CC BY
46
УДК 577.218
ВІДПОВІДЬ ПУХЛИННИХ КЛІТИН НА ПРИГНІЧЕННЯ ЕКСПРЕСІЇ АДАПТЕРНОГО ПРОТЕЇНУ RUK/CIN85 РЕКОМБІНАНТНИМИ ЛЕНТИВІРУСАМИ
А. А. САМОЙЛЕНКО1, Н. В. БИЦЬ1, Г. В. ПАСІЧНИК1, Н. В. КОЗЛОВА1,
А. В. БАЗАЛІЙ1, Д. С. ГЕРАЩЕНКО1, С. Г. ШАНДРЕНКО1,
О. В. ВОРОТНІКОВ2, Т. КІТЦМАНН3, С. В. КОМІСАРЕНКО1, Л. Б. ДРОБОТ1
1Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ, Україна 2Факультет фундаментальної медицини, МДУ ім. М. В. Ломоносова, Москва, Росія 3Відділення біохімії і Біоцентр Оулу, Університет Оулу, Оулу, Фінляндія
Е-mail: [email protected]
Отримано 31.05.2013
Ruk/CIN85 є одним з адаптерних протеїнів, що відіграють важливу роль у регулюванні процесів проліферації, рухливості та загибелі клітин. Нещодавно нами було показано, що надекспресія Ruk/CIN85 посилює трансформувальний потенціал клітин аденокарциноми грудної залози людини лінії MCF-7. Метою цього дослідження було з’ясувати, чи впливатиме на біологічні властивості клітин пригнічення експресії Ruk/CIN85. Для РНК-інтерференції Ruk/CIN85 було одержано лентивірусні конструкції, що містять Ruk/CIN85-специфічні послідовності small hairpin RNA. За допомогою отриманих рекомбінантних лентивірусів встановлено, що пригнічення експресії Ruk/CIN85 впливає на біологічні властивості (рухливість, проліферацію, рівень експресії транспортера ABCG2, утворення активних форм кисню) різних типів пухлинних клітин, а саме: аденокарциноми грудної залози людини лінії MCF-7, аденокарциноми ободової кишки людини НТ-29 та мишачої карциноми легень Льюїса.
Ключові слова: адаптерні протеїни, Ruk/CIN85, РНК-інтерференція, ленти-вірусні вектори, рухливість клітин, активні форми кисню.
Специфічність відповіді клітин на зовнішні стимули потребує інтеграції численних внутрішньоклітинних сигнальних шляхів. Однією з основних груп протеїнів, що відповідають за таку інтеграцію, є адаптерні та риштувальні (scaffold) протеїни, які забезпечують збирання надмолекулярних мультипротеїнових комплексів та їх регулювання [1]. Ці мультипротеїнові комплекси передають всередину клітини сигнали, залучені до контролю росту, диференціювання, адгезії, рухливості та виживання клітин. Адаптерний протеїн Ruk/CIN85 (Regulator for ubiquitous kinase/c-Cbl-interacting protein of 85 kDa) завдяки складній доменній організації та наявності множинних молекулярних форм бере участь у низці важливих внутрішньоклітинних сигнальних процесів, що лежать в основі регулювання архітектури актинового цитоскелета, адгезії, рухливості та інвазії клітин, апопто-зу, мітогенного сигналювання, транспорту
мембранних везикул, ліганд-опосередкова-ного ендоцитозу рецепторних тирозинових протеїнкіназ, інфікування клітин вірусом простого герпесу [2-5].
Нещодавно нами було показано, що надекспресія Ruk/CIN85 посилює трансформувальний потенціал клітин аденокарциноми грудної залози людини лінії MCF-7 [5]. Проте не було досліджено, який вплив на властивості клітин лінії MCF-7 з надекспре-сією Ruk/CIN85 матиме пригнічення експресії цього протеїну. Одним з найпоширеніших сучасних експериментальних підходів для дослідження функцій генів у культурах клітин є використання методології РНК-інтерференції [6]. Лентивірусні вектори, що кодують shRNA (small hairpin RNA), які вбудовуються в геном клітини-хазяїна, використовують для тривалого пригнічення (silencing) експресії відповідних генів [7]. З огляду на це, ми спрямували наші зусилля на конструювання рекомбінантних ленти-
вірусів, які містять послідовність shRNA для протеїну Ruk/CIN85. Одержання такої лентивірусної конструкції дало змогу пригнітити експресію Ruk/CIN85 у клітинах гліоми щура С6, аденокарциноми ободової кишки людини НТ-29, у клітинах мишачої карциноми легень Льюїса (Lewis lung carcinoma, LLC) та аденокарциноми грудної залози людини лінії MCF-7 з надекспресією Ruk/CIN85, а також виявити, що пригнічення експресії Ruk/CIN85 може впливати на рухливість, проліферацію і утворення активних форм кисню (АФК) у зазначених типах клітин. Для того, щоб оцінити потенційний вплив надекспресії Ruk/CIN85 у клітинах MCF-7 на розвиток резистентності до протипухлинних препаратів, було також досліджено вміст одного з АТР-зв’язуваль-них мембранних касетних транспортерів ABCG2 (ATP-binding cassette sub-family G member 2), що відіграє роль у розвиткові раку грудної залози людини [8].
Матеріали і методи
Культура клітин. Клітини аденокарциноми грудної залози людини лінії MCF-7, ембріональної нирки людини HEK293T, аденокарциноми ободової кишки людини НТ-29, мишачої карциноми LLC та гліоми щура С6 культивували в середовищі DMEM (РАА Laboratories, Австрія), яке містило 10% ембріональної сироватки теляти (fetal bovine serum, FBS), 50 U/мл пеніциліну та 100 мкг/мл стрептоміцину. Клітини утримували в СО2-інкубаторі (Cytoperm 8080, Heraeus, Hanau, Німеччина) при 37 °C у зволоженій атмосфері, що містила 5% CO2 (за об’ємом). Одержання сублінії клітин MCF-7 зі стабільною надекспресією протеїну Ruk/CIN85 (G4) описано раніше [5].
Одержання рекомбінантних лентивіру-сів, що містять послідовності shRNA для протеїну Ruk/CIN85. Лентивірусні вектори для пригнічення експресії Ruk/CIN85 методом РНК-інтерференції (pLKO.1-shRuk/CIN85 R19-23) було отримано шляхом лігування відповідних олігонуклеотидів після їх відпалювання (для R22 5'-CCGGCCAGCAGAAAC-GAGAGATTAACTCGAGTTA-ATCTCTCGTTTCTGCTGGTTTTTG-3' та
5'-AATTCAAAAACCAGCAGAAACGAGA-GATTAACTCGAGTTAATCTCTCGTTTCTGC TGG-3') у вектор pLKO.1 puro (Addgene, США) за центрами пізнавання для ендонук-леаз рестрикції EcoRI і AgeI. Отримані плаз-міди були нароблені й очищені з клітин
E. coli з використанням набору для очищення плазмідної ДНК (NucleoSpin plasmid purification kit, Machery-Nagel, Німеччина). Лентивіруси, що містять Ruk/CIN85 shRNA або scrambled shRNA, одержали шляхом котрансфекції «пакувальних» клітин HEK293T векторами pLKO.1-R19-23 або pLKO.1-scrambled, вектором pMD2.G, що кодує вірусний протеїн капсиду VSV-G (Vesicular stomatitis virus G glycoprotein), та пакувальним вектором psPAX2, що кодує вірусні протеїни gag i pol. Вірус збирали на 36-ту, 48-му і 60-ту год після трансфекції. Після інфікування відповідними лентивіру-сами клітини пасажували кілька разів за присутності селективного антибіотика пуро-міцину без подальшого субклонування.
Вестерн-блот-аналіз. Для дослідження вмісту протеїнів клітини висівали на чашки Петрі (діаметром 6 см). Через 24 год до клітин додавали суспензію, яка містила ленти-вірусні частинки, за присутності катіонного полімеру полібрену (10 мкг/мл), що забезпечувало підвищення ефективності інфікування клітин. Через 24 год середовище змінювали на свіже, що містило селективний антибіотик пуроміцин (1 мкг/мл). Клітини лізували та проводили вестерн-блот-аналіз, як описано у [5] з використанням полікло-нальних антитіл кроля до Ruk/CIN85 (1:3000) [9] та до ß-aктину (1:5000) (Sigma). Імунореактивні смуги детектували за допомогою системи для підсиленої хемілюмінесценції (ECL Western Blotting System, Amersham, Велика Британія). Інтенсивність отриманих сигналів аналізували за допомогою денситометрії з використанням програми ImageJ. Рівень експресії ß-актину визначали для підтвердження однакової кількості протеїну в пробах.
Дослідження рухливості клітин методом «заростання подряпини» у клітинному моношарі. Для проведення експериментів клітини лінії MCF-7 wt та зі стабільною надекспресією Ruk/CIN85 (сублінія G4) висівали у 6-лункові планшети і вирощували до 80% конфлюенту в середовищі DMEM, що містило 10% FBS. Через 24 год після висівання клітини інфікували лентивіруса-ми, які експресували Ruk/CIN85-shRNA або scrambled shRNA. Подряпину у клітинному моношарі робили за допомогою носика на 10 мкл до автоматичних піпеток. Після цього середовище культивування замінювали на свіже, що містило 1 мкМ мітоміцину С (Sigma) для усунення клітинної проліферації. Через 24 год ефективність заростання подряпини аналізували за допомогою
фазово-контрастного мікроскопа. Відстань, на яку мігрували клітини, вимірювали за допомогою програмного забезпечення QuickPHOTO Camera 2.2.
Протокова цитофлуориметрія. Для оцінювання вмісту АБСС2-транспортерів клітини лінії MCF-7 wt зі стабільною надекспре-сією Ruk/CIN85 (сублінія G4) та клітини сублінії G4, інфіковані рекомбінантним лен-тивірусом R22 і відібрані за присутності пуро-міцину (2106 клітин на пробу), фіксували в 96% -му розчині етанолу протягом 30 хв. Після оброблення суспензії 0,1%-м розчином тритону X-100 клітинну суспензію інкубу-вали з антитілами до ABCG2-транспортера (Abcam) протягом 45 хв за кімнатної температури з подальшим відмиванням PBS. Антимишачі антитіла, мічені AlexaFluor488 (Invitrogen), використовували як вторинні. Клітини аналізували на протоковому цито-флуориметрі COULTER EPICS XLTM (Beckman Coulter).
Оцінювання метаболічної активності клітин з використанням МТТ. Активність електронотранспортного ланцюга як показника кількості живих клітин оцінювали за швидкістю відновлення МТТ (3-(4,5-dime-thylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) у клітинах LLC, як описано в роботі [10]. Реакцію проводили у 96-лункових планшетах. Кількість клітин LLC у лунці становила 1104 в об’ємі 200 мкл. У кожну лунку додавали 20 мкл розчину МТТ (4 мг/мл у PBS) та інкубували протягом 2 год при 37 °С. Після інкубації планшети центрифугували (600 g, 7 хв) і зберігали їх у темряві за 4 °С упродовж 20 год. Осад формазану розчиняли у 150 мкл диметилсульфоксиду. Через 15 хв вимірювали екстинкцію на цифровому спектрофотометрі д Quant (BioTEK, США) за X = 570 нм. Метаболічну активність клітин подавали у відсотках відносно контролю.
Визначення продукціїАФК. Внутрішньоклітинні рівні АФК аналізували методом хемілюмінесценції з використанням люмі-нолу, як описано в [11]. Клітини НТ-29 вирощували до 80% конфлюенту у середовищі DMEM, що містило 10% FBS. Далі клітини обробляли розчином акутази (1 хв при 37 °C), промивали PBS (без MgCl2 і CaCl2), осаджували центрифугуванням (1000 g протягом 5 хв) та ресуспендували в холодному розчині hBsS (з MgCl2 і CaCl2). Потім 2105 клітин HT-29 висівали в кожну лунку 96-лункового планшета. До кожної лунки додавали 250 мкM люмінолу та 1 U пероксидази хрону (кінцеві концентрації) в загальному об’ємі 200 мкл. Хемілюмінесценцію вимі-
рювали за допомогою люмінометра FLx800 (BioTek, США) через 5 хв після додавання суміші «пероксидаза хрону/люмінол» протягом 30 хв з інтервалом 1 хв за кімнатної температури.
Статистична обробка результатів. Статистичну обробку результатів проводили у програмі Excel 2007. Експериментальні результати подано як середнє арифметичне та стандартне відхилення вибірки. Достовірність змін оцінювали за t-критерієм Стьюдента.
Результати та обговорення
Експресія shRNA, що пригнічує експресію адаптерного протеїну Ruk/CIN85, у клітинах ссавців
Послідовності shRNA, що гіпотетично можуть пригнічувати експресію Ruk/CIN85, було запропоновано компанією Open Biosystems (Thermo Fisher Scientific, Inc, США). Усього було перевірено п’ять послідовностей: R19 (2435-2455), R20
(1775-1795), R21 (561-581), R22 (2175-2195) та R23 (1082-1102) (у дужках позначено позиції відповідних нуклеотидів на мРНК Ruk/CIN85, загальна довжина якої становить 3348 п. н.). Із цих послідовностей R20, R21, R22 та R23 локалізовані у протеїно-кодувальній ділянці мРНК (рис. 1), а R19 — у 3'-нетрансльованій ділянці мРНК. Лентивірусні вектори для пригнічення експресії Ruk/CIN85 методом РНК-інтерферен-ції (pLKO. 1-shRuk/CIN85 R19-23) одержували, як описано в розділі «Матеріали
і методи». Схему будови однієї з пар оліго-нуклеотидів (R22) наведено на рис. 1, Б.
A
5'
-ИГ
Pro/Ser багата
І}-
Б -Ь І'И І- 1'-' 2 і 1 , 1 4і < <-ru-, .мііі'иьп
5-CCGGCCAGCAGAAACGAGAGATTAACTCGAGTTAATCTCTCGTTTCTGCTGGTTTTTG-3 3-GGTCGTCTTTGCTCTCTCTAATTGAGCTCAATTAGAGAGCAAAGACGACCAAAAACTTAA-3’
U6 промотор
>6 петля —
Рис. 1. Структурна організація повнорозмірного варіанта адаптерного протеїну Ruk/CIN85:
показано SH3A-, SH3B- та SHBG-домени, Pro/Ser-багату ділянку та суперспіралізований (СС) район. Зірочками позначено ділянки протеїну, яким відповідають гіпотетичні shRNA-послідов-ності для РНК-інтерференції (R20, R21, R22, R23). Послідовність R19 комплементарна до 3'-нетрансльованої ділянки мРНК Ruk/CIN85
Геном лентивірусів містить три гени, що розташовані в геномній РНК у порядку 5'-gag-pol-env-3', а також допоміжні гени. З міркувань безпеки лентивірусні вектори, у тому числі pLKO.1 puro, ніколи не несуть гени, необхідні для їх реплікації. Для одержання віріонів клітини «пакувальної» клітинної лінії HEK293T, які експресують великий T-антиген вірусу SV40, трансфіку-вали трьома векторами — лентивірусним (pLKO.1), що містить послідовність для інтеграції в геном, пакувальним (psPAX2), який кодує протеїни gag i pol, та вектором, що кодує протеїн капсиду (pMD2.G) (рис. 2). Супернатант, що містить вірусні частинки, збирали перший раз через 36 год після транс-фекції, а потім ще 2 рази кожні 12 год.
Рис. 2. Схема зараження «клітин-мішеней» лінії MCF-7 лентивірусами, одержаними в «пакувальних» клітинах HEK293T
Було отримано п’ять різних лентивірусів на основі рІКО.Іриго, що містили потенційні послідовності анти-Кик/СШ85 вИИКА (И19-23). Ці віруси додавали (за присутності полібрену) до клітин-«мішеней», зокрема до гліоми С6, яка характеризується високим ендогенним вмістом Иик/СШ85, та аденокарциноми грудної залози людини МСЕ-7 зі стабільною надекспресією Кик/СШ85 (суб-лінія 04). Експресію Кик/СШ85 у лізатах відповідних клітин досліджували за допомогою вестерн-блот-аналізу. Виявили, що одна з потенційних послідовностей, а саме И22, пригнічує експресію гена Кик/СШ85 як у клітинах С6 (рис. 3, А), так і в клітинах лінії МСЕ-7 (рис. 3, Б).
Дослідження впливу пригнічення експресії адаптерного протеїну ЯиЬ/СІИ85 на клітинну міграцію, проліферацію, утворення АФК та експресію транспортера АВС02 в пухлинних клітинах
Подальші дослідження впливу пригнічення експресії Кик/СШ85 на біологічні властивості клітин здійснювали за допомогою експериментального підходу, що його широко використовують для порівняльного аналізу міграційного потенціалу клітин — заростання подряпини у клітинному моно-
шарі. Інфікування клітин G4 лентивірусами, що містили Ruk/CIN85 shRNA (R22), але не scrambled shRNA, супроводжувалося зниженням експресії Ruk/CIN85 приблизно на 70% (рис. 4, А). Через 24 год ефективність заростання подряпини аналізували за допомогою фазово-контрастного мікроскопа.
За результатами, наведеними на рис. 4, рухливість контрольних клітин була приблизно на 40% нижчою порівняно з клітинами субклону G4. Виявлено, що пригнічення експресії Ruk/CIN85 призводило до подальшого посилення рухливості клітин G4 ще на 40% порівняно з контрольними клітинами (рис. 4, Б, В). Наші дані, отримані на клітинах слаботрансформованої лінії аденокарциноми грудної залози людини MCF-7 за умов надекспресії адаптерного протеїну Ruk/CIN85, відрізняються від результатів, одержаних з використанням високоінвазивних ліній раку грудної залози людини MDA-MB-231, MDA-MB-435s та Hs578T. У цих лініях siRNA-опосередкова-не пригнічення експресії ендогенного Ruk/CIN85 зумовлювало інгібування інвазив-них властивостей клітин в Matrigel assay [12].
Відомо, що клітини, які зазнають злоякісної трансформації, характеризуються підвищеною резистентністю до лікарських препаратів. Важливим чинником, що визначає множинну резистентність до лікарських препаратів під час хіміотерапії онкологічних захворювань, є транспортер ABCG2 [8].
Б
Рис. 3. Аналіз експресії Ruk/CIN85 у клітинах гліоми щура С6 (А) та в клітинах аденокарциноми грудної залози людини лінії MCF-7 з надекспресією Ruk/CIN85 (сублінія G4) (Б) після оброблення лентивірусами pLKO.1puro R19-23: клітини, інфіковані scrambled shRNA, використовували як контроль. Вміст протеїну визначали за допомогою вестерн-блот-аналізу
Контр G4 G4
R22
G4
*сг
Ruk'ClNSS ß актин
Б
2 200
ЛІ
Контр
ісг
Коїггр
R22
В
”G4*scr
MuaöN* R22 'SS
Рис. 4. Вестерн-блот-аналіз вмісту Ruk/CIN85 у клітинах лінії MCF-7 «дикого типу» (контроль), клітинах сублінії G4 і клітинах G4, інфікованих лентивірусами, що експресують Ruk/CIN85 shRNA R22 або scrambled shRNA (А). Субконфлюентні моношари клітин лінії MCF-7 «дикого типу» (контроль) або клітин сублінії G4 з високим рівнем стабільної надекспресії Ruk/CIN85 інфікували лентивірусами, що експресували Ruk/CIN85 shRNA R22 або scrambled shRNA (Б).
Подано середні дані з чотирьох експериментів ± SEM. * Статистично значуща відмінність показників клітин сублінії G4 від контрольних за парного порівняння за t-критерієм Стьюдента
і рівнем значущості Р < 0,05.
Типові фотографії зон подряпини перед і після 24 год заростання: показано клітини сублінії G4, інфіковані лентивірусами, що експресують Ruk/CIN85 shRNA R22 або scrambled shRNA (В)
Для того, щоб дослідити зміни в рівні експресії цього транспортера в клітинах MCF-7 з надекспресією Ruk/CIN85, застосовували метод протокової цитофлуориметрії. Було виявлено, що близько 37% клітин сублінії G4 експресують ABCG2 порівняно з 13% контрольних клітин MCF-7 (рис. 5). Пригнічення експресії Ruk/CIN85 призводило до зниження експресії ABCG2 до рівнів, що суттєво не відрізнялись від значень у контрольних клітинах. Одержані дані свідчать про потенційну роль досліджуваного адаптерного протеїну в розвиткові резистентності до проти пух лин них препаратів.
Аби виявити, які ефекти спричинює пригнічення ендогенних рівнів експресії Ruk/CIN85, а також для оцінювання здатності одержаних лентивірусів інфікувати клітини різних типів, було використано клі-
тини мишачої карциноми легені Льюїса (ЬЬС) та аденокарциноми ободової кишки людини НТ-29. За допомогою МТ-тесту встановили, що через 24 год після висівання кількість клітин із пригніченою експресією Кик/СШ85 була майже вдвічі вищою порівняно з контрольними клітинами, що свідчить про посилення проліферації клітин ЬЬС за умов пригнічення експресії ендогенного протеїну Кик/СШ85 (рис. 6). Ці результати загалом узгоджуються з даними щодо клітин лінії MCF-7, для яких показано повільнішу проліферацію за умов надекспресії Иик/СШ85 [5].
Було виявлено, що повне пригнічення експресії Кик/СШ85 призводило до зниження рівня утворення АФК в клітинах НТ-29 приблизно на 72% від значень у контрольних клітинах (рис. 7). Наскільки нам відомо, роль Кик/СШ85 у регулюванні продукції АФК раніше не було описано.
Оскільки зростання активності дихального ланцюга мітохондрій супроводжується підвищеним утворенням АФК, які є побічним продуктом цієї реакції, дані про те, що пригнічення експресії Иик/СШ85 водночас призводить до посилення проліферації та зниження рівнів АФК, можуть видатися суперечливими. Проте слід мати на увазі, що важливим джерелом АФК у клітинах є протеїни плазматичної мембрани, зокрема НАДФН-оксидази [13]. Наші попередні дані вказують на те, що Иик/СШ85 може брати участь у регулюванні НАДФН-оксидазної активності, проте підтвердження цієї гіпотези потребує подальших досліджень.
Таким чином, було одержано лентивірус-ну конструкцію И22, що пригнічує експресію Кик/СШ85 у клітинах С6, НТ-29, ЬЬС, а також в сублінії клітин MCF-7 з надекспресією цього протеїну (04). Результати експресії транспортера АВС02 в клітинах аденокарциноми грудної залози людини лінії MCF-7 свідчать про послаблення однієї з ознак, характерних для злоякісної трансформації, за зниження рівня Кик/СШ85. Дещо несподіваними виявилися результати стосовно вищої рухливості клітин 04 зі зниженим вмістом Кик/СШ85 порівняно з контрольними клітинами. Це можна пояснити тим, що рівень експресії Кик/СШ85 у клітинах 04, інфікованих специфічним лентиві-русом, ще залишався достатньо високим порівняно з контрольними клітинами лінії MCF-7. На сьогодні добре відомо, що адап-терні/риштувальні протеїни регулюють інтенсивність вихідного сигналу у концентраційно-залежний спосіб. Це означає, що
Б
S £ ЗО £о 5
< X
X і 20
о о
jg ä S 5 10
тм ■Ш- л* 1- r о m і
щ 2 ви £ ¡Jfe' 'S 5 CD 0
25« С s
|9892Ч roes 98 934 1.0« 98.90% 1.10Н Б
їв* 10* »?
Ю* 10*
FL1L0G
Рис. 5. FACS (fluorescence-activated cell sorting)- аналіз експресії мембранного транспортера ABCG2 у контрольних клітинах лінії MCF-7, клітинах сублінії G4 та клітинах G4 з пригніченою експресією Ruk/CIN85:
А — точкова (dotplot) гістограма експресії ABCG2; Б — частка (у відсотках) ЛБ002-позитивних клітин від загальної кількості досліджуваних клітин.
* Тут і далі — статистично значуща відмінність показників клітин сублінії G4 від контрольних запарного порівняння за t-критерієм Стьюдента і рівнем значущості Р < 0,05
Рис. 6. Аналіз проліферативної активності контрольних клітин LLC та клітин LLC зі зниженою експресією Ruk/CIN85 за метаболічною активністю, визначеною з використанням МТТ:
А — метаболічну активність клітин з пригніченою експресією Ruk/CIN85 подавали у відсотках відносно активності контрольних клітин, яку було прийнято за 100%. Наведено середні дані з трьох експериментів ± SEM;
Б — вестерн-блот-аналіз експресії Ruk/CIN85 у контрольних клітинах LLC та клітинах, інфікованих лентивірусами, що експресують Ruk/CIN85 shRNA R22
120 л
.S
ш
£
* 2
II
ос
X і X О 4> * Q.
0
1
80
£■ 60 ■
40 ■
20 ■
Б
Ruk/CIN85 ß актин
НТ-29 НТ-29 Scr R22
НТ-29
Scr
НТ-29
R22
Рис. 7. Аналіз утворення АФК у контрольних клітинах НТ-29 та клітинах зі зниженою експресією Ruk/CIN85 методом хемілюмінесценції з використанням люмінолу та пероксидази:
А — утворення АФК в клітинах з пригніченою експресією Ruk/CIN85 виражали у відсотках відносно активності контрольних клітин, яку було прийнято за 100%. Наведено середні дані з трьох експериментів ± SEM. Б — вестерн-блот-аналіз експресії Ruk/CIN85 у контрольних клітинах НТ-29 та в клітинах, інфікованих лентивірусами, що експресують Ruk/CIN85 shRNA R22
надекспресія Кик/СШ85 вище стехіометричного оптимуму може призводити до домінантно-негативного ефекту [14, 15]. Можна припустити, що «оптимальна» концентрація Кик/СШ85, за якої рухливість клітин є максимальною, перевищує рівень контрольних клітин MCF-7, але нижча за рівень у клітинах 04.
Отже, результати вивчення проліфера-тивної активності клітин мишачої карциноми легень ЬЬС та утворення АФК клітинами аденокарциноми ободової кишки людини НТ-29 свідчать про те, що зниження ендо-
генних рівнів Иик/СШ85 змінює біологічні властивості зазначених типів клітин. Для того, щоб краще зрозуміти роль адаптерного протеїну Кик/СШ85 у регулюванні біологічних відповідей пухлинних клітин, необхідні подальші дослідження.
Роботу здійснено за фінансової підтримки цільової комплексної міждисциплінарної програми наукових досліджень НАН України «Фундаментальні основи молекулярних та клітинних біотехнологій», а також спільного українсько-російського гранту між НАН України та РФФД 2012 р.
ЛІТЕРАТУРА
1. Flynn D. C. Adaptor proteins // Oncogene. — 2001. — V. 20, N 44. — P. 6270-6272.
2. Dikic I. CIN85/CMS family of adaptor molecules // FEBS Lett. — 2002. — V. 529, N 1. — P. 110-115.
3. Gout I., Middleton G., Adu J. et al. Negative regulation of PI 3-kinase by Ruk, a novel adaptor protein // EMBO J. — 2000. — V. 19, N 15. — P. 4015-4025.
4. Havrylov S., Redowicz M. J., Buchman V. L. Emerging roles of Ruk/CIN85 in vesicle-mediated transport, adhesion, migration and malignancy // Traffic. — 2010. — V. 11, N 6. — P. 721-731.
5. Samoylenko A., Vynnytska-Myronovska B., Byts N. et al. Increased levels of the HER1 adaptor protein Rukl/CIN85 contribute to breast cancer malignancy // Carcinogenesis. — 2012. — V. 33, N 10. — P. 1976-1984.
6. Sliva K., Schnierle B. S. Selective gene silencing by viral delivery of short hairpin RNA // Virol. J. — 2010. — V. 7. — P. 248.
7. Stewart S. A., Dykxhoorn D. M., Palliser D. et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells // RNA. — 2003. — V. 9, N 4. — P. 493-501.
8. Mo W., Zhang J. T. Human ABCG2: structure, function, and its role in multidrug resistance // Int. J. Biochem. Mol. Biol. 2012. — V. 3, N 1. — P. 1-27.
9. Mayevska O., Shuvayeva H., Igumentseva N. et al. Expression of adaptor protein Ruk/CIN85 isoforms in cell lines of various tissue origins and human melanoma // Exp. Oncol. — 2006. — V. 28, N 4. — P. 275-281.
10. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays // J. Immunol. Meth. — 1983. — V. 65, N 1-2. — P.55-63.
11. Gianni D., Bohl B., Courtneidge S. A. et al. The involvement of the tyrosine kinase c-Src in the regulation of reactive oxygen species generation mediated by NADPH oxidase-1 // Mol. Biol. Cell. — 2008. — V. 19, N 7. — P. 2984-2994.
12. Nam J. M., Onodera Y., Mazaki Y. et al. CIN85, a Cbl-interacting protein, is a component of AMAP1-mediated breast cancer invasion machinery // Embo J. — 2007. — V. 26, N 3. — P. 647-656.
13. Petry A, Weitnauer M, Gorlach A Receptor activation of NADPH oxidases // Antioxid Redox Signal. — 2010. — V. 13, N. 4. — P. 467-487.
14. Ferrell J. E. J. What do scaffold proteins really do? // Sci. STKE. — 2000. — V. 52. — P. e1.
15. Razidlo G.L., Kortum R.L., Haferbier J.L., Lewis R. E. Phosphorylation regulates KSR1 stability, ERK activation, and cell proliferation // J. Biol. Chem. — 2004. — V. 279, N 46. — P. 47808-47814.
ОТВЕТ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК НА ПОДАВЛЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ АДАПТЕРНОГО ПРОТЕИНА RUK/CIN85 РЕКОМБИНАНТНЫМИ ЛЕНТИВИРУСАМИ
А. А. Самойленко1 Н. В. Быць1 А. В. Пасичник1 Н. В. Козлова1 А. В. Базалий1 Д. С. Геращенко1 С. Г. Шандренко1 А. В. Воротников2 Т. Китцманн3
С. В. Комисаренко1 Л. Б. Дробот1
Институт биохимии им. А. В. Палладина НАН Украины, Киев, Украина
2Факультет фундаментальной медицины, МГУ им. М. В. Ломоносова,
Москва, Россия 3Отделение биохимии и Биоцентр Оулу, Университет Оулу, Оулу, Финляндия
Ruk/CIN85 является одним из адаптерных протеинов, играющих важную роль в регулировании процессов пролиферации, подвижности и гибели клетки. Недавно нами было показано, что сверхэкспрессия Ruk/CIN85 усиливает онкогенный потенциал клеток аденокарциномы грудной железы человека линии MCF-7. Цель данного исследования — установить, влияет ли на свойства клеток подавление экспрессии Ruk/CIN85. Для Ruk/CIN85 РНК-интерференции были получены лентивирусные конструкции, содержащие Ruk/CIN85-специ-фические последовательности small hairpin RNA. С помощью полученных рекомбинантных лентивирусов установлено, что подавление экспрессии Ruk/CIN85 влияет на биологические свойства (подвижность, пролиферацию, уровень экспрессии транспортера ABCG2, образование активных форм кислорода) опухолевых клеток разных типов, а именно: аденокарциномы грудной железы человека линии MCF-7, аденокарциномы ободочной кишки человека НТ-29 и мышиной карциномы легких Льюиса.
Ключевые слова: адаптерные протеины,
Ruk/CIN85, РНК-интерференция, лентиви-русные векторы, подвижность клеток, активные формы кислорода.
RECOMBINANT LENTIVIRUS-MEDIATED SILENCING OF ADAPTOR PROTEIN RUK/CIN85 EXPRESSION INFLUENCES BIOLOGICAL RESPONSES OF TUMOR CELLS
A. A. Samoylenko1 N. V. Byts1 G. V. Pasichnyk1 N. V. Kozlova1 A. V. Bazalii1
D. S. Gerashchenko1 S. G. Shandrenko1 A. V. Vorotnikov2 T. Kietzmann3
S. V. Komisarenko1 L. B. Drobot1
1Palladian Institute of Biochemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, Ukraine
2Faculty of Fundamental Medicine, Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia
3Department of Biochemistry and Biocenter Oulu, University of Oulu, Oulu, Finland
Ruk/CIN85 is an adaptor protein that plays important roles in the regulation of cellular processes such as cell death, proliferation and motility. It was recently shown that overexpression of Ruk/CIN85 increases the oncogenic potential of human breast adenocarcinoma MCF-7 cells. It was the aim of the present study to investigate whether inhibition of Ruk/CIN85 expression has an effect on the biological properties of the cells. In order to down-regulate Ruk/CIN85 expression of small interfering RNA-based approach was used. For down-regulation of Ruk/CIN85 lentiviral constructs encoding Ruk/CIN85-spe-cific small hairpin RNA sequences were generated. By using the obtained recombinant lentivi-ruses it was shown that inhibition of Ruk/CIN85 expression influences biological properties (motility, proliferation, ABCG2 expression, and ROS generation) of various tumour cell types such as human breast adenocarcinoma MCF-7, human colorectal adenocarcinoma HT-29, and Lewis mouse lung carcinoma cells.
Key words: adapter proteins, Ruk/CIN85, RNA-interference, lentiviral vectors, cell motility, active oxygen forms.
