CC BY
1
Original article
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2022
Читать онлайн
Read online
Габидинова Г.Ф.1, Тимербулатова Г.А.1,2, Даминова А.Г.3, Галялтдинов Ш.Ф.3, Димиев А.М.3, Крючкова М.А.3, Фахруллин Р.Ф.3, Фатхутдинова Л.М.1
Оценка воздействия промышленных одностенных и многостенных углеродных нанотрубок на культуры эпителиальных клеток дыхательных путей человека
1ФГБОУ ВО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 420012, Казань, Россия;
2ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Республике Татарстан (Татарстан)», 420061, Казань, Россия; 3ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет», 420008, Казань, Россия
Введение. В настоящем исследовании проведена сравнительная оценка токсических эффектов промышленных одностенных углеродных нанотрубок (ОУНТ) и многостенных углеродных нанотрубок (МУНТ) в низких дозах, соответствующих производственным экспозициям, на культурах клеток бронхиального эпителия BEAS-2B и альвеолярного эпителия A549.
Материалы и методы. Распределение по размерам агломератов ОУНТ и МУНТ в дисперсиях оценивалось методами динамического светорассеяния и просвечивающей электронной микроскопии. Оценка цитотоксичности проводилась с помощью MTS-теста и определения лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в клеточном супернатанте. Визуализация взаимодействия углеродных нанотрубок (УНТ) с клетками осуществлялась с использованием тем-нопольной и просвечивающей электронной микроскопии.
Результаты. Данные MTS-теста и ЛДГ-теста свидетельствуют о цитотоксичности неочищенных ОУНТ и МУНТ в диапазоне концентраций 50—200 мкг/мл и очищенных ОУНТ в диапазоне 25—200 мкг/мл в отношении клеток BEAS-2B. Показано, что наиболее подходящей моделью для изучения УНТ является клеточная культура бронхиального эпителия человека BEAS-2B. Выявлено, что ОУНТ и МУНТ проникают в цитоплазму клеток BEAS-2B и А549, при этом МУНТ чаще обнаруживаются во внутриклеточном содержимом в виде вакуолизированных скоплений, тогда как единичные и агломераты ОУНТ визуализируются в цитоплазме без тенденции к вакуолизации.
Ограничения исследования. Внесение УНТ в клетки осуществлялось в виде дисперсий, где обнаруживались как единичные нанотрубки, так и их агломераты. Также в настоящем исследовании расчёт концентраций УНТ для внесения в клетки был основан на компьютерном моделировании. Заключение. Различия в проникновении УНТ в клетки могут быть объяснены структурными особенностями: агломераты МУНТ в несколько раз меньше по сравнению с ОУНТ, что облегчает их захват клетками. Дальнейшее изучение механизмов цитотоксического и генотоксического действия разных типов УНТ может способствовать выявлению особенностей воздействия МУНТ и ОУНТ на клетки дыхательной системы для разработки методологических подходов к безопасному использованию УНТ.
Ключевые слова: углеродные нанотрубки; BEAS-2B; A549; цитотоксичность; темнопольная микроскопия; электронная микроскопия
Соблюдение этических стандартов. Исследование не требует представления заключения комитета по биомедицинской этике или иных документов.
Для цитирования: Габидинова Г.Ф., Тимербулатова Г.А., Даминова А.Г., Галялтдинов Ш.Ф., Димиев А.М., Крючкова М.А., Фахруллин Р.Ф., Фатхутдинова Л.М. Оценка воздействия промышленных одностенных и многостенных углеродных нанотрубок на культуры эпителиальных клеток дыхательных путей человека. Гигиена и санитария. 2022; 101(12): 1509-1520. https://doi.org/10.47470/0016-9900-2022-101-12-1509-1520 https://elibrary.ru/ivtviw
Для корреспонденции: Фатхутдинова Лилия Минвагизовна, доктор мед. наук, зав. каф. гигиены, медицины труда ФГБОУ ВО «Казанский государственный медицинский университет» Минздрава России, 420012, Казань. E-mail: [email protected]
Участие авторов: Габидинова Г.Ф. — обзор литературы по теме исследования, культивирование клеток, проведение тестов (ЛДГ) на клетках, статистическая обработка данных, построение рисунков, обобщение полученных результатов; Тимербулатова Г.А. — обзор литературы по теме исследования, культивирование клеток, проведение тестов (MTS) на клетках, построение рисунков, обобщение полученных результатов; Даминова А.Г. — проведение просвечивающей электронной микроскопии, морфометрии суспензий; Галялтдинов Ш.Ф. — подготовка суспензий материалов для внесения в клетки; Димиев А.М. — разработка методов подготовки суспензий материалов для внесения в клетки; Крючкова М.А. — разработка методов визуализации наноматериалов в клетках (темнопольная микроскопия); Фахруллин Р.Ф. — разработка методов визуализации наноматериалов в клетках (темнопольная микроскопия); Фатхутдинова Л.М. — дизайн исследования, анализ материала, редактирование, подготовка статьи к публикации. Все соавторы — утверждение окончательного варианта статьи, ответственность за целостность всех частей статьи.
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов в связи с публикацией данной статьи. Финансирование. Исследование выполнено за счёт средств гранта Российского научного фонда № 22-25-00512, https://rscf.ru/project/22-25-00512/
Поступила: 27.10.2022 / Принята к печати: 08.12.2022 / Опубликована: 12.01.2023
Оригинальная статья
Gulnaz F. Gabidinova, Gyuzel A. Timerbulatova, Amina G. Daminova, Shamil F. Galyaltdinov, Ayrat M. Dimiev, Marina A. Kryuchkova, Rawil F. Fakhrullin, Liliya M. Fatkhutdinova
Evaluation of the impact of industrial single-walled and multi-walled carbon nanotubes on human respiratory tract epithelial cells
1Kazan State Medical University, Kazan, 420012, Russian Federation;
2Center of Hygiene and Epidemiology in the Republic of Tatarstan, Kazan, 420061, Russian Federation; 3Kazan Federal University, Kazan, 420008, Russian Federation
Introduction. In the present study, a comparative assessment of the toxic effects of industrial single-walled and multi-walled carbon nanotubes (SWCNT and MWCNT) at doses corresponding to industrial exposures on BEAS-2B and A549 cells was carried out.
Materials and methods. The size distribution of SWCNT and MWCNT agglomerates in dispersions was estimated by dynamic light scattering and transmission electron microscopy. Cytotoxicity was assessed using a MTS test and LDHassay. The interaction of CNTs with cells was visualized using dark-field and transmission electron microscopy.
Results. Cytotoxic effects of pristine SWCNT and MWCNT in concentrations of50—200^g/ml and purified SWCNT in the range of25—200^g/ml were found in BEAS-2B cells. SWCNT and MWCNT were found to penetrate into the cytoplasm of both BEAS-2B and A549 cells, while MWCNT are more often revealed in the intracellular content as vacuolized clusters, and single SWCNT and agglomerates are visualized in the cytoplasm without a tendency to vacuolization. Limitations. CNT were introduced into cells in the form of dispersions, where both single nanotubes and their agglomerates were found. The calculation of CNT concentrations for introduction into cells was based on computer simulation.
Conclusion. Further study of the mechanisms of cytotoxic and genotoxic effects of different types of carbon nanotubes (CNT) may contribute to the identification of MWCNT and SWCNT specific effects on the cells of the respiratory system to develop methodological approaches to the safe use of CNT.
Keywords: carbon nanotubes; BEAS-2B; A549; cytotoxicity; dark-field microscopy; electron microscopy
Compliance with ethical standards. The study does not require submission of the opinion of the biomedical ethics committee or other documents.
For citation: Gabidinova G.F., Timerbulatova G.A., Daminova A.G., Galyaltdinov Sh.F., Dimiev A.M., Kryuchkova M.A., Fakhrullin R.F., Fatkhutdinova L.M. Evaluation of the impact of industrial single-walled and multi-walled carbon nanotubes on human respiratory tract epithelial cells. Gigiena i Sanitariya (Hygiene and Sanitation, Russian journal). 2022; 101(12): 1509-1520. https://doi.org/10.47470/0016-9900-2022-101-12-1509-1520 https://elibrary.ru/ivtviw (In Russian)
For correspondence: Liliya M. Fatkhutdinova, MD, PhD, head of the Department of Hygiene and Occupational Medicine, Kazan, 420012, Russian Federation. E-mail: [email protected]
Information about the authors:
Gabidinova G.F., https://orcid.org/0000-0003-2616-5017 Timerbulatova G.A., https://orcid.org/0000-0002-2479-2474
Daminova A.G., https://orcid.org/0000-0002-7672-4430 Galyaltdinov Sh.F., https://orcid.org/0000-0002-9494-5288
Dimiev A.M., https://orcid.org/0000-0001-7497-1211 Kryuchkova M.A., https://orcid.org/0000-0002-6946-0553
Fakhrullin R.F., https://orcid.org/0000-0003-2015-7649 Fatkhutdinova L.M., https://orcid.org/0000-0001-9506-563X
Contribution: Gabidinova G.F. — literature review on the topic of research, cell cultivation, tests (LDH) on cells, statistical data processing, preparation of pictures, generalization of the results; Timerbulatova G.A. — literature review on the topic of research, cell cultivation, tests (MTS) on cells, preparation of pictures, generalization of the results; Daminova A.G. — transmission electron microscopy, suspension morphometry, generalization of the obtained results; Galyaltdinov Sh.F. — preparation of suspensions of materials for introduction into cells; Dimiev A.M. — development of methods for preparing suspensions of materials for introduction into cells; Kryuchkova M.A. visualization of nanomaterials in cells (dark field microscopy); Fakhrullin R.F. — visualization of nanomaterials in cells (dark field microscopy); Fatkhutdinova L.M. — material analysis; editing; preparing an article for publication. All authors are responsible for the integrity of all parts of the manuscript and approval of the manuscript final version.
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Acknowledgment. The study was supported by the Russian Science Foundation grant № 22-25-00512, https://rscf.ru/project/22-25-00512/ Received: October 27, 2022 / Accepted: December 8, 2022 / Published: January 12, 2023
Введение
Уникальные физические и химические свойства углеродных нанотрубок (УНТ) обусловливают их широкое применение в различных областях, включая производство электронной техники, сенсоров, высокопрочных волокон, композитных материалов [1, 2]. Кроме того, УНТ рассматриваются как перспективные материалы для использования в биомедицинских областях [3]. УНТ представляют собой свёрнутые в трубку листы графена. Одностенные углеродные на-нотрубки (ОУНТ) состоят из одного цилиндрического листа графена, а многостенные углеродные нанотрубки (МУНТ) — из нескольких структурообразующих слоёв. Растущие объёмы производства УНТ и увеличение числа предприятий, производящих и использующих данный вид наноматериа-лов, приводят к увеличению числа лиц, подвергающихся воздействию аэрозолей УНТ на рабочих местах [4].
Ингаляционный путь поступления определяет дыхательную систему как наиболее вероятную мишень токсического действия нанотрубок. При изучении токсичности УНТ в экспериментах in vitro взаимодействие УНТ с дыхательными путями чаще всего моделируют на культурах клеток бронхи-
ального эпителия человека BEAS-2B и альвеолярного эпителия лёгких человека A549 [2]. Обзор статей по изучению токсического действия УНТ на клетки дыхательной системы описывает такие эффекты воздействия нанотрубок, как снижение жизнеспособности клеток, индукция апоптоза, повреждение генетического материала, нарушение барьерных функций и развитие фиброза [5]. Многие исследователи отмечают способность клеток дыхательных путей к поглощению как ОУНТ, так и МУНТ с последующей их локализацией в цитоплазме или в ядре [6—8].
Данные о сравнительной токсичности ОУНТ и МУНТ в экспериментах in vitro являются немногочисленными и противоречивыми. Авторы сообщают о большей цитотоксично-сти ОУНТ по отношению к клеткам человека и животных, в то время как МУНТ проявляют меньшую активность [9—11]. В других исследованиях не показаны различия в цитотокси-ческих эффектах при воздействии разных видов углеродных нанотрубок [12—14]. Однако следует учитывать, что по результатам экспериментов in vivo МУНТ-7 (производитель Mitsui Ltd., Япония) классифицированы как возможный канцерогенный фактор для человека и отнесены Международным агентством по изучению рака (МАИР) к категории 2B [15].
Original article
Таблица 1 / Table 1
Физико-химическая характеристика очищенных и неочищенных ОУНТ и МУНТ Physico-chemical characteristics of pristine and purified SWCNTs and MWCNTs
Физико-химическая характеристика Physical-chemical characteristics
Неочищенные ОУНТ TUBALL™
Pristine single-walled carbon nanotubes (SWCNT) TUBALL™
Очищенные ОУНТ TUBALL™ Purified SWCNT TUBALL™
МУНТ Таунит-М
Multi-walled carbon nanotubes (MWCNT) Taunit-M
Металлические примеси Metal impurities
Длина, мкм / Length, ^m
Средний диаметр УНТ, нм
Average carbon nanotubes (CNT) diameter, nm
Полная удельная поверхность, м2/г Total surface area, m2/g
14 i 1% от массы / of mass
> 5 1.6 i 0.4
410
менее 1% от массы less 1% of mass
> 5
1.6 ± 0.4
490
до 5% от массы up to 5% of mass
> 2
8-15
300-320
Противоречивые результаты могут быть объяснены различными механизмами токсического действия ОУНТ и МУНТ, которые реализуются в зависимости от структурных характеристик материалов и особенностей взаимодействия с клетками в условиях in vitro. Например, при изучении влияния ОУНТ и МУНТ в концентрациях 2,5 и 25 мкг/мл на клетки бронхиального эпителия человека 16HBE было обнаружено, что разные виды углеродных на-нотрубок индуцируют разные пути гибели клетки: воздействие ОУНТ приводило к активации запрограммированной гибели клеток и ороговению, а при действии МУНТ запускались процессы аутофагии [16]. Физико-химические особенности нанотрубок, в частности длина и размер, могут влиять на их проникновение в клетки [17—19]. Сравнение проникновения ОУНТ и МУНТ в клетки гепатоцеллюляр-ной карциномы человека HepG2 продемонстрировало, что УНТ с меньшими длиной и наружным диаметром обнаруживаются во внутриклеточном содержимом, тогда как УНТ больших размеров в клетки не поступают [18]. Изучение действия МУНТ разной длины на клетки гиппокампа мыши и клетки феохромоцитомы с использованием метода просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) показало, что короткие нанотрубки легче проникают через мембрану, действуя как «наноиглы», в то время как длинные нанотрубки располагаются в виде «пучков», что снижает эффективность проникновения [19]. Более свободное поступление коротких УНТ в клетки может обусловливать большую токсичность, что подтверждается результатами исследований: короткие УНТ оказывают значительно выраженное токсическое действие в экспериментах in vitro и in vivo [20, 21].
Анализ концентраций УНТ в экспериментах in vitro показывает, что лишь в некоторых случаях используемые концентрации совпадают с производственными экспозициями, в то время как в большинстве исследований изучаемые концентрации превышают производственные в несколько десятков раз [2, 22—24]. Большой объём накопленных данных о производственных экспозициях на рабочих местах предприятий — производителей углеродных нанотрубок [25] позволяет оценивать их эффекты в меньшем диапазоне концентраций. Существует необходимость исследования токсичности УНТ в более низких концентрациях, соответствующих реальным экспозициям на рабочих местах.
В настоящем исследовании проведена сравнительная оценка токсических эффектов промышленных одностен-ных и многостенных УНТ в низких дозах, соответствующих производственным экспозициям, на культурах клеток бронхиального эпителия BEAS-2B и альвеолярного эпителия A549.
Материалы и методы
С учётом преимущественно ингаляционного пути поступления УНТ [25, 26] для исследования были выбраны им-мортализованные клетки нормального человеческого бронхиального эпителия BEAS-2B (Cell Applications, Inc., США), представляющие собой клетки нижних дыхательных путей, и клетки альвеолярного эпителия лёгких человека линии A549 (Cell Applications, Inc., США).
В качестве материала для исследования использовались очищенные и неочищенные от металлических примесей ОУНТ TUBALL™ (производитель — группа компаний OCSiAl) и МУНТ Таунит-М (производитель - ООО «Нано-ТехЦентр»). Физико-химическая характеристика используемых материалов представлена в табл. 1.
Диапазон концентраций исследуемых материалов, соответствующих производственным экспозициям, был рассчитан с учётом предварительных данных о концентрации и дисперсности УНТ в воздухе рабочей зоны предприятий -производителей ОУНТ и МУНТ. С учётом данных, полученных в ходе компьютерного моделирования депонирования аэрозоля УНТ в различных отделах лёгких человека с использованием свободно распространяемой программы MPPD (Multiple Path Particle Dosimetry V3.04) [27], и данных открытых источников литературы диапазон концентраций для исследования составил 0,0006-200 мкг/мл, включая широкий набор нетоксичных и потенциально токсичных доз УНТ.
Дисперсии исследуемых материалов были подготовлены на основе культуральной среды Bronchial Epithelial Cell Growth Medium (BEGM) (Sigma-Aldrich, 511K-500, Германия) с добавлением 10%-й эмбpиoнaльнoй телячьей сыворотки (ЭТС) и культуральной среды Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (ПанЭко, С410П, Россия) с добавлением 10%-й ЭТС.
Приготовление дисперсий проводили в асептических условиях (в биобоксе) методом ультразвуковой обработки с использованием аппарата Sonic Vibra Cell Sonicator (Sonics&Materials, США) при следующих параметрах работы: 750 Ватт, 20 кГц, 40%-я амплитуда, пульс 5/6, время 30 мин [28]. Изначально были подготовлены дисперсии УНТ в исходной концентрации 0,2 мг/мл, из которой получали необходимые разведения для экспериментов.
Характеристика дисперсий. Контроль качества полученных дисперсий ОУНТ и МУНТ проводили методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) на базе Междисциплинарного центра «Аналитическая микроскопия» ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» (КФУ). Образцы дисперсий наносили по 5 мкл на медные сеточки с подложкой Formvar/Carbon (Electron
Оригинальная статья
Microscopy Sciences, США). Анализ образцов проводили с помощью аппаратного комплекса ПЭМ атомарного разрешения для исследования нанообъектов Hitachi HT7700 Exalens (Япония). Для количественной оценки агломератов ОУНТ и МУНТ в дисперсиях использовали программное обеспечение ImageJ (National Institutes of Health, США).
Распределение по размерам агломератов ОУНТ и МУНТ в полученной дисперсии дополнительно оценивалось методом динамического светорассеяния при помощи анализатора Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, Великобритания) Центра коллективного пользования ФГБОУ ВО Казанский ГМУ Минздрава России (ЦКП Казанский ГМУ). Измерение проводили при температуре плюс 25 °C. Каждый образец помещали в одноразовую кювету из полистирола (Brand, Германия) и анализировали не менее трёх раз, одно измерение состояло из 15 повторов длительностью по 10 с каждый.
В процессе размола, упаковки или обработки материалы (ОУНТ, МУНТ) могут быть загрязнены бактериальными эндотоксинами (липополисахаридами — основными структурными компонентами наружной клеточной стенки грамотри-цательных бактерий), вызывающими различные побочные реакции при воздействии на биологические объекты [29], поэтому приготовленные дисперсии дополнительно были протестированы на наличие бактериального эндотоксина с помощью ЛАЛ-реактива (Endosafe KTA, серия K2422L, Charles River Endosafe, США) с использованием турбиди-метрического кинетического метода1 на базе НПО «ЛАЛ-центр» (г. Москва).
Клеточные линии культивировали в CO2-инкубaтope (LАМSYSТЕМS ИЛМ-170, Миасс, Россия) при стандартных условиях: температура плюс 37 °С, 5%-й CO2. Клетки BEAS-2B засевали в культуpaльную среду BEGM c добавлением 10%-й ЭТС, а клетки A549 — в культуральную среду DMEM с добавлением 10%-й ЭТС. Проведение клеточных экспериментов осуществлялось на базе ЦКП Казанский ГМУ.
Через 72 ч после внесения дисперсий исследуемых материалов проводили оценку цитотоксичности и визуализация УНТ в клетках BEAS-2B и А549.
Оценка цитотоксичности. Оценку цитотоксичности проводили с помощью колометрического MTS-теста (Promega, США), основанного на оценке мeтaбoличecкoй активности клеток, отражающей их жизнеспособность. В эксперименте исследовали 18 концентраций в диапазоне от 0,0006 до 200 мкг/мл; оценку результатов теста MTS-теста проводили путём сопоставления оптической плотности в опытных и контрольных лунках. Для достижения статистической достоверности каждая концентрация материала была исследована в трёх повторностях2. Измерение оптической плотности осуществляли с помощью планшетного фотоколориметра Multiskan (Thermo Fisher Scientific, США) при длине волны 492 нм.
Оценку целостности плазматической мембраны проводили путём исследования высвобождения фермента лактатдегидрогеназы (ЛДГ) с помощью набора LDH Assay Kit ^bcam, UK) в культуральной среде клеток, подвергшихся воздействию УНТ в течение 72 ч. В эксперименте изучали 4 концентрации исследуемых УНТ (100; 50; 0,03 и 0,0006 мкг/мл). Клетки без воздействия УНТ использовали в качестве контроля, а клетки, подвергшиеся воздействию 1%-го раствора Triton X-100, использовали в качестве положительного контроля цитотоксичности. Для достижения статистической достоверности каждая концентрация ма-
1 Государственная фармакопея Российской Федерации XIV издания (ГФ РФ XIV) (утв. приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации 31 октября 2018 г.). Доступно: Шрз:// minzdrav.gov.ru/ministry/61/11/gosudarstvennaya-farmakopeya-rossiyskoy-federatsii-xiv-izdaniya
2 Методические указания МУ 1.2.2635-10 «Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов» (утв. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 24 мая 2010 г.). Справочно-правовая система «ГАРАНТ». Доступно: https://www.garant.ru/
териала исследовалась в трёх повторностях2. Поглощение измеряли при 450 нм с использованием планшетного фотоколориметра Multiskan (Thermo Fisher Scientific, США). Данные для контрольных и экспонированных клеток рассчитывали и выражали в виде процента цитотоксичности, представляющего среднее значение трёх лунок для каждой концентрации. Для каждого эксперимента процент цитотоксичности рассчитывали по формуле:
Цитотоксичность (%) = среднее (клетки под воздействием УНТ) — среднее (контроль) среднее (позитивный контроль) — среднее (контроль)
Визуализация УНТ с использованием метода темнополь-ной микроскопии. Микроскопию клеточных культур проводили на микроскопе Olympus BX51 (Япония), оснащённом темнопольным конденсором CytoViva® для визуализации в режиме тёмного поля с масляной иммерсией [30, 31]. Исследования выполнены на базе научно-исследовательской лаборатории «Бионанотехнологии» КФУ. Темнопольные изображения были получены с использованием полуапохро-матического объектива Olympus (*100, переменная числовая апертура 0,6-1,3), CCD-видеокамеры Dage xL и программного обеспечения Exponent 7 (Dage-MTI, США). Применение темнопольной микроскопии позволяет визуализировать наноразмерные частицы в клетках [30, 31]. Результаты тем-нопольной микроскопии оценивали через 72 ч в концентрации 100 мкг/мл в клеточных культурах BEAS-2B, А549.
Визуализация УНТ с использованием метода ПЭМ. Для исследования на ПЭМ были выбраны образцы клеток BEAS-2В и А549 под действием концентрации 100 мкг/мл с периодом экспозиции 72 ч. УНТ фиксировали для электронной микроскопии по стандартному протоколу. Образцы были зафиксированы последовательно в глутаровом альдегиде и тетраоксиде осмия, обезвожены и полимеризованы в эпоксидную смолу Epon (Electron Microscopy Sciences, США). Ультратонкие срезы клеток толщиной 50-80 нм получали на ультрамикротоме Leica EM UC7 (Leica Microsystems GmbH, Германия), помещали на медные сеточки с подложкой Formvar/Carbon и окрашивали в течение 20 мин насыщенным водным раствором уранилацетата и 5 мин цитратом свинца. Срезы просматривали в просвечивающем электронном микроскопе Hitachi HT 7700 Exalens при ускоряющем напряжении 100 кэВ.
Статистическая обработка. Полученные данные обрабатывали с помощью компьютерной программы Microsoft Excel 2007. Для оценки достоверности различий изучаемых выборок применяли ¿-критерий Стьюдента. При р < 0,05 различия считали статистически значимыми. Полученные результаты представлены в виде среднего арифметического значения плюс-минус стандартное отклонение.
Результаты
Характеристика дисперсий ОУНТ и МУНТ. Физико-химическая характеристика трёх типов УНТ представлена в табл. 1.
По данным динамического светорассеяния в дисперсиях ОУНТ и МУНТ, подготовленных на основе культуральной среды BEGM и на основе культуральной среды DMEM, преобладали агломераты размером до 1000 нм (табл. 2).
При оценке морфометрических характеристик УНТ в суспензии с использованием ПЭМ было показано, что наружный диаметр всех исследованных материалов находится в одном диапазоне (табл. 3). Средняя длина агломератов УНТ в дисперсии меньше, чем заявлено производителем. Такое изменение длины УНТ может быть связано как с проведением ультразвуковой обработки во время подготовки дисперсий, так и с тем, что УНТ в дисперсии, как правило, представлены преимущественно в виде скоплений из-за склонности их к агломерации. На рис. 1 приведены ПЭМ-изображения дисперсии неочищенных, очищенных ОУНТ и
Original article
Таблица 2 / Table 2 Результаты ДСР по распределению размеров агломератов УНТ (средний размер агломератов, нм) (X ± а) DLS results on the size distribution of CNT agglomerates (average size of agglomerates, nm) (X ± а)
Агломерат УНТ CNT agglomerates
Культуральная среда с добавлением 10%-й бычьей сыворотки (средний размер агломератов УНТ, нм) Culture medium supplemented with 10% bovine serum (average size of CNT agglomerates, nm)
BEGM
DMEM
Неочищенные ОУНТ / Pristine SWCNT Очищенные ОУНТ / Purified SWCNT МУНТ / MWCNT
578.33 ± 71.67 806.37 ± 34.48 207.4 ± 1.54
604.4 ± 23.07 847.43 ± 27.30 242.37 ± 3.11
Результаты ПЭМ по распределению размеров УНТ (средний размер агломератов, нм) (X ± а) TEM results on CNT size distribution (average size of agglomerates, nm) (X ± а)
Таблица 3 / Table 3
Агломерат УНТ CNT agglomerates
Культуральная среда с добавлением 10%-й бычьей сыворотки (средний размер агломератов УНТ, нм) Culture medium supplemented with 10% bovine serum (average size of CNT agglomerates, nm)
BEGM
наружный диаметр, нм outer diameter, nm
длина, мкм length, цт
DMEM
наружный диаметр, нм outer diameter, nm
длина, мкм length, цт
Неочищенные ОУНТ / Pristine SWCNT 6.299 ± 4.436 Очищенные ОУНТ / Purified SWCNT 8.807 ± 5.312
МУНТ / MWCNT 7.667 ± 3.814
1.646 ± 0.980 0.653 ± 0.554 0.242 ± 0.132
9.287 ± 1.225 12.585 ± 1.060 12.896 ± 2.604
1.156 ± 0.112 1.258 ± 0.075 0.485 ± 0.063
МУНТ в клеточных средах ВБОМ и БМБМ. УНТ в дисперсиях представлены как единичными нанотрубками, так и их скоплениями. В случае с неочищенными ОУНТ на рисунках также можно наблюдать наличие примесей.
Оценка цитотоксичности. По результатам МТ8-теста выявлено снижение жизнеспособности клеток ВБЛ8-2В на 34, 27 и 23% при экспозиции в течение 72 ч к МУНТ в концентрациях 200, 100 и 50 мкг/мл соответственно (рис. 2, а). При таких же концентрациях были отмечены значимые отличия в жизнеспособности клеток по сравнению с кон-
тролем при воздействии неочищенных ОУНТ: через 72 ч после экспозиции выжили 62, 72 и 90% клеток бронхиального эпителия при концентрациях 200, 100, 50 мкг/мл соответственно (рис. 2, б). Цитотоксические эффекты наблюдались на более низких концентрациях для очищенных ОУНТ: дозозависимое снижение жизнеспособности клеток по сравнению с контролем зафиксировано на концентрациях 200, 100, 50 и 25 мкг/мл (рис. 2, в). Процент выживших клеток составил 65, 68, 70 и 86% на соответствующих концентрациях.
ШШЙ
Рис. 1. Просвечивающая электронная микроскопия дисперсий УНТ в средах BEGM с 10% бычьей сывороткой (200 нм): а - МУНТ; б - ОУНТ
(неочищ.); в - ОУНТ (очищ.); DMEM c 10% бычьей сывороткой: г - МУНТ; д - ОУНТ (неочищ.); е - ОУНТ (очищ.). Fig. 1. Transmission electron microscopy of CNT dispersions in BEGM media with 10% bovine serum (200nm): а - MWCNT;, б - SWCNT (pristine); в - SWCNT (purified); DMEM with 10% bovine serum: г - MWCNT; д - SWCNT (pristine); е - SWCNT (purified).
Рис. 2. Цитотоксическая активность исследуемых материалов в отношении клеток линии BEAS-2B; среднее значение ± стандартное отклонение выживаемости клеток в MTS-тесте после 72-часовой экспозиции исследуемых материалов: а - МУНТ; б - ОУНТ (неочищ.); в - ОУНТ (очищ.).
* - p < 0,05 по сравнению с контролем.
Fig. 2. Cytotoxic activity of the studied materials to the BEAS-2B cells; mean value ± standard deviation of cell survival in the MTS test after 72-hour exposure to the studied materials: а - MWCNT; б - SWCNT (pristine); в - SWCNT (purified).
* - p < 0.05 compared to control.
Оригинальная статья
* 2
0 CD
^ Ci
1 !E
CO CP
E
о TZ
О о
s ° is
CD
CO -г
^ CO
-0 CO
m c^
^ m
5 £
к м
о е d
т лео р т re
е л к ar p m
и н
b о к 8 2
о о CO c=
м е а m и и н |8
и е s
н
Л CO cel
.0 а
m р
s? о
5s m
к м
о е d
т лео р т re
е л к ar p m
и н
b о к О TZ lc tor
о о го с
м е а m и и н |8 = в
и е s
н
CO cel
IS а
CO р
s? о
m
120 100 80 60 40 20
0
%
X X
X X X
X X X
X X X
X X X
X X X
X X X
X X X
X X X
u.uuuou.uui u.uuou.uuo u.ui 0.025 0.05 0.1 0.3 0.7 1.5 3 6 12 25 50 100 200 Концентрация МУНТ, мкг/мл (MWCNT concentrations, jg/ml)
120 -i 100 80 60 40 20 0
а
0.0006 0.001 0.003 0.006 0.01 0.025 0.05 0.1 0.3 0.7 1.5 3 6 12 25 50 100 200 Концентрация ОУНТ (неочищ.), мкг/мл SWCNT (pristine) concentrations, jg/ml
б
120 100 80 60 40 20
Й
я i
<sft
u.uuuo u.uui и.ииз u.uut> u.u i 0.025 0.05 0.1 0.3 0.7 1.5 3 6 12 25 50 100 200 Концентрация ОУНТ (очищ.), мкг/мл SWCNT (purified) concentrations, |jg/ml
0
в
100 и 80 60 40 20 0
-20 J
Контроль
0.0006
0.03
50
Концентрация ОУНТ (очищ.), мкг/мл SWCNT (purified) concentrations, jg/ml
100
□ ОУНТ (очищ.) / SWCNT (purified) Щ ОУНТ (неочищ.) / SWCNT (pristine) И МУНТ / MWCNT
Рис. 3. Цитотоксическая активность исследуемых материалов в отношении клеток линии BEAS-2B; среднее значение ± стандартное отклонение по данным ЛДГ-теста после 72-часовой экспозиции исследуемых материалов; * - p < 0,05 по сравнению с контролем.
Fig. 3. Cytotoxic activity of the studied materials to the BEAS-2B cells; mean value ± standard deviation according to the LDH assay after 72-hour
exposure to the studied materials; * - p < 0.05 compared to control.
Original article
О CD
5 Ü
0 s ° о
О о ¡5 |
® È Ш ^ m x
■> о ^ о
CD w
s m -û га m ср
в4 m
120 100 80 60 40 20 0
0.00060.001 0.0030.006 0.01 0.025 0.05 0.1 0.3 0.7 1.5 3 6 12 25 50 100 200
Концентрация МУНТ, мкг/мл (MWCNT concentrations, |jg/ml)
к м ое
È I
2 о
T3
re ar
Œ
m
О -xz
clo tor
I8
CD w
4тш £
m ci „
120 100 80 60 40 20 0
IS**
0.00060.0010.0030.006 0.01 0.025 0.05 0.1 0.3 0.7 1.5 3
Концентрация ОУНТ (неочищ.), SWCNT (pristine) concentrations, б
6 12 мкг/мл jg/ml
25 50 100 200
к м
О CDT3 CD о «
^ cPg.
Î5 i 8s О о ¡5 |
е а m х
о
o
е
£
з И
2 ш -û га m ci
04 m
120 100 80 60 40 20
4.0
0
ï
i
i
ï
0.00060.001 0.003 0.006 0.01 0.025 0.05 0.1 0.3 0.7 1
Й ä n
i R
ï
I ■ I I I I 'I
3 6 12 25 50 100 200
Концентрация ОУНТ (очищ.), мкг/мл SWCNT (purified) concentrations, jg/ml
а
в
Рис. 4. Цитотоксическая активность исследуемых материалов в отношении клеток линии А549; среднее значение ± стандартное отклонение выживаемости клеток в MTS-тесте после 72-часовой экспозиции исследуемых материалов: а - МУНТ; б - ОУНТ (неочищ.); в - ОУНТ (очищ.).
Fig. 4. Cytotoxic activity of the studied materials to the A549 cells; mean value ± standard deviation of cell survival in the MTS test after 72-hour exposure of the studied materials: а - MWCNT; б - SWCNT (pristine); в - SWCNT (purified).
20
10
J
I Lip
Контроль
0.0006
0.03
50
100
□ ОУНТ (очищ.) / SWCNT (purified) Щ ОУНТ (неочищ.) / SWCNT (pristine) И МУНТ / MWCNT
Концентрация ОУНТ (очищ.), мкг/мл SWCNT (purified) concentrations, pg/ml
Рис. 5. Цитотоксическая активность исследуемых материалов в отношении клеток линии А549; среднее значение ± стандартное отклонение
по данным ЛДГ-теста после 72-часовой экспозиции исследуемых материалов. Fig. 5. Cytotoxic activity of the studied materials to the A549 cells; mean value ± standard deviation according to the LDH assay after 72-hour exposure
to the studied materials.
0
Оригинальная статья
Рис. 6. Визуализация проникновения УНТ в цитоплазму клеток посредством темнопольной микроскопии. Клетки BEAS-2B под действием исследуемых материалов в концентрации 100 мкг/мл: а - контроль (клеточная среда BEGM); б - МУНТ; в - неочищенные ОУНТ; г - очищенные ОУНТ.
Fig. 6. Visualization of CNT penetration into the cell cytoplasm by dark-field microscopy. BEAS-2B cells exposed to test materials at a concentration of 100 мд/ml: а - control (BEGM cell medium); б - MWCNT; в - pristine SWCNT; г - purified SWCNT.
Рис. 7. Визуализация проникновения УНТ в цитоплазму клеток посредством темнопольной микроскопии. Клетки А549 под действием исследуемых материалов в концентрации 100 мкг/мл: а - контроль (клеточная среда BEGM); б - МУНТ; в - неочищенные ОУНТ; г - очищенные ОУНТ.
Fig. 7. Visualization of CNT penetration into the cell cytoplasm by dark-field microscopy. A549 cells exposed to test materials at a concentration of 100 pg/ml: а - control (BEGM cell medium); б - MWCNT; в - pristine SWCNT; г - purified SWCNT.
Рис. 8. Просвечивающая электронная микроскопия клеток BEAS-2B после 72-часовой экспозиции исследуемых материалов (500 нм): а - клетки без воздействия; б - МУНТ; в - ОУНТ неочищ.; г - ОУНТ очищ. (стадия взаимодействия УНТ с клеткой).
Fig. 8. Transmission electron microscopy of BEAS-2B cells after 72-hour exposure of the studied materials (500 nm): а - untreated cells; б - MWCNT;
в - pristine SWCNT; г - purified SWCNT (stage of CNT interaction with the cell).
Original article
Рис. 9. Просвечивающая электронная микроскопия клеток BEAS-2B после 72-часовой экспозиции исследуемых материалов (1 мкм):
а - клетки без воздействия; б - МУНТ; в - ОУНТ неочищ.; г - ОУНТ очищ. (частицы УНТ в цитоплазме клеток). Fig. 9. Transmission electron microscopy of BEAS-2B cells after 72-hour exposure of the studied materials: а - untreated cells; б - MWCNT; в - pristine SWCNT; г - purified SWCNT (particles of CNT in the cytoplasm of cells).
Рис. 10. Просвечивающая электронная микроскопия клеток А549 после 72-часовой экспозиции исследуемых материалов (1 мкм): а - клетки без воздействия; б - МУНТ; в - ОУНТ неочищ.; г - ОУНТ очищ. (частицы УНТ в цитоплазме клеток). Fig. 10. Transmission electron microscopy of A549 cells after 72-hour exposure of the studied materials: а - untreated cells; б - MWCNT; в - pristine
SWCNT; г - purified SWCNT (particles of CNT in the cytoplasm of cells).
Оригинальная статья
Оценка повреждения плазматической мембраны, определяемого с помощью анализа ЛДГ, показала тенденцию, сходную со снижением жизнеспособности в исследованных клетках (рис. 3). При воздействии МУНТ в концентрации 100 мкг/мл наблюдалось значительное повышение уровня ЛДГ в супернатанте клеток ВЕЛ8-2В. Повреждение целостности мембраны клеток ВЕЛ8-2В было более выраженным при воздействии очищенных ОУНТ, чем неочищенных ОУНТ. Воздействие УНТ на бронхиальные клетки вызывало повышение уровня ЛДГ в супернатанте при 100 мкг/мл для всех типов УНТ и при 50 мкг/мл для очищенных ОУНТ.
В клетках Л549 токсичность УНТ была ниже, чем в клетках ВЕЛ8-2В. По данным МТ8-теста, выживаемость клеток А549 под действием очищенных, неочищенных ОУНТ и МУНТ была не ниже 75% по сравнению с контролем и статистически значимо не отличалась от контроля (рис. 4).
Активность ЛДГ в супернатанте клеток А549, подвергшихся воздействию УНТ, на всех концентрациях также не отличалась от контроля (рис. 5).
Таким образом, получены согласованные результаты по обоим тестам на цитотоксичность. Данные МТ8-теста и ЛДГ-теста свидетельствуют о токсичности ОУНТ и МУНТ в отношении клеток бронхиального эпителия ВЕЛ8-2В в концентрациях 200, 100, 50 мкг/мл для неочищенных ОУНТ и МУНТ; 200, 100, 50, 25 мкг/мл для очищенных ОУНТ с активацией пути нарушения метаболической активности клеток и повреждения мембран клеток. Клетки альвеолярного эпителия А549 оказались более устойчивыми к действию УНТ, что проявлялось в отсутствии снижения жизнеспособности этих клеток и в отсутствии признаков нарушения целостности клеточных мембран при действии всех изучаемых концентраций УНТ.
Визуализация ОУНТ и МУНТ в клетках. Визуализация УНТ в клетках бронхиального эпителия ВЕА8-2В и клетках альвеолярного эпителия А549 методом темнопольной микроскопии показала наличие УНТ на поверхности и внутри клеток при концентрации 100 мкг/мл (рис. 6, 7).
Визуализация экспонированных культур ВЕЛ8-2В под действием концентрации 100 мкг/мл разных видов УНТ с помощью ПЭМ выявила способность клеток бронхиального эпителия к поглощению ОУНТ и МУНТ. При взаимодействии углеродных нанотрубок с клетками была обнаружена тенденция к инвагинации клеточной мембраны; углеродные нанотрубки проникали в клетки преимущественно путём эн-доцитоза (рис. 8). УНТ внутри клеток находятся в лизосомо-подобных структурах или свободно в цитоплазме клеток, что показано на изображениях ПЭМ (рис. 9). МУНТ обнаруживаются преимущественно в виде скоплений как в процессе взаимодействия с клеточной мембраной (см. рис. 8, б), так и после проникновения, при этом внутри клеток они локализованы в эндосомах (см. рис. 9, б). Агломераты и единичные ОУНТ визуализируются внутри клеток как в эндосомах (см. рис. 9, г), так и в цитоплазме (см. рис. 9, в).
При рассмотрении ПЭМ-изображений клеток А549, экспонированных ОУНТ, инвагинации клеточной мембраны не наблюдается; нет отчётливой картины момента взаимодействия ОУНТ с клетками. ОУНТ обнаруживаются в цитоплазме без тенденции к вакуолизации (рис. 10, в, г). МУНТ также обнаруживаются в цитоплазме в виде скоплений, в том числе вблизи ядерной мембраны (рис. 10, б).
Таким образом, изображения, полученные методом тем-нопольной микроскопии и ПЭМ, клеток ВЕЛ8-2В и А549, экспонированных УНТ, позволяют убедиться в проникновении ОУНТ и МУНТ в цитоплазму клеток.
Обсуждение
Цитотоксические эффекты при воздействии МУНТ и ОУНТ на культуру клеток бронхиального эпителия ВЕЛ8-2В оказались сопоставимыми. Подобные результаты получены и другими авторами [12, 13]. Цитотоксические эффекты ОУНТ и МУНТ не различались, однако отмечена разница
в проникновении УНТ в клетки: при визуализации взаимодействия УНТ с клетками с использованием ПЭМ обнаруживаются вакуолизированные скопления МУНТ в цитоплазме клеток, тогда как ОУНТ чаще представлены в виде единичных трубок или пучков во внутриклеточном содержимом. Такая же картина наблюдается и во внеклеточном пространстве: МУНТ оказываются более склонными к формированию визуально различимых скоплений. Различия в проникновении нанотрубок в клетки могут быть объяснены структурными особенностями: МУНТ имеют меньшую длину, а агломераты МУНТ, по данным ДСР, в 3—4 раза меньше по сравнению с ОУНТ, что облегчает их захват клетками [18—21]. Кроме того, могут иметь значение и свойства поверхности УНТ, определяющие взаимодействие нанотрубок друг с другом и с остальными веществами [32].
По данным других исследователей, размеры агломератов УНТ могут играть роль в проникновении нанотрубок в клетки и реализации цитотоксических эффектов [18—21]. Сравнительная оценка воздействия ОУНТ на клетки ВЕЛ8-2В продемонстрировала, что очищенные ОУНТ проявляют токсические свойства на более низких концентрациях по сравнению с неочищенными ОУНТ. Согласно морфометрическим характеристикам нанотрубок в культуральной среде ВЕОМ, наружный диаметр неочищенных и очищенных ОУНТ сопоставим, однако агломераты очищенных ОУНТ в два раза меньше, чем неочищенных. Можно предположить, что металлические примеси обусловливают некоторую ригидность структуры, из-за чего очищенные ОУНТ оказываются более гибкими и способными образовывать компактные агломераты.
В случае клеток альвеолярного эпителия А549 МУНТ и оба типа ОУНТ не проявляли статистически значимого цитотоксического эффекта через 72 ч. Однако наблюдается тенденция к повышению уровня ЛДГ в клеточном супернатанте при воздействии МУНТ в концентрации 100 мкг/мл. Также обнаруживаются вакуолизированные скопления МУНТ в цитоплазме клеток, вблизи ядерной мембраны и во внутриклеточных органеллах, причём вакуоли могут занимать большую часть клетки. При воздействии неочищенных и очищенных ОУНТ той же концентрации на культуру клеток альвеолярного эпителия такого явления не наблюдается. Данные результаты могут быть связаны с механизмом токсичности МУНТ, реализуемым через повреждающее воздействие на мембраны чувствительных клеток.
Несмотря на отсутствие различий в цитотоксическом эффекте, очевидным становится разное поведение изучаемых МУНТ и ОУНТ при взаимодействии с клеткой. Отмеченное в настоящем исследовании накопление большого количества МУНТ в клетках может приводить к реализации хронических последствий и вызывать повреждения генетического материала [15, 33], что требует дальнейшего изучения.
В ходе исследования также показано, что наиболее подходящей моделью для изучения УНТ являются клеточная культура бронхиального эпителия человека ВЕЛ8-2В. Воздействие УНТ в тех же концентрациях в отношении клеток альвеолярного эпителия А549 не вызвало значимого снижения жизнеспособности клеток. Это согласуется с результатами проведённых ранее исследований по оценке токсичности МУНТ и ОУНТ на клеточных культурах ВЕЛ8-2В и Л549, где авторы отмечали устойчивость клеток А549 к воздействию УНТ [34, 35]. Предположительно это может быть связано со способностью клеток альвеолярного эпителия секретировать сурфактант, богатый фосфолипидами, выработка которого является защитной реакцией клеток в ответ на воздействие инородного агента [36].
Необходимо отметить, что внесение УНТ в клетки осуществлялось в виде дисперсий, где обнаруживались как единичные нанотрубки, так и их агломераты, в то время как в воздухе рабочей зоны УНТ обнаруживаются преимущественно в виде агломератов [25]. Также в настоящем исследовании расчёт концентраций УНТ для внесения в клетки был основан на компьютерном моделировании. Проведение
Original article
экспериментов с оценкой нагрузки на лёгкие могло бы точнее оценить депонированные дозы УНТ в лёгких3. Дальнейшее изучение механизмов цитотоксического и генотокси-ческого действия разных типов УНТ может способствовать выявлению особенностей воздействия МУНТ и ОУНТ на клетки дыхательной системы для разработки методологических подходов к безопасному использованию УНТ.
Заключение
Результаты исследования показали сходные цитотоксические эффекты при воздействии МУНТ и ОУНТ на клетки бронхиального и альвеолярного эпителия BEAS-2B и А549. Показано, что наиболее подходящей моделью для изучения УНТ являются клеточная культура бронхиального эпителия человека BEAS-2B. Клетки альвеолярного эпителия А549 оказались более устойчивы к действию УНТ, что проявлялось в отсутствии снижения жизнеспособности этих клеток и отсутствии признаков нарушения целостности клеточных мембран при действии всех изучаемых концентраций УНТ. Вероятно, это может быть связано со способностью клеток альвеолярного эпителия секретировать сурфактант. Данные MTS-теста и ЛДГ-теста свидетельствуют о токсичности неочищенных ОУНТ и МУНТ в диапазоне концентраций 50—200 мкг/мл и очищенных ОУНТ в диапазоне
3 OECD Guidance document on acute inhalation toxicity testing; 2009. Доступно: https://ntp.niehs.nih.gov/iccvam/suppdocs/feddocs/ oecd/oecd-gd39.pdf
25—200 мкг/мл в отношении клеток ВЕЛ8-2В. Данные, полученные методами темнопольной микроскопии и ПЭМ, позволяют убедиться в проникновении ОУНТ и МУНТ в цитоплазму клеток ВЕЛ8-2В и А549. При этом МУНТ чаще обнаруживаются во внутриклеточном содержимом в виде вакуолизированных скоплений, тогда как единичные и агломераты ОУНТ визуализируются в цитоплазме без тенденции к вакуолизации. Различия в проникновении УНТ в клетки могут быть объяснены структурными особенностями: агломераты МУНТ в несколько раз меньше по сравнению с ОУНТ, по данным ДСР, что облегчает их захват клетками. Накопление МУНТ в большом количестве в клетках может приводить к реализации хронических последствий и вызывать повреждения генетического материала, что требует дальнейшего изучения. Металлические примеси в составе неочищенных ОУНТ обусловливают ригидность структуры. Очищенные ОУНТ оказываются более гибкими и склонными к агломерации, что может обусловливать реализацию цитотоксических эффектов на более низких концентрациях. Полученные результаты свидетельствуют о влиянии таких характеристик УНТ, как размер агломератов и наличие примесей, на процессы взаимодействия нанотрубок с клетками дыхательных путей и последующую реализацию токсических эффектов. Дальнейшее изучение механизмов цитотоксического и генотоксического действия разных типов УНТ поможет выявить особенности воздействия МУНТ и ОУНТ на клетки дыхательной системы и будет способствовать разработке методологических подходов к безопасному использованию УНТ.
Литература
(п.п. 1-9, 11-13, 15-27, 29, 31-36 см. References)
10. Халиуллин Т.О., Кисин Е.Р., Мюррэй Р.Э., Залялов Р.Р., Шведова А.А., Фатхутдинова Л.М. Токсические эффекты углеродных нанотрубок в культурах клеток макрофагов и бронхиального эпителия. Вестник Томского государственного университета. Биология. 2014; (1): 199-210.
14. Тимербулатова Г.А., Фатхутдинова Л.М. Токсичность одностенных углеродных нанотрубок, исследованная на различных типах культур клеток (обзор современного состояния проблемы). Российские нано-технологии. 2018; 13(5-6): 26-31.
28. Тимербулатова Г.А., Димиев А.М., Хамидуллин Т.Л., Бойчук С.В., Дунаев П.Д., Фахруллин Р.Ф. и др. Диспергирование одностенных углеродных нанотрубок в биосовместимых средах. Российские нано-технологии. 2020; 15(4): 461-9. https://doi.org/10.1134/S1992722320040160 30. Чередниченко Ю.В., Евтюгин В.Г., Нигаматзянова Л.Р., Ахатова Ф.С., Рожина Э.В., Фахруллин Р.Ф. Синтез наночастиц серебра при помощи ультразвука и галлуазита для создания нанокомпозита с антибактериальными свойствами. Российские нанотехнологии. 2019; 14(9-10): 64-70. https://doi.org/10.21517/1992-7223-2019-9-10-64-70
References
1. Venkataraman A., Amadi E.V., Chen Y., Papadopoulos C. Carbon nanotube assembly and integration for applications. Nanoscale Res. Lett. 2019; 14(1): 220. https://doi.org/10.1186/s11671-019-3046-3
2. Chetyrkina M.R., Fedorov F.S., Nasibulin A.G. In vitro toxicity of carbon nanotubes: a systematic review. RSCAdv. 2022; 12(25): 16235—56. https://doi.org/10.1039/d2ra02519a
3. Alshehri R., Ilyas A.M., Hasan A., Arnaout A., Ahmed F., Memic A. Carbon Nanotubes in Biomedical Applications: Factors, Mechanisms, and Remedies of Toxicity. J. Med. Chem. 2016; 59(18): 8149-67. https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.5b01770
4. Pietroiusti A., Stockmann-Juvala H., Lucaroni F., Savolainen K. Nanomaterial exposure, toxicity, and impact on human health. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 2018; 10(5): e1513. https://doi.org/10.1002/wnan.1513
5. Luanpitpong S., Wang L., Rojanasakul Y. The effects of carbon nanotubes on lung and dermal cellular behaviors. Nanomedicine (Lond). 2014; 9(6): 895-912. https://doi.org/10.2217/nnm.14.42
6. Siegrist K.J., Reynolds S.H., Porter D.W., Mercer R.R., Bauer A.K., Lowry D., et al. Mitsui-7, heat-treated, and nitrogen-doped multi-walled carbon nanotubes elicit genotoxicity in human lung epithelial cells. Part. Fibre Toxicol. 2019; 16(1): 36. https://doi.org/10.1186/s12989-019-0318-0
7. Lindberg H.K., Falck G.C., Singh R., Suhonen S., Järventaus H., Vanhala E., et al. Genotoxicity of short single-wall and multi-wall carbon nanotubes in human bronchial epithelial and mesothelial cells in vitro. Toxicol. 2013; 313(1): 24-37. https://doi.org/10.1016/j.tox.2012.12.008
8. Haniu H., Saito N., Matsuda Y., Tsukahara T., Usui Y., Maruyama K., et al. Biological responses according to the shape and size of carbon nanotubes in BEAS-2B and MESO-1 cells. Int. J. Nanomed. 2014; 9: 1979-90. https://doi.org/10.2147/IJN.S58661
9. Jia G., Wang H., Yan L., Wang X., Pei R., Yan T., et al. Cytotoxicity of carbon nanomaterials: single-wall nanotube, multi-wall nanotube, and fullerene.
Environ. Sci. Techno!. 2005; 39(5): 1378-83. https://doi.org/10.1021/es048729l
10. Khaliullin T.O., Kisin E.R., Myurrey R.E., Zalyalov R.R., Shvedova A.A., Fatkhutdinova L.M. Toxic effects of carbon nanotubes in macrophage and bronchial epithelium cell cultures. Vestnik Tomskogo gosudarstvennogo universiteta. Biologiya. 2014; (1): 199-210. (in Russian)
11. Hu X., Cook S., Wang P., Hwang H.M., Liu X., Williams Q.L. In vitro evaluation of cytotoxicity of engineered carbon nanotubes in selected human cell lines. Sci. Total Environ. 2010; 408(8): 1812-7. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2010.01.035
12. Murr L.E., Garza K.M., Soto K.F., Carrasco A., Powell T.G., Ramirez D.A., et al. Cytotoxicity assessment of some carbon nanotubes and related carbon nanoparticle aggregates and the implications for anthropogenic carbon nanotube aggregates in the environment. Int. J. Environ. Res. Public Health. 2005; 2(1): 31-42. https://doi.org/10.3390/ijerph2005010031
13. Palomäki J., Karisola P., Pylkkänen L., Savolainen K., Alenius H. Engineered nanomaterials cause cytotoxicity and activation on mouse antigen presenting cells. Toxicol. 2010; 267(1-3): 125-31. https://doi.org/10.1016/j.tox.2009.10.034
14. Timerbulatova G.A., Fatkhutdinova L.M. Assessment of the toxicity of singlewall carbon nanotubes using different types of cell cultures: review of the current state of knowledge. Rossiyskie nanotekhnologii. 2018; 13(5-6): 240-5.
15. Grosse Y., Loomis D., kio Guyton K.Z., Lauby-Secretan B., El Ghissassi F., Bouvard V., et al. International Agency for Research on Cancer Monograph Working Group. Carcinogenicity of fluoro-edenite, silicon carbide fibres and whiskers, and carbon nanotubes. Lancet Oncol. 2014; 15(13): 1427-8. https://doi.org/10.1016/S1470-2045(14)71109-X
16. Ghosh M., Murugadoss S., Janssen L., Cokic S., Mathyssen C., Van Landuyt K., et al. Distinct autophagy-apoptosis related pathways activated by Multi-walled (NM 400) and Single-walled carbon nanotubes (NIST-SRM2483) in human bronchial epithelial (16HBE14o-) cells. J. Hazard. Mater. 2020; 387: 121691. https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2019.121691
17. Caoduro C., Hervouet E., Girard-Thernier C., Gharbi T., Boulahdour H., 27. Delage-Mourroux R., et al. Carbon nanotubes as gene carriers: Focus on internalization pathways related to functionalization and properties. Acta 28. Biomater. 2017; 49: 36-44. https://doi.org/10.1016/j.actbio.2016.11.013
18. Kang B., Chang S., Dai Y., Yu D., Chen D. Cell response to carbon nanotubes: size-dependent intracellular uptake mechanism and subcellular fate. .Small.
2010; 6(21): 2362-6. https://doi.org/10.1002/smll.201001260 29.
19. Raffa V., Ciofani G., Nitodas S., Karachalios T., D'Alessandro D., Masini M., et al. Can the properties of carbon nanotubes influence their internalization by living
cells? Carbon. 2008; 46: 1600-10. https://doi.o^/10.1016/j.carbon.2008.06.053 30.
20. Han Y.G., Xu J., Li Z.G., Ren G.G., Yang Z. In vitro toxicity of multi-walled carbon nanotubes in C6 rat glioma cells. Neurotoxicol. 2012; 33(5): 1128-34. https://doi.org/10.1016/j.neuro.2012.06.004
21. Ema M., Takehara H., Naya M., Kataura H., Fujita K., Honda K. Length effects of single-walled carbon nanotubes on pulmonary toxicity after 31. intratracheal instillation in rats. J. Toxicol. Sci. 2017; 42(3): 367-78. https://doi.org/10.2131/jts.42.367
22. Migliore L., Saracino D., Bonelli A., Colognato R., D'Errico M.R., Magrini A.,
et al. Carbon nanotubes induce oxidative DNA damage in RAW 264.7 cells. 32. Environ. Mol. Mutagen. 2010; 51(4): 294-303. https://doi.org/10.1002/em.20545
23. Ursini C.L., Cavallo D., Fresegna A.M., Ciervo A., Maiello R., Buresti G., et al. Differences in cytotoxic, genotoxic, and inflammatory response of bronchial and alveolar human lung epithelial cells to pristine and COOH- 33. functionalized multiwalled carbon nanotubes. Biomed. Res. Int. 2014; 2014: 359506. https://doi.org/10.1155/2014/359506
24. Eldawud R., Wagner A., Dong C., Stueckle T.A., Rojanasakul Y., Dinu C.Z. Carbon 34. nanotubes physicochemical properties influence the overall cellular behavior and
fate. Nanolmpact. 2018; 9: 72-84. https://doi.org/10.1016Xj.impact.2017.10.006
25. Guseva Canu I., Bateson T.F., Bouvard V., Debia M., Dion C., Savolainen K., et 35. al. Human exposure to carbon-based fibrous nanomaterials: A review. Int. J. Hyg. Environ. Health. 2016; 219(2): 166-75. https://doi.org/10.1016Zj.ijheh.2015.12.005
26. Donaldson K., Aitken R., Tran L., Stone V., Duffin R., Forrest G., et al. Carbon nanotubes: a review of their properties in relation to pulmonary 36. toxicology and workplace safety. Toxicol. Sci. 2006; 92(1): 5-22. https://doi.org/10.1093/toxsci/kfj130
Оригинальная статья
Multiple-Path Particle Dosimetry Model (MPPD v 3.04). Available at: https:// www.ara.com/products/multiple-path-particle-dosimetry-model-mppd-v-304 Timerbulatova G.A., Dimiev A.M., Khamidullin T.L., Boychuk S.V., Dunaev P.D., Fakhrullin R.F., et al. Dispersion of single-walled carbon nanotubes in biocompatible media. Rossiyskie nanotekhnologii. 2020; 15(4): 461-9. https://doi.org/10.1134/S1992722320040160_Gn Russian) Davoren M., Herzog E., Casey A., Cottineau B., Li Y., Boraschi D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomed. Lond. 2016; 11(3): 269. https://doi.org/10.221/nnm.15.19619 Cherednichenko Yu.V., Evtyugin V.G., Nigamatzyanova L.R., Akhatova F.S., Rozhina E.V., Fakhrullin R.F. Silver nanoparticle synthesis using ultrasound and halloysite to create a nanocomposite with antibacterial properties. Rossiyskie nanotekhnologii. 2019; 14 (9-10): 64-70. https://doi.org/10.21517/1992-7223-2019-9-10-64-70 (in Russian) Fakhrullin R., Nigamatzyanova L., Fakhrullina G. Dark-field/ hyperspectral microscopy for detecting nanoscale particles in environmental nanotoxicology research. Sci. Total Environment. 2021; 772: 145478. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2021.145478
Mohd Nurazzi N., Asyraf M.R.M., Khalina A., Abdullah N., Sabaruddin F.A., Kamarudin S.H., et al. Fabrication, functionalization, and application of carbon nanotube-reinforced polymer composite: an overview. Polymers (Basel). 2021; 13(7): 1047. https://doi.org/10.3390/polym13071047 Dong J., Ma Q. Suppression of basal and carbon nanotube-induced oxidative stress, inflammation and fibrosis in mouse lungs by Nrf2. Nanotoxicol. 2016; 10(6): 699-709. https://doi.org/10.3109/17435390.2015.1110758 Gupta S.S., Singh K.P., Gupta S., Dusinska M., Rahman Q. Do carbon nanotubes and asbestos fibers exhibit common toxicity mechanisms? Nanomaterials (Basel). 2022; 12(10): 1708. https://doi.org/10.3390/nano12101708 Ursini C.L., Maiello R., Ciervo A., Fresegna A.M., Buresti G., Superti F., et al. Evaluation of uptake, cytotoxicity and inflammatory effects in respiratory cells exposed to pristine and -OH and -COOH functionalized multi-wall carbon nanotubes. J. Appl. Toxicol. 2016; 36(3): 394-403. https://doi.org/10.1002/jat.3228 Davoren M., Herzog E., Casey A., Cottineau B., Chambers G., Byrne H.J., et al. In vitro toxicity evaluation of single walled carbon nanotubes on human A549 lung cells. Toxicol. In Vitro. 2007; 21(3): 438-48. https://doi.org/10.1016/j.tiv.2006.10.007
