CC BY
81
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Ариэль Б.М. Саркоидоз: от морфологии к этиологии и патогенезу // Актуальные вопросы диагностики и лечения туберкулеза: Труды Всероссийской науч.-практич. конфер. - СПб., 2005. - С.239-243.
2. Бакенова Р.А., Тусупбекова М.М. // Морфология и доказательная медицина. - 2011. - №3-4. -С.68-70.
3. Тусупбекова М.М. и др. // Клинич. медицина Казахстана. - 2011. - №3, 4 (22, 23). - С.17.
4. Двораковская И.В. Диагностика саркоидоза / И.В. Двораковская, Б.М. Ариэль. - СПб., 2005. - 44 с.
5. Коган Е.А., Корнев Б.М, Попова Е.Н. Интерстици-альные болезни легких: Практич. рук-во / Н.А. Мухин. - М., 2007. - 432 с.
6. Мухин Н.А. Интерстициальные болезни легких. -М., 2007. - С.120-155.
7. Терпигорев С.А. и др. // Вестник РАМН. - 2012. -№5. - С.30-37.
8. Тусупбекова М.М, Бакенова Р.А., Досмагамбето-ва Р.С. // Медицина и экология. - 2011. - №4 (61). - С.75-80.
9. Тусупбекова М.М. Основы гистологической техники и методы гистологического исследования аутопсийного, операционно-биопсийного и экспе-
риментального материала. Метод. реком. - 2005. - С.4-44.
10. GoknarN, CakirEr, CakirFB, et al. // Hematology reports. - 2015. - Vol.7, Issue 2. - P.5644.
11. Шмелев Е.И. // Consilium medicum. - 2003. - Т.5, №4. - С.176-181.
12. Черняев А.Л., Самсонова М.В. Патологическая анатомия легких: Атлас / Под ред. А.Г. Чучалина. -М., 2011. - 112 с. „
Поступила 27.05.2016г. Статья размещена на сайте www.mednovosti.by (Архив МН) и может быть скопирована в формате Word.
Оценка цитотоксичности субстанции повиаргол in vitro
Довнар А.Г.1, Свирчевская Е.Ю.2, Ржеусский С.Э.3, Самойлович Е.О.2
1Белорусский государственный медицинский университет, Минск
2Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии, Минск, Беларусь 3Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет, Беларусь
Dounar H.G.1, Svircheuskaya EY2, Rzheussky S.E.3, Samailovich E.O.2
1Belarussian State Medical University, Minsk 2Republican Scientific and Practical Centre of Epidemiology and Microbiology, Minsk, Belarus 3Vitebsk State Order of Peoples' Friendship Medical University, Belarus
Cytotoxicity assessment of poviargol substance in vitro
Резюме. Одним из этапов фармацевтической разработки новых лекарственных средств является их токсическая оценка, к которой относится изучение цитотоксичности. В статье представлены результаты исследования in vitro цитотоксичности фармацевтической субстанции повиаргол, представляющей собой металлическое высокодисперсное серебро. Оценку цитотоксичности повиаргола проводили на клетках эпидермоидной карциномы гортани человека HEp-2C с использованием световой микроскопии и МТТ-теста. Установлено, что IC50 для субстанции повиаргол равнялась 0,0044±0,00096%, что в пересчете на содержание серебра составляет2,9 мкг/мл. Ключевые слова: цитотоксичность, повиаргол, протаргол, наночастицы серебра.
Медицинские знания. — 2016. — №9. — С. 62-64. Summary. One of the stages of the development of new pharmaceutical drugs is their toxicological assessment, and cytotoxicity study is a part of it. The article presents the results of in vttro cytotoxicity study of pharmaceutical substance poviargol, which is a highly dispersed metallic silve. Poviargol assessment of cytotoxicity was performed on HEp-2C cells of human epidermoid larynx carcinoma using light microscopy and MTT assay. It was found that the half maximum inhibitory concentration of poviargol substance was 0,0044±0,00096%, or 2.9 mg / ml calculated for silver content. Keywords: сytotoxicity, poviargol, protargol, silver nanoparticles. Meditsinskie novosti. - 2016. - N9. - P. 62-64.
В настоящее время для лечения инфекционных заболеваний и поражений используются различные противомик-робные препараты. В связи с развитием микробной резистентности к антибактериальным препаратам, токсическим действием антибиотиков на внутренние органы, подавлением иммунитета, дис-биотическими состояниями после их длительного применения становится актуальной разработка альтернативных антибактериальных и противогрибковых агентов. Вследствие этого большой интерес вызывают наночастицы серебра, обладающие широким спектром антимикробной активности [5, 8].
Одним из этапов фармацевтической разработки новых соединений является их токсическая оценка, к которой в рамках системы GLP относится изучение цитотоксичности [2]. Использование клеточных культур для оценки цитотоксичности in vitro обладает рядом преимуществ, таких как дешевизна, простота применения,
неограниченный запас материала, возможность решить этические проблемы, связанные с исследованиями на животных и сократить их число в последующих доклинических испытаниях in vivo. Кроме того, исследования цитотоксичности фармацевтических субстанций in vivo осложняются наличием структурной и функциональной гетерогенности клеток, что затрудняет изучение точных молекулярных механизмов действия лекарственных препаратов [2].
При изучении цитотоксичности следует учитывать, что различные клетки организма человека и животных проявляют разную чувствительность к воздействию химических соединений. Клеточная модель в условиях in vitro более чувствительна к действию раздражающих веществ в виду отсутствия факторов защиты (слизь, тканевая жидкость, слюна), барьера слизистых оболочек, разбавления и инги-бирования препаратов слюной, что имеет значение in vivo.
В литературе описаны исследования цитотоксичности препаратов, содержащих наночастицы серебра, при воздействии на различные клеточные культуры. Д.С. Савченко определил появление цитотоксичности высокодисперсного кремнезема с наночастицами серебра после обработки им клеток НЕр2-С при концентрации 0,007% [6]. Е Та1едЬш и др. установили отсутствие токсических эффектов на клетки эпителия десны у наночастиц со средним размером 10 нм при внесении их в концентрациях меньше 10 мкг/мл [10]. Авторы также отмечают увеличение токсического эффекта с течением времени. В доступной нам литературе данных по цитотоксичности повиаргола п м1го не обнаружено.
Цель настоящего исследования - оценка цитотоксического действия субстанции повиаргол на клетках эпидермоидной карциномы гортани человека нЕр-2С. Материалы и методы В качестве объекта исследования использовали фармацевтическую
субстанцию повиаргол (НД №1781/13), представляющую собой металлическое высокодисперсное серебро, стабилизированное поливинилпирролидоном низкомолекулярным медицинским (произведено ФГУП «Специальное конструкторско-технологическое бюро «Технолог», Санкт-Петербург). Для анализа токсичности изучаемой субстанции повиаргол проводилось сравнение его воздействия на клетки с протарголом (производство Германия) - подобной по химическому составу лекарственной субстанцией с уже известными фармакологическими эффектами и длительным сроком существования на фармацевтическом рынке.
Цитотоксичность изучали на перевиваемой культуре клеток эпидермоидной карциномы человека HEp-2C. Оценку цито-токсичности проводили с использованием двух методов:
- по влиянию на морфологию клеток с визуальной оценкой с помощью световой микроскопии;
- МТТ-теста - теста, позволяющего определить жизнеспособность клеток по функциональной активности митохондрий.
Для постановки эксперимента готовили ряд последовательных разведений обеих субстанций на дистиллированной воде до конечных концентраций 0,5%; 0,1%; 0,05%; 0,01%; 0,005%, 0,001%, 0,0005%, 0,0001%. Клетки HEp-2C культивировали на культуральных флаконах (Sarstedt, Германия) со средой роста: питательная среда ДМЕМ (Sigma, Германия) c добавлением 200 мМ L-глютамина (Sigma, Германия), 10%-й эмбриональной телячьей сыворотки (ну Clone, Индия), 100 мг/мл ген-тамицина (Белмедпрепараты, РУП). Для постановки эксперимента по оценке ци-тотоксичности клетки готовили за 24 часа до тестирования. Клеточную суспензию с посевной дозой 250-300 тыс./мл по 100 мкл на лунку рассевали в плоскодонные культуральные 96-луночные планшеты (Corning, США) и инкубировали в термостате при 37°С в атмосфере с 5% СО2.
На следующие сутки после посева клеток проводили их микроскопию с использованием светового инвертированного микроскопа (Olympus, Япония, увеличение х 100) для оценки качества сформировавшегося монослоя. Когда монослой сформировался полностью, из всех лунок удаляли среду роста и вносили по 100 мкл поддерживающей среды: питательная среда ДМЕМ c добавлением 200 мМ L-глютамина, 2%-й эмбриональной телячьей сыворотки (Ну Clone, Индия), 100 мг/мл гентамицина.
Рисунок 1
Оценка влияния субстанции повиаргол на морфологию клеток НЕр-2С через 72 часа наблюдения с использованием световой микроскопии (ув. 10x10). А. - контроль монослоя культуры клеток НЕр-2С. Б. - сплошной монослой клеток при обработке 0,0005% раствором субстанции повиаргол. В. - деструкция 50% клеточного монослоя при обработке 0,005% раствором повиаргола. Г. - 100% деструкция монослоя клеток при обработке 0,5% раствором повиаргола
Далее в лунки планшета вносили по 100 мкл соответствующего разведения субстанции (четыре лунки для каждого разведения). Контрольными являлись лунки, где к 100 мкл поддерживающей среды было добавлено 100 мкл растворителя (дистиллированной воды). Планшет инкубировали в термостате при 37°С в атмосфере с 5% СО2.
Влияние субстанции на морфологию клеток оценивали по степени изменения монослоя с использованием инвертированного микроскопа, через 24, 48 и 72 часа. Цитодеструктивное действие препарата оценивали по 4-крестовой системе по методу Финтера: «+» - поражение до 25% монослоя, «2+» - до 50%, «3+» - до 75% и «4+» - до 100% монослоя [1].
Для оценки жизнеспособности клеток в культуре и напряженности окислительных процессов с помощью МТТ-теста через 72 часа наблюдения за клетками во все лунки планшета (опытные и контрольные) вносили по 20 мкл МТТ (Sigma, Германия). Планшет инкубировали в термостате при 37°С 4 часа. После инкубации из всех лунок планшета аккуратно удаляли надосадочную среду. Образовавшийся на дне лунок нерастворимый осадок формазана растворяли в 150 мкл DMSO. Оптическую плотность регистрировали при длине волны 550 нм
с отсекающей длиной волны 630 нм на спектрофотометре (Thermo Scientific Multiskan EX, Финляндия).
Исходя из 4 повторных значений оптической плотности, для каждой испытуемой концентрации повиаргола определялась средняя ингибирующая концентрация, т.е. концентрация вещества, которая подавляет на 50% данную клеточную функцию (IC50).
Для построения кривой зависимости между дозой (концентрацией) повиаргола и производимым эффектом (изменение оптической плотности вследствие токсичности) использовалась модель логистической регрессии с тремя переменными: Y=d/(t+(X/c)b)+d где Y - оптическая плотность, Х -концентрация, d - верхняя асимптота (максимальное значение) соответственно. Крутизна линейной части кривой описывается коэффициентом наклона b, параметр с отражает значение IC50. Для проведения статистического анализа использовались пакеты Microsoft Excel 2007 и «drc» для языка программирования R. Результаты и обсуждение Оценка цитотоксичности по влиянию на морфологию клеток HEp-2C
Анализ данных световой микроскопии выявил сходную цитологическую картину воздействия повиаргол и протаргола. Через 24 часа наблюдения в контроле сформировался плотный монослой клеток
№ 9 • 2016
МЕДИЦИНСКИЕ НОВОСТИ
округлой формы, плотно прилегающих друг к другу. В результате воздействия на клетки высоких концентраций (0,1-0,5%) повиаргола и протаргола полная дегенерация клеток отмечалась уже через 24 часа. В низких концентрациях (0,0001%, 0,0005%, 0,001%) дегенерации монослоя в течение всего периода наблюдения (24-72 часа) не отмечалось, морфологическая картина соответствовала контролю. В среднем диапазоне концентраций (0,005%, 0,01% и 0,05%) наблюдалось некоторое увеличение цитотоксичности с течением времени. Средней ингибиру-ющей концентрацией являлась концентрация 0,005%, при воздействии которой через 24 часа отмечалась деструкция 25% клеточного монослоя, через 72 часа деструкция монослоя составляла 50% (рис. 1).
Оценка цитотоксичности с использованием МТТ-теста
Для оценки жизнеспособности клеток в культуре и напряженности окислительных процессов был использован МТТ-тест, который показывает изменение энергетического потенциала клетки. Метод основывается на способности митохондриальных дегидрогеназ живых, метаболически активных клеток конвертировать водорастворимый желтый 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид (МТТ) в синий формазан, растворимый в среде культивирования. Таким образом, поглощение клетками формазана, которое регистрируется значением оптической плотности, прямо пропорционально количеству жизнеспособных клеток в культуре.
Результаты оценки цитотоксичности субстанции повиаргол с использовани-
ем МТТ-теста подтвердили результаты предварительной оценки этой субстанции по влиянию на морфологию клеток. Влияние различных концентраций по-виаргола на жизнедеятельность клеток с использованием МТТ-теста представлено на рис. 2. Было установлено, что при воздействии субстанции в концентрации 0,0001% влияния на жизнеспособность клеток практически не отмечалось. Субстанция в концентрациях 0,0005% и 0,001% вызывала незначительное инги-бирование жизнеспособности клеток, на 10% и 20% соответственно. Под влиянием повиаргола в концентрациях, превышающих 0,05%, жизнеспособность клеток снижалась на 80% и более. По расчетным данным, полученным с использованием пакета «йгс» для языка программирования R, средняя инги-бирующая концентрация повиаргола, определяющая индекс цитотоксичности 1С50, равнялась 0,0044±0,00096%, что в пересчете на содержание серебра составляет 2,9 мкг/мл. Таким образом, 1С50, рассчитанная визуально по влиянию на морфологию клеток и с использованием МТТ теста, практически совпадали.
Изучению цитотоксичности серебро-содержащих препаратов и ее механизмов посвящены многие исследования. Доказано, что наночастицы серебра не накапливаются в значительном количестве во внутренних органах и тканях ни при многократном, ни при однократном применении [7]. Показано, что, несмотря на определенную токсичность наночастиц серебра, его токсические дозы отличаются от терапевтических на 5-6 порядков [3].
Анализ данных литературы по цитоток-сичности широко используемых в настоящее время препаратов с иным механизмом действия (не содержащих серебро), в частности антисептика хлоргексидина биглюконата, свидетельствуют о том, что цитотоксичность данного препарата является сравнимой с цитотоксичностью повиаргола. Так, по данным Е.В. Багаевой и соавт., жизнеспособность клеток эпи-дермоидной карциномы полости рта после обработки их 0,005% хлоргексидином, по
данным МТТ-теста, составила 98%, в то время как более высокие концентрации угнетали клеточный рост [4]. Другие исследователи определили среднюю инги-бирующую концентрацию хлоргексидина на линию остеобластов человека U2OS, равную 0,005% [9].
Заключение
В рамках проведенного исследования было впервые изучено цито-токсическое влияние повиаргола с наночастицами серебра на клетки. Проведенное исследование показало, что цитотоксичность субстанции повиаргол является сравнимой с цитотоксичностью протаргола - лекарственного препарата, который широко используется в медицинской практике. Обе субстанции в концентрациях, превышающих 0,05%, вызывали цитодеструктивный эффект, в концентрациях менее 0,001% не влияли на морфологию клеток. 1С50 для субстанции повиаргол, рассчитанная по результатам МТТ-теста, равнялась 0,0044±0,00096%, что в пересчете на содержание серебра составляет 2,9 мкг/мл. Эта концентрация может явиться «отправной» концентрацией для изучения токсичности субстанции повиаргол на животных.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Водорастворимое средство, обладающее противовирусной и иммуномодулирующей активностью, на основе соединения ионного серебра с метиленовым синим и способ его получения: пат. 2390343 РФ, МПК51 С1 A61K33/38 (2006.01), A61K31/5415 (2006.01), A61K31/28 (2006.01), A61P37/02 (2006.01), A61P31/12 (2006.01) / В.В. Третьяков, В.Н. Сильников, В.Ф. Кулагин,
B.В. Власов, В.А. Рихтер, О.В. Третьякова, В.Л. Тихонов, Т.И. Глотова; заявка 2008149356/15; опубл. 27.05.2010 / Закрытое акционерное общество «БиоАргоФарм». - 2010.
2. Данченко Е.О. // Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2012. - №2. - С.22-231.
3. Ефимочкина Н.Р. // ЖМЭИ. - 2009. - №4. -
C.120-125.
4. Багаева В.В. и др. // Исследования и практика в медицине. - 2015. - Т.2, №3. - С.35-42.
5. Ржеусский С.Э., Довнар А.Г., Кугач В.В. // Вестник Витебкого гос. мед. ун-та. - 2015. - Т.14, №6. -С.120-126.
6. Савченко Д.С. // Вестник новых мед. технологий. - 2013 - Т.20, №4. - С.44.
7. Шкиль Н.Н. // Научный журнал КубГАУ. - 2011. -№68 (04). - С.1-11.
8. Kim J.H. et al. // Nanomedicine. - 2007. - Vol.3, iss.1. - P.95-101.
9. Lee TH. et al. // Int. Endodontic J. - 2010. - Vol.43, N5. - P.430-435.
10. TaleghaniF et al. // J. Dent. Sch. - 2013. - Vol.31, N3. - P.220-226.
Поступила 02.05.2016г.
