CC BY
65
There is a short bridge on the head capsule, pores АFа near to the top of the frontal triangle over setae АF2 and АF1 are. The setae and pores of posterior group are placed in the centre of the head capsule, long P2 and pore Ра can sit close one other. Besides, seta of vertical group V1 is united with pore Рь of posterior group. Very remarkful is the position of pore Аа which is situated under the chaetae А1 and А2.
There are only two lateral chaetae at the first thoracal segment. At all abdominal segments the setae SD2 microscopic by size is. There is seta SV3 at the second abdominal segment. The setae SV1, SV2 and SV3 at the abdominal segments with legs are combined in triangle. Tenth abdominal segment and abdominal legs of Momphidae have very specifical constitution.
Thus, Momphidae separation into an independent family is justified by us.
ОЦЕНКА ВРЕМЕНИ ДИВЕРГЕНЦИИ КОМАРОВ-ЗВОНЦОВ РОДА CHIRONOMUS (DIPTERA) НА ОСНОВЕ ГИПОТЕЗЫ «МОЛЕКУЛЯРНЫХ ЧАСОВ»
А.Г. Дёмин*, Н.В. Полуконова**
*Саратовский государственный университет, **Саратовский государственный медицинский университет
Датировка эволюционных событий при изучении комаров-звонцов всегда представляла одну из трудноразрешимых задач, что связано со сложностью их видовой идентификации при проведении палеонтологических исследований из-за плохой сохранности образцов (Калугина, Жерихин, 1975; Walker, Mathewes, 1987; Ильяшук, Ильяшук, 2002). Установление времени дивергенции важно для решения фундаментальных (определение причин видового разнообразия, распространения и доминирования хирономид в водных экосистемах) и прикладных задач.
Решением проблемы оценки времени дивергенции на молекулярно-генетическом уровне может стать применение гипотезы молекулярных часов (Zuckercandl, Pauling, 1965), согласно которой для любой макромолекулы (ДНК или белка) за равное время во всех ветвях эволюции накапливается равное число мутаций, в результате число различий между последовательностями примерно пропорционально времени дивергенции таксонов. Позднее такое предположение получило объяснение в рамках теории нейтральности молекулярной эволюции (Кимура, 1985), по которой большинство изменений на молекулярном уровне определяется не отбором, а селективно нейтральными или почти нейтральными случайными процессами возникновения мутаций и дрейфа генов. В настоящий момент гипотеза молекулярных часов используется для оценки времени дивергенции различных таксонов (Adachi, Hasegawa, 1995). Считается, что вероятность определения «локальных» молекулярных часов для отдельных групп организмов выше при использовании синонимичных замен в гомологичных генах и при сходстве их физиологии и жизненных циклов (Li,
1997). Для применения гипотезы молекулярных часов наилучшим образом подходит мтДНК (Knowlton et а1., 1993; Russo et а1., 1995; Papoucheva et а1., 2002), так как она высоко консервативна и изменение входящих в её состав генов наиболее согласуется с теорией нейтральности. Основными генами, используемыми для калибровки молекулярных часов у насекомых, являются СуВ, НАДН-дегидрогеназа 4 (КАБИ4), СОИ и С01 ^а11е et а1., 1987; Russo et а1., 1995 и др.).
Цель настоящей работы - оценить время возникновения комаров-звонцов СЫтопотш группы р1итв8ш на основе гипотезы «молекулярных часов» с использованием гена мтДНК - С01.
Материал и методы
Использованы личинки комаров-звонцов, собранные в 2005-2007 гг. (табл. 1). Также использована информация ОепеВапк (www.ncbi.n1m.nih.gov).
Т а б л и ц а 1
Материал и место сбора
Вид Материал Кол-во
Chironomus usenicus Loginova et Beljanina, 1994 Сарат. обл., Новоузенский р-н, оз. Калач, 02.2005, 02.2007 4
Chironomus balatonikus Devai, Wuelker, Scholl, 1983 Сарат. обл., Новоузенский р-н, оз. Калач, 02.2007 1
Chironomus plumosus (Linnaeus, 1758) Сарат. обл., Новоузенский р-н, оз. Калач, 02.2007 2
Chironomus curabilis Beljanina, Loginova, Sigareva, 1990 Сарат. обл., Балаковский, р-н, о. Пустынный, 07.2006 Красноармейский р-н, овр. Данилов, 06.2006 Саратовский р-н, о. Сазанка, 07.2006 1 1 1
Baeotendipes noctivaga Kieffer, 1911 Республика Калмыкия, оросительные каналы, 06.2006 1
Выделение ДНК проводилось набором реактивов Diatom1™ DNA Prep 100 «Изоген» в соответствии с протоколом фирмы-изготовителя; амплификация гена COI - с использованием коммерческого набора реактивов GenePak@ PCR Core «Изоген» в соответствии с протоколом фирмы-изготовителя на термоцик-лере Hybaid; детекция ПЦР-продуктов - с помощью горизонтального электрофореза в пластине 1%-ного агарозного геля с добавлением бромистого этидия. В качестве буфера использовался стандартный трис-боратный буфер. Секвени-рование проводилось на базе ВНИРО г. Москва на секвенаторе ABI 3100 в автоматическом режиме с прямого и обратного праймеров.
Коррекцию последовательностей проводили в программе ChromasPro (www.technelysium.com), выравнивание - ClustalW (www.genebee.msu), особенности нуклеотидной композиции последовательностей, филогенетические построения и время дивергенции рассчитывались с использованием пакета про-
грамм, реализованного в Mega4 (www.megasoftware.net). Генетические расстояния рассчитывались методом p-distance. Филограмма генерировалась с использованием всех трех нуклеотидов кодона, с учетом равенства скоростей эволюции строили методом попарного невзвешенного кластирования с арифметическим усреднением (UPGMA (Sneath, Sokal, 1973)). Для оценки достоверности полученной топологии дерева использовался бутстреп-тест (Bootstrap) (Felsenstein, 1985). Эволюцию реконструировали в виде ультраметрического дерева**. Калибровку часов для Chironomus проводили с использованием данных о скоростях эволюции, рассчитанных для гена COI у других двукрылых насекомых, в том числе Drosophila (Desalle et al., 1987; Jamnongluk et al., 2003 и др.), с учетом рамок скоростей дивергенции последовательности гена в интервале от 1.5% до 2.3% в 1 млн лет, скорости эволюции ДНК от 0.0075 до 0.0115 замен на сайт за 1 млн лет.
Результаты и их обсуждение
Тест на относительность скорости эволюции - «relative rate test», проведенный нами для пары видов Ch. plumosus - Ch. dorsalis, c использованием в качестве внешней группы Drosophila angor с высокой достоверностью показал равенство скоростей эволюции (х2 = 0.02, P*** = 0.89974 >> 0.05). Усредненное для 19 видов Chironomus отношение несинонимических замен (N) к синонимическим (S) - (N/S = 4.88/54.45 = 0.0896 << 1) свидетельствует об отсутствии влияния отбора на эволюцию гена COI в пределах данного рода, что позволяет построить ультраметрическое дерево, отображающее время эволюции Chiro-nomus.
UPGMA-дендрограмма родственных связей Chironomus была получена на основе сравнения частичной последовательности гена COI (595 п.н.) 31 сиквен-са 20 видов комаров-звонцов. Коэффициенты поддержки (КП) в узлах дендро-граммы, вычисленные с помощью бутстреп-теста, проведенного в 2000 по-вторностях, оказались выше 50% для всех основных узлов UPGMA-дерева (рисунок). Молекулярные часы были сбалансированы по скорости эволюции гена COI в диапазоне от 0.0075 до 0.0115 замен на сайт за 1 млн лет. В качестве внешней группы были взяты Baeotendipes sp. и B. noctivaga (Chironomidae, Díptera), филогенетически удаленные от исследуемой группы.
На филограмме 20 видов Chironomus группируются в четыре хорошо дифференцированных кластера (рисунок).
*
Суть метода заключается в том, что расстояние между кластерами вычисляется как среднее арифметическое всевозможных расстояний между последовательностями из кластеров.
** Дерево называется ультраметрическим, если расстояние от корня до любого из листьев одинаково. При этом отклонения от ультраметричности считаются случайными, в результате расстояние между отдельными объектами на ультраметрическом дереве отображает время их дивергенции, а значит, скорость их дивегренции одинакова во всех точках.
*** Значение коэффициента Р служит критерием относительной скорости эволюционной дивергенции таксонов. Так, если Р < 0.05, то скорость дивергенции между двумя таксонами разная, что служит основанием для отклонения гипотезы нейтральности.
10
Филогенетическое дерево рода Chronomus с наложением шкалы дивергенции. Для узлов с бутстреп коэффициентом больше 50% (значения указаны с внешней стороны узла) даны примерные временные рамки дивергенции (значения указаны с внутренней стороны узла). Шкала, приведенная снизу, характеризует максимальное и минимальное время дивергенции в миллионах лет. Квадратными скобками обозначены соответствующие группы видов-двойников
В основании дерева находятся виды Chironomus цитокомплекса pseudo-thummi - Ch. luridus, Ch. pseudothummi, Ch. dorsalis, Ch. thummi piger, образующие кластер IV. Самый крупный кластер верхней части дендрограммы -I (КП 62%) слагают виды-двойники группы plumosus, что свидетельствует о более позднем их происхождении. Промежуточное положение занимает кластер III (КП 59%), включающий Ch. maturus, Ch. whitseli и представителей группы видов-двойников obtusidens - Ch. heterodentatus, Ch. acutiventris. Наиболее близкое положение к кластеру I занимают Ch. annularius и виды-двойники группы lacunarius - Ch. commuttatus, Ch. bernensis, объединяющиеся в кластер II (КП 62%). В целом такая топология дерева рода Chironomus согласуется с вариантами ветвления деревьев, построенных на основе генов CytB, gb2b, ssp160, LANE ретротранспозона, и не противоречит данными цитогенети-
ки (Березиков, 2000; Макаревич и др., 2000; Шобанов, Зотов, 2001; Guryev et al., 2001; Papusheva et al., 2004).
Время обособления группы plumosus варьирует в пределах 5.48.3 млн л. н., группы lacunarius - 2.8-4.3 млн л. н., группы obtusidens - 5.38.5 млн л. н. Результаты проведенной нами молекулярной реконструкции возраста возникновения комаров-звонцов, сопоставленные с данными палеонтологии, приведены в табл. 2.
Т а б л и ц а 2
Примерное время возникновения таксонов комаров-звонцов
Эра Период Эпоха Начало, млн лет Появившийся таксон
Кайнозойская Четвертичный Голоценовая 0.01 Ch. usenicus, Ch. curabilis
Плейстоценовая 1.6 Ch. bernensis
Неогеновый Плиоценовая 5.3 Chironomus группа lacunarius
Миоценовая 23.7 Chironomus группы plumosus, obtusidens
Палеогеновый Олигоценовая 33.7 Chironomus
Эоценовая 57.8 Chironominae
Палеоценовая 66.4
Мезозойская Меловой Поздняя 97.5
Ранняя 144 Chironomidae: Podonominae Tanypodinae
Юрский Поздняя Мальм 163
Средняя Доггер 187
Ранняя Лейас 208
Триасовый Поздняя 230 Diptera
Средняя 240
Ранняя 245
По мнению Калугиной и Жерихина (Калугина, Жерихин, 1975; Калугина, 1980), Chironominae в палеогене (66.4-23.7 млн л. н.) были крайне редки; активное развитие лимнофаун современного типа началось только в неогеновом периоде (23.7-1.6 млн л. н.), а представители рода Chiromomus стали встречаться в массе только c четвертичного периода. Жерихин (1979) считает, что половина представителей плиоценовых (5.3-1.6 млн л. н.) фаун неотличима от современных, средний возраст современных видов насекомых, по его мнению, составляет 4-6 млн лет.
Таким образом, видообразование современных представителей Chirono-mus группы plumosus началось во второй половине неогенового периода и продолжается по сей день, что вполне согласуется с палеолимнологическими данными.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Березиков Е.В. Структурная организация, экспрессия и эволюция гена, кодирующего секреторный белок SSP160 у видов рода Chironomus: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. Новосибирск, 2000. 17 с.
Жерихин В.В. Использование палеонтологических данных в экологическом прогнозировании // Экологическое прогнозирование. М., 1979. С. 113-132.
Ильяшук Е.А., Ильяшук Б.П. Реконструкция исторического прошлого по палеокомплек-сам хирономид из донных отложений // Антропогенные модификации экосистемы озера Имандра. М., 2002. С. 257-283.
Калугина Н.С., Жерихин В.В. Изменения лимнофауны насекомых в мезозое и кайнозое и их экологическая интерпретация // История озер позднего палеозоя и раннего мезозоя: Тез. докл. IV Всесоюз. симпозиума по истории озер. Л., 1975. С. 55-61.
Калугина Н.С. Историческое развитие класса насекомых // Тр. палеотологического общества. 1980. Т. 175. 240 с.
КимураМ. Молекулярная эволюция: Теория нейтральности. М., 1985. 398 с. Макаревич И.Ф., Березиков Е.В., Гурьев В.П., Блинов А.Г. Молекулярная филогения рода Chironomus, основанная на анализе нуклеотидных последовательностей двух ядерных генов, ssp160 и глобина 2b // Молекулярная биология. 2000. Т. 34, № 4. С. 701-707.
Шобанов Н.А., Зотов С.Д. Цитогенетические аспекты филогении рода Chironomus Meigen (Diptera, Chironomidae) // Энтомол. обозр. 2001. Т. 80, № 1. С. 180-193.
Adachi J., Hasegawa M. Phylogeny of whales: Dependence of the inference on species sampling // Molecular Biology and Evolution. 1995. Vol. 12, № 1. P. 177-179.
Desalle. R., Freedman T., Prager E. M., Wilson A.C. Tempo and mode of sequence evolution in mitochondrial DNA of Hawaiian Drosophila // Molecular Evolution. 1987. Vol. 26. P. 157-164.
Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap // Evolution. 1985. Vol. 39. P. 783-791.
Guryev V., Makarevich I., Blinov A., Martin J. Phylogeny of the genus Chironomus (Diptera) inferred from DNA sequences of mitochondrial cytochrome b and cytochrome oxidase I // Molecular Biology and Evolution. 2001. Vol. 19. P. 9-21.
Jamnongluk W., Baimai V., Kittayapong P. Molecular phylogeny of tephritid fruit flies in the Bactrocera tau complex using the mitochondrial COI sequences // Genome. 2003. Vol. 46. P. 112-118.
Knowlton N., Weigt L.A., Solorzano L.A. et al. Divergence in proteins, mitochondrial DNA, and reproductive compatibility across the Isthmus of Panama // Science. 1993. Vol. 260. P. 16291632.
Li W.H. Molecular Evolution. Sunderland: Sinauer Associates, 1997. 145 p. Papucheva E., Proviz V., Lambkin C. et al. Phylogeny of the endemic Baikalian Sergentia (Chironomidae, Diptera) // Molecular Phylogenetics and Evolution. 2002. Vol. 29. P. 120-125.
Papusheva E., GruhlM.C., Berezikov E. at al. The Evolution of SINEs and LINEs in the Genus Chironomus (Diptera) // Molecular Evolution. 2004. Vol. 58. P. 269-279.
Russo C.A., Takezaki N., Nei M. Molecular phylogeny and divergence times of drosophilid species // Molecular Biology and Evolution. 1995. Vol. 12, № 3. P. 391-404.
SneathP.H.A., SokalR.R. Numerical Taxonomy. San Francisco, 1973. 136 p. Walker I.R., Mathewes R. W. Chironomidae Diptera and postglacial climate change at Marion Lake, British Colombia, Canada // Quaternary Research. 1987. Vol. 27. P. 89-102.
Zuckercandl E., Pauling L. Evolutionary divergence and convergence in proteins // In Evolving Genes and Proteins. 1965. Vol. 7. P. 97-165. www.genebee.msu.su/clustal/ www.megasoftware.net www.ncbi.nlm.nih.gov www.technelysium.com
DIVERGENCE TIME ESTIMATION OF CHIRONOMIDS CHIRONOMUS GENUS (DIPTERA) USING THE «MOLECULAR CLOCK» HYPOTHESIS
A.G. Demin*, N.V. Polukonova**
*Saratov State University, **Saratov State Medical University
For the first time divergence time using the «molecular clock» hypothesis determine in relation to Chironomus sibling species group: plumosus, obtusidens and lacunarius. Divergence time of plumosus group vary within the limits of 5.4-8.3 mya, plumosus group - 2.8-4.3 mya, obtusidens group - 5.3-8.5 mya.
МАТЕРИАЛ ПО ШЕЛКОПРЯДАМ (LEPIDOPTERA: LASIOCAMPIDAE) ЕВРАЗИИ И АФРИКИ ДЛЯ АНАЛИЗА НУКЛЕОТИДНОГО ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА ФАКТОРА ЭЛОНГАЦИИ - EF-1a
В.В. Золотухин*, М.В. Кнушевицкая**, А.Г. Дёмин**
* Ульяновский государственный педагогический университет, * *Саратовский государственный университет
Современные очертания границ семейства и классификация родов были даны в работе Дж. Хампсона для видов Западно-Ориентального региона (Hampson, 1892). Но надродовая система семейства до настоящего времени-не упорядочена. В современной литературе принята в основном система, предложенная Ж. Минэ (см. Kristensen, 2001), которая по многим аспектам не вписывается в альтернативные схемы (Zolotuhin, 1996). Недавнее исследование филогенетических взаимоотношений внутри семейства, предпринятое Дж. Риджьером с соавторами (Regier et al., 2000) с использованием выделенных с помощью nuclear gene elongation factor-1a (EP-1a) ядерных генов из 13 видов коконопрядов, внесло ещё большую путаницу в понимание этих взаимоотношений внутри отдельных ветвей семейства. Эти недоработки были частично сняты во второй статье цикла (Regier et al., 2008), правда, не обсуждены, поскольку данная статья не была посвящена специально Lasiocam-pidae. Она рассматривала взаимоотношение между бомбикоидными надсе-мействами, но ряд новых вовлеченных в исследование родов Lasiocampidae (например, примитивный палеарктический Poecilocampa) позволил значительно скорректировать предшествующую авторскую схему. Решение проблемы надродовой систематики семейства коконопрядов - цель настоящего исследования.
Материал и методы
В работе была использована выборка из 78 представителей семейства 49 видов коконопрядов из спиртовой коллекции образцов В.В. Золотухина (таблица), собранных в разных странах Евразии и Африки.
