Re крови уменьшилось. В нашем исследовании также отмечалось уменьшение Re в суспензиях отмытых эритроцитов (табл. 2).
Результаты исследования показали, что Ri суспензий отмытых эритроцитов меньше, чем неотмытых (табл. 2). Такое изменение Ri не совсем логично, поскольку этот параметр определяется, главным образом, объёмом внутриклеточной жидкости [10], который в нашем исследовании оставался неизменным. Поскольку сопротивление внутриклеточной жидкости связано с ёмкостью клеточных мембран [3], уменьшение ёмкости вследствие удаления с мембраны белков приводит к снижению Ri.
Нами установлено, что Fchar суспензий отмытых эритроцитов была выше, чем неотмытых (табл. 2). По литературным данным характеристическая частота обратно пропорциональна ёмкости и сопротивлению измеряемого объекта [11]. Отмывка эритроцитов приводит к уменьшению сопротивления измеряемой суспензии и снижению емкости клеточных мембран, поэтому Fchar увеличивается.
Alpha суспензий отмытых эритроцитов была меньше, чем неотмытых (табл. 2). Известно, что параметр Alpha зависит от размеров и неоднородности клеточных элементов измеряемого образца [11; 12]. В работе [9] указывается, что отмывка эритроцитов приводит к существенному изменению состава клеточной мембраны. После трёх отмывок раствором хлорида натрия происходило уменьшение содержания липопротеидов на 17%, холестерола - на 13%, фосфолипидов - на 3 - 5%, объём клеток уменьшался на 6 - 8%. Можно предположить, что такие изменения в мембране эритроцитов вызывали снижение степени их однородности по форме и размерам, что наряду с уменьшением размера клеток и приводило к уменьшению Alpha.
Параметры биоимпедансной спектроскопии. БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
Влияние обработки эритроцитов трипсином на параметры БИС суспензий. Значения показателей биоимпедансной спектроскопии суспензий отмытых и обработанных трипсином эритроцитов представлены в табл. 3.
Таблица 3
Значения показателей биоимпедансной спектроскопии суспензий отмытых и обработанных
трипсином эритроцитов
Эритроциты Re, Ом Ri, Ом Fchar, кГц Alpha
Отмытые б47,1+11б,4 б9+З,1 227,2+33,9 0,З1З+0,002
Обработанные трипсином 7З9,7+119,1* 6S,4+4,9 20З,7+З0,З* 0,317+0,003*
* - p<0^ по сравнению с отмытыми эритроцитами.
Вследствие обработки красных клеток крови трипсином происходит отщепление сиаловых кислот от их мембран и устранение с их поверхности отрицательного заряда [8; 13], а также увеличение объёма клеток [13]. Поскольку поверхностный отрицательный заряд способствует отталкиванию эритроцитов друг от друга, его устранение вызывает сближение клеток, при этом объём внеклеточной жидкости уменьшается. Так как сопротивление внеклеточной жидкости зависит от объёма внеклеточной жидкости [10], после инкубации суспензии с трипсином происходит снижение Re (табл. 3).
Обработка эритроцитов трипсином не приводило к изменению Ri (табл. 3). Поскольку сопротивление внутриклеточной жидкости в основном зависит от объёма внутриклеточной жидкости [10], а в нашем исследовании общий объём внутриклеточной жидкости не менялся, Ri также оставалось на одном уровне.
После инкубации эритроцитов с трипсином отмечалось снижение Fchar по сравнению с отмытыми (табл. 3). Можно предположить, что сближение клеток вызывало повышение сопротивления измеряемых суспензий, а также рост их электрической ёмкости. Поскольку характеристическая частота обратно пропорциональна сопротивлению и ёмкости [11], после обработки эритроцитов трипсином происходило её уменьшение.
Под влиянием трипсина Alpha возрастала (табл. 3). Так как параметр Alpha связан с размером клеток, увеличение объёма эритроцитов приводило к повышению Alpha. Кроме того, увеличение размеров клеток, по-видимому, сопровождалось изменением формы клеток, она становилась более сферической. Такое изменение формы эритроцитов приводило к повышению однородности измеряемых суспензий и увеличению Alpha.
Необходимо подчеркнуть, что все описанные изменения параметров БИС обработанных трипсином эритроцитов не связаны с удалением сиаловых кислот и устранением поверхностного отрицательного заряда непосредственно, а обусловлены влиянием трипсина на объём клеток, а также сближением эритроцитов.
Следует отметить, что на практике биоимпедансный анализ, как правило, используют для исследования целого организма: определения водных секторов [14] и состава тела [15]. Возможно, исследование электрических свойств клеточных суспензий позволит глубже изучить влияние физиологических факторов на параметры БИС и выявить новые возможности для применения метода биоимпедансной спектроскопии в биологии и медицине.
Выводы
Отмывка эритроцитов приводит к уменьшению сопротивления внеклеточной и внутриклеточной жидкости, снижению параметра Alpha и росту характеристической частоты концентрированных суспензий. Эти изменения связаны с удалением белков с поверхности эритроцитов и изменением структуры клеточных мембран, а также со снижением однородности измеряемых суспензий. Инкубация эритроцитов с трипсином вызывает рост параметра Alpha, повышение сопротивления внеклеточной жидкости и снижение характеристической частоты. Эти изменения параметров БИС не связаны с устранением поверхностного отрицательного заряда непосредственно, а обусловлены сближением эритроцитов, увеличением объёма клеток и изменением однородности суспензий под влиянием трипсина.
2010. Вып. 3 БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Zhao T.X. New applications of electrical impedance of human blood // J. Med. Eng. Technol. 199б. Vol. 20, №3. P. 11З-120.
2. Zhao T.X. Electrical impedance and haematocrit of human blood with various anticoagulants // Physiol. Meas. 1993. Vol. 14, №3. P. 299-307.
3. Ulgen Y., Sezdi M. Physiological quality assessment of stored whole blood by means of electrical measurements // Med. Bio. Eng. Comput. 2007. Vol. 4З. P. бЗЗ-бб0.
4. Malahov M.V., Smirnov A.V., Nikolaev D.V. Bioimpedance spectroscopy as technique of hematological and biochemical analysis of blood // J. Phys.: Conf. Ser. 224 (1). doi0121302010.
З. Zhao T.X. Contributions of suspending medium to electrical impedance of blood // Biochim. Biophys. Acta. 1994. Vol. 1201, №2. P. 179-Ш.
6. Zhao T.X., Jacobson B. Quantitative correlations among fibrinogen concentration, sedimentation rate and electrical impedance of blood // Med. Biol. Eng. Comput. 1997. Vol. ЗЗ, №3. P. ^Ь^З.
7. Jan K.M., Chien S. Role of surface electric charge in red blood cell interactions // J. Gen. Physiol. 1973. Vol. б1,
№З. P. 63S^4.
5. Meiselman H.J., Neu B., Rampling M.W. Influence of cell-specific factors on red blood cell aggregation // Biorheology. 2004. Vol. 41, №2. P. 91-112.
9. Lovelock J.E. The physical instability of human red blood cells // Biochem. J. 19ЗЗ. Vol. б0, №4. P. б92-б9б.
10. Cornisht B.H., Tomst B.J., Ward L.C. Improved prediction of extracellular and total body water using impedance loci
generated by multiple frequency bioelectrical impedance analysis // Phys. Med. Biol. 1993. Vol. 3S. P. ЗЗ7-З4б.
11. Grimnes S., Martinsen O.G. Bioimpedance and bioelectricity basics (2nd ed.). L.: Academic Press. 200S. 391 p.
12. Martinsen 0.G., Grimnes S., Schwan H.P. Interface Phenomena and Dielectric Properties of Biological Tissue // Encyclopaedia of Surface and Colloid Science. 2002. P. 2б4З-2бЗ2.
13. Ponder E. Effects produced by trypsin on certain properties of the human red cell // Blood. 19З1. Vol. б, №4. P. ЗЗ0-ЗЗб.
14. Segal K.R., Burastero S., Chun A. Estimation of extracellular and total body water by multiple-frequency bioelec-trical-impedance measurement // Am. J. Clin. Nutr. 1991. Vol. З4, №1. P. 2б-29.
1З. Salinari S., Bertuzzi A., Mingrone G. Bioimpedance analysis: a useful technique for assessing appendicular lean soft tissue mass and distribution // J. Appl. Physiol. 2003. Vol. 94, №4. P. 1ЗЗ2-1ЗЗб.
Поступила в редакцию 1З.0б. 10
M. V. Malakhov, postgraduate student
Bioimpedance spectroscopy parameters of washed and treated with trypsin erythrocytes
The bioimpedance spectroscopy (BIS) parameters of the suspensions of unwashed, washed and treated with trypsin erythrocytes were studied. The electric measurements of the suspensions were performed on the BIA analyzer ABC-01 “Medass”. The alterations of the BIS parameters after washing were determined by the erythrocyte membranes modifications. The changes of the BIS indices after trypsin treatment were due to increase of the cells volume, approaching of the erythrocytes and changes in the heterogeneity of the suspensions.
Keywords: bioimpedance spectroscopy, washed erythrocytes, trypsin, erythrocyte membranes.
Малахов Максим Викторович, аспирант
Ярославский государственный педагогический университет им. К. Д. Ушинского 150000, Россия, г. Ярославль, ул. Республиканская, 108 E-mail: malahovmv@mail. ru
