CC BY
58
УДК 576.851.132:616.982:27-033 К-69
ОЦЕНКА ТОКСИЧНОСТИ РАЗЛИЧНЫХ АНТИГЕНОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА НА МОДЕЛИ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР IN VITRO
Н. П. Храпова, Е. В. Пименова, Л. В. Ломова
Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт,
Волгоградский государственный медицинский университет, кафедра молекулярной биологии и генетики
В работе обобщены результаты применения перевиваемых монослойных клеточных линий мышиных фибробластов L929 и клеток яичника китайского хомячка CHO-K1 для оценки биологической активности антигенов возбудителя мелиоидоза in vitrn. На модели индикаторных клеток получены объективные данные о степени токсичности ряда антигенов Burkholderia pseudomallei.
Ключевые слова: возбудитель мелиоидоза, антигены, экспериментальная модель in vitro, клетки-мишени, цитотоксичность.
EVALUATION OF TOXICITY TESTING OF DIFFERENT ANTIGENS OF BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI ON CELL LINES IN VITRO
N. P Khrapova, E. V. Pimenova, L. V. Lomova
This study investigated cytotoxicity of antigens of Burkholderia pseudomallei. The cytotoxicity assay was performed in vitro using cell cultures (L929 mouse fibroblast cell line and CHO-K1 chinese hamster ovarian cell line). Application of these monolayer cultures made it possible to obtain objective data about biological activity and cytotoxicity of some antigens of Burkholderia pseudomallei.
Key words: Burkholderia pseudomallei, antigens, experimental model in vitro, target cell, cytotoxicity.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Выбор клеточной модели для определения токсических свойств антигенов возбудителя мелиоидоза in vitro и разработка оптимизированных условий постановки тестов цитотоксичности, предназначенных для выявления in vitro токсичных компонентов в биологически активных комплексах, изолированных из микробных клеток возбудителя мелиоидоза.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследование выполнено на модели двух моно-спойных клеточных линий: L929 (мышиные фибробласты) и CHO-K1 (клетки яичника китайского хомячка), полученных из Российской коллекции клеточных культур позвоночных (РККК П) института цитологии РАН (г. Санкт-Петербург). Вне периода постановки опытов коллекционные культуры клеток сохраняли в криоконсервированном состоянии в биохранилище с жидким азотом при -196 оС.
Все этапы работы с перевиваемыми линиями клеток были выполнены в соответствии с рекомендациями [4, 7].
Для культивирования клеток использовали пластиковую посуду различного формата для работы с клеточными культурами (Multiple well plates, ф. Costar) и отечественную полусинтетическую питательную среду F12 производства ФГУП «Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов» института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН. На ее основе готовили полную среду выращивания, используемую на всех этапах работы с клеточными культурами [4]. Для снятия монослоя кле-
ток с поверхности пластика применяли коммерческие растворы трипсина и версена. Культивирование проводили в СО2-инкубаторе при 37 оС, концентрации СО2 5— 7 %, влажности не менее 70 %.
Каждый цикл исследований по проверке цитотоксичности испытуемых образцов антигенов состоял из ряда последовательных эпапов: размораживание клеток L929 и CHO-K1, их адаптация к условиям культивирования, контроль жизнеспособности клеток, морфологии и адгезивных свойств, пролиферативной активности. Для оценки жизнеспособности клеток использовали тест окраски трипановым голубым [1].
В течение первых двух недель в периоде адаптации индикаторных культур к условиям культивирования ежедневно просматривали высевы с помощью инвертированного микроскопа. Смену среды и пересевы клеток выполняли каждые 3—4 суток, постепенно наращивая популяцию каждой из линий до концентраций, необходимых для выполнения основных опытов. На этапе подготовки были определены оптимальные концентрации кл/см2 поверхности лунки, обеспечивающие формирование в течение суток монослоя клеток-мишеней, равномерно заполняющего всю площадь лунки.
При выполнении микроварианта теста цитотоксичности, применявшегося для множественного скрининга различных антигенов возбудителя мелиоидоза, использовали 48-луночные (48-л) пластины, в лунки которых вносили по 6 х 104 клеток в объеме 0,25 мл. Для изучения динамики гибели клеток-мишеней вследствие контакта с антигеном был изменен формат плас-
72 Выпуск 2 (42). 2012
тин. В каждую лунку 12-луночных (12-л) пластин вносили по 3 х 105 клеток в объеме 1 мл. Через сутки пластины со сформированным монослоем клеток-мишеней были готовы к постановке основных опытов. Как в первом, так и во втором варианте исследования выполняли одновременно на двух линиях клеток.
Объектами тестирования являлись антигены Burkholderia pseudomallei (10 образцов), отличавшиеся по химическому составу и локализации в микробной клетке, изолированные из капсульной субстанции, клеточной стенки или являвшиеся смесью водорастворимых компонентов бактерий, прошедшие контроль специфической стерильности. Объемы вносимых образцов варьировали в зависимости от формата опытных пластин (от 1—2 до 40 мкл). На каждой пластине в 2—3 лунки с монослоем антиген не вносили (контроль). Время контакта клеток с антигеном — 3 суток, условия инкубации, как описано выше, просмотр и регистрация результатов — ежедневно. Учету подлежали время контакта биологически активного вещества с клетками, концентрации вносимых веществ в лунку, морфологические изменения и адгезивные свойства клеток. При учете результатов использовали качественные и количественные показатели (в зависимости от целевой установки конкретного опыта).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Возможность работы с паспортизированными клеточными линиями с хорошо изученными свойствами (морфология клеток, характер роста, питательные потребности) в значительной степени облегчила выполнение подготовительных этапов по адаптации культур L929 и CHO-K1 к конкретным условиям и последующей оптимизации режимов наращивания популяций в культуральных пластинах различного формата. При этом была изучена не только типичная морфология клеток, но и проведена оценка репродуктивного потенциала популяций.
Анализ характера кривых роста популяций свидетельствовал об активной пролиферации клеток в оптимизированных условиях их культивирования, а также позволил определить временной интервал, при котором среда культивирования не истощается и возможен корректный учет результатов воздействия антигенов на клетки-мишени, равный 4 суткам (рис.).
При постановке микроварианта теста цитотоксичности в лунки опытных 48-л пластин вносили образцы антигенов в объеме 20 мкл. В течение 3 суток наблюдения было отмечено нарастание изменений в популяциях клеток. В случаях токсического воздействия антигенов на монослой клеток индикаторных культур изменялась их форма, появлялись удлиненные, округлые, увеличенные в объеме, полигональные клетки, внутриклеточные включения, разрушенные клетки и их тени, детрит в межклеточных пространствах, участки свободной поверхности пластика, площадь которых при нарастании числа погибших клеток увеличивалась.
Рис. Кривые роста популяций клеток L929 и CHO-K1 в течение срока наблюдения
В результате первичного тестирования образцов антигенов установлено, что наиболее выраженным токсическим воздействием на клетки-мишени обладали экзополисахариды внеклеточной капсульной субстанции B. pseudomallei 100 и 57576, вызвавшие массовую гибель клеток L929 и CHO-K1 уже в течение первых суток. В то же время какие-либо изменения в монослойных культурах линий L929 и CHO-K1 в присутствии двух антигенов, липида А и кор-антигена B. pseudomallei 100 не отмечены. Различную степень цитопатогенности проявили остальные из проверенных антигенов (гликопротеин капсулы B. pseudomallei 100, кор-Аг B. pseudomallei 57576, комплекс Аг 6+d B. pseudomallei 57576, водносолевые экстракты B. pseudomallei51274, 60913 и 100).
Микровариант теста цитотоксичности был использован для определения минимальных токсических доз (МТД) антигенов, использованных в работе. Этот показатель МТД является характеристикой конкретного образца препарата и был необходим для корректной оценки результатов экспериментов по изучению динамики гибели клеток-мишеней при контакте с антигенами B. pseudomallei, выполненных в формате 12-л пластин, с подсчетом относительных показателей жизнеспособности клеток при воздействии на них различных доз антигенов.
В опытах по изучению динамики гибели клеток-мишеней при контакте с антигенами B. pseudomallei, применявшихся в различных дозировках, были получены следующие данные (рис. 2). Установлено, что через сутки после внесения 3 МТД экзополисахарида B. pseudomallei 100 в лунки со сформированным монослоем клеток наступала массовая гибель в популяциях клеток как L929, так и СНО-К1. Этот факт свидетельствовал о том, что данные линии клеток пригодны для использования в качестве индикаторных культур при выявлении случаев острой токсичности в течение относительно короткого периода времени (1 сут), особенно когда это касается биополимеров, входящих в группу факторов вирулентности B. pseudomallei.
Антигены внеклеточной субстанции B. pseudomallei были представлены еще одним антигеном — гликопротеином 200 kDa B.pseudomallei 100. В субтоксической дозировке 0,5 МТД он не вызывал патологических изменений клеток-мишеней. Эти данные будут востребо-
Выпуск 2 (42). 2012
73
ваны нами для коррекции схем иммунизации животных-продуцентов специфических сывороток к антигену-маркеру вирулентных штаммов возбудителя мелиоидоза.
Выраженное цитопатогенное воздействие на клетки-мишени оказал кор-антиген B. pseudomallei 57576, который в дозировке 0,8 МТД вызывал к концу срока наблюдения гибель 20 и 25 % клеток в популяциях линий L929 и СНО-К1 соответственно. При этом отличия в снижении жизнеспособности клеток линий L929 и СНО-К1 по сравнению с началом опыта как в первом, так и во втором случае были достоверными р < 0,05). При этом следует отметить, что во всех апробированных вариантах тестов существенных отличий в чувствительности клеток L929 и СНО-К1 в отношении одних и тех же антигенов не выявлено.
Разнообразие вариантов влияния на жизнеспособность клеток-мишеней подтвердили опыты с использованием 3 образцов водно-солевых экстрактов различных штаммов B. pseudomallei, два из которых оказывали слабо выраженное цитопатогенное воздействие на клетки. Третий — водно-солевой экстракт B. pseudomallei51274. Этот антиген достоверно снижал показатели числа жизнеспособных клеток в популяциях L929 и СНО-К1 на 19 и 30 % соответственно (в случае применения дозировки, равной 0,7 МТД).
Таким образом, выполненное исследование позволило получить новые данные о характере биологической активности использованных в работе соединений непосредственно на клеточном уровне. Апробирована клеточная модель для определения токсических свойств антигенов возбудителя мелиоидоза in vitro. Разработаны приоритетные варианты тестов цитотоксичности in vitro, которые могут найти применение в качестве дополнительного метода оценки: 1) потенциальных компонентов экспериментальных химических комплексных вакцин; 2) корректного выбора антигенного материала для воспроизведения различных схем иммунизации животных-продуцентов гипериммунных сывороток; 3) динамики накопления токсичных метаболитов в жидких питательных средах выращивания штаммов B. pseudomallei с различной вирулентностью для биомоделей; 4) при отборе штаммов-продуцентов токсичных биополимеров B. pseudomallei.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Области практического применения культур перевиваемых линий клеток для тестирования in vitro различных биополимеров постепенно расширяются [3, 9, 10].
В настоящее время преимущества определения цитотоксичности антигенов in vitro по сравнению с постановкой биопробы в части экономичности, универсальности, воспроизводимости, относительной простоты в исполнении не вызывают сомнения [2, 5, 8]. Однако сведения о применении клеточных моделей in vitro для изучения и оценки токсичности различных антигенных комплексов B.pseudomallei ограничены. Известно, что возбудитель мелиоидоза продуцирует ряд биологически активных соединений, в том числе токсинов, частично охарактеризованных, выявляемых чаще всего в жидких средах культивирования, входящих в группу соединений, отнесенных к факторам вирулентности и патогенности B.pseudomallei [6]. Изучение этих факторов во взаимодействии с клеткой в тестах in vitro — востребованное и актуальное направление исследований.
ЛИТЕРАТУРА
1. Вилсон Э. // Культура животных клеток. Методы / Под ред. Р Фрешни. — М.: Мир, 1989. — С. 256—303.
2. Дмитриева М. Н., Грубер И. М., Гаврилова Н. А. и др. // Журн. микробиол. — 1999, № 2. — С. 32—35.
3. Еропкин М. Ю. // Токсикол. вестн. — 1999. — № 5. — С. 7—13.
4. Культура животных клеток. Методы: Пер. с англ. / Под ред. РФрешни. — М.: Мир, 1989. — 333 с.
5. Лукьянов А. С., Лукьянова Л. Л., Чернавская Н. М., Гилязов С. Ф. // Биэтика. — М.: Изд-во МГУ, 1996. — 253 с.
6. Пивень Н. Н., Илюхин В. И. // Журн. микробиол. — 2000. — № 6. — С. 94—99.
7. Animal cell culture. Third edition. A practical approach / Ed by J. W. Masters. — Oxford, 2000. — 315 pp.
8. Grant R. L., Acosta J. D., Smith M. A. // Comprehensive Toxicology on CD-ROM. — Elsevier Sci., 1997. — Vol. 1.
9. Wilson A. P Cytotoxicity and viability assays. Ch. 7 // In Animal cell culture. Third edition. A practical approach. — Oxford, 2000. — P 175—219.
10. Walum E, Ekwall B. // ALTA. — 2000. — Vol. 28, Suppl. 1. — P. 159.
Контактная информация
Храпова Наталья Петровна—д. м. н., профессор кафедры молекулярной биологии и генетики, Волгоградский государственный медицинский университет, зав. отделом иммунологии и лабораторией иммунодиагностики и биотехнологии ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора, e-mail: [email protected]
74
Выпуск 2 (42). 2012
