CC BY
2
© Коллектив авторов, 2024
Почтарь Е.В.1, Луговская С.А.1' 2, Наумова Е.В.1 2, Почтарь М.Е.1' 2,
Дмитриева Е.А.2, Костин А.И.3
Оценка субпопуляционного состава моноцитов при хроническом лимфолейкозе
1 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 125993, г. Москва, Российская Федерация
2 Государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Московский многопрофильный научно-клинический центр имени С.П. Боткина» Департамента здравоохранения г. Москвы, 125284, г. Москва, Российская Федерация
3 Государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского» Департамента здравоохранения г. Москвы, 129090, г. Москва, Российская Федерация
Резюме
Введение. Моноциты относятся к клеткам врожденного иммунитета. Комитетом по номенклатуре Международного союза иммунологических обществ в 2010 г. одобрено разделение моноцитов на 3 субпопуляции в зависимости от экспрессии CD14 (высокоаффинный рецептор к липополисахариду) и CD16 (низкоаффинный рецептор к IgG): классические (МО1), промежуточные (МО2) и неклассические моноциты (МО3). Учитывая важную роль моноцитов-макрофагов как компонентов микроокружения клеток хронического лимфолейкоза (ХЛЛ), а также имеющиеся на сегодняшний день противоречивые данные в оценке субпопуляций моноцитов, заслуживает внимание изучение субпопуляционного состава моноцитов в зависимости от стадии ХЛЛ и проводимой терапии.
Цель работы - анализ субпопуляционного состава моноцитов в периферической крови пациентов с ХЛЛ в зависимости от стадии заболевания и проводимой терапии.
Материал и методы. Материалом для исследования служила цельная венозная кровь, стабилизированная антикоагулянтом К2-ЭДТА. В исследование включены 30 доноров и 196 пациентов с диагнозом ХЛЛ (50 с первично выявленным, нелеченым ХЛЛ и 146 - находящихся на терапии). Для оценки субпопуляционного состава моноцитов крови использовалась панель конъюгатов моноклональных антител (МкАт), включающая CD3-FITC, CD56-PE, CD16-PE-Cy7, CD14-APC и CD45-APC-Cy7 (BD Biosciences, США, и Beckman Coulter, США). Исследования проводили на проточном цитометре FACSCanto II (BD Biosciences, США). Определяли 3 субпопуляции моноцитов: МО1 (CD14++CD16), МО2 (CD14++CD16+) и МО3 (CD14+CD16++).
Результаты. Проведенное исследование субпопуляционного состава моноцитов крови показало, что основной субпопуляцией моноцитов периферической крови при ХЛЛ является МО1. У пациентов с ХЛЛ на терапии, не содержащей ибрутиниб, наблюдалось достоверное снижение относительного содержания МО1 по сравнению к другим обследованными группами пациентов. Также отмечалось достоверное увеличение относительного содержания МО2 во всех группах пациентов с ХЛЛ по отношению к группе доноров. Анализ относительного содержания МО3 выявил его достоверное увеличение у пациентов, находящихся на терапии, не содержащей ибрутиниб, по отношению к донорам и группам пациентов с ХЛЛ, получавшим другие схемы лечения.
Заключение. Во всех группах пациентов с ХЛЛ наблюдаются изменения субпопуляционного состава моноцитов за счет увеличения относительного содержания промежуточных форм (МО2). Снижение относительного содержания МО1 и увеличение процентного содержания МО3 отмечалось у пациентов, получающих терапию, не содержащую ибрутиниб. Анализ абсолютного содержания субпопуляций моноцитов при ХЛЛ в исследуемых группах не выявил достоверных различий.
Ключевые слова: хронический лимфолейкоз; субпопуляции моноцитов; ибрутиниб
Статья получена 29.08.2024. Принята в печать 11.10.2024.
Для цитирования: Почтарь Е.В., Луговская С. А., Наумова Е.В., Почтарь М.Е., Дмитриева Е.А., Костин А.И. Оценка субпопуляционного состава моноцитов при хроническом лимфолейкозе. Иммунология. 2024; 45 (5): 642-653. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-5-642-653
Для корреспонденции
Почтарь Евгений Владимирович -кандидат медицинских наук, ассистент кафедры клинической лабораторной диагностики с курсом лабораторной иммунологии ФГБОУ ДПО РМАНПО Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-3743-3040
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Луговская С.А., Почтарь Е.В.; сбор и обработка материала - Почтарь Е.В., Дмитриева Е.А.; статистическая обработка - Почтарь Е.В.; написание текста -Луговская С.А., Почтарь Е.В.; редактирование - Наумова Е.В., Почтарь М.Е., Костин А.И.
Pochtar E.V.1, Lugovskaya S.A.1, Naumova E.V.1, Pochtar M.E.1, Dmitrieva E.A.2, Kostin A.I.3
Evaluation of monocyte subpopulation composition in chronic lymphocytic leukemia
1 Russian Medical Academy of Continuing Professional Education, Ministry of Health of the Russian Federation, 125993, Moscow, Russian Federation
2 S.P. Botkin Moscow Multidisciplinary Research and Clinical Center, Department of Healthcare of the City of Moscow, 125284, Moscow, Russian Federation
3 Scientific Research Institute of Ambulance named after N.V. Sklifosovsky, Department of Healthcare of the City of Moscow, 129090, Moscow, Russian Federation
Abstract
Introduction. Monocytes refer to cells of innate immunity. In 2010 the International Union of Immunological Societies Nomenclature Committee approved the division of monocytes into 3 subpopulations based on the expression of high-affinity receptor to lipopolysaccharide (CD14) and low-affinity receptor to IgG (CD16): classical (MO1), intermediate (MO2) and non-classical monocytes (MO3). Given the important role of monocytes as components of the microenvironment of chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells, as well as the currently available contradictory data in the assessment of monocyte subpopulations, further study of the subpopulation composition of monocytes depending on the stage of CLL and the current therapy deserves attention.
The aim of the study is to analyse the subpopulation structure of monocytes in the peripheral blood of patients with CLL.
Material and methods. The material for the study was whole venous blood stabilized with anticoagulant K2-EDTA. The study included 30 donors and 196 patients diagnosed with CLL (50 with primary diagnosed, untreated CLL and 146 patients on therapy). To assess the subpopulation composition of blood monocytes we used a panel of Mab conjugates including CD3-FITC, CD56-PE, CD16-PE-Cy7, CD14-APC and CD45-APC-Cy7 (BD Biosciences, USA, and Beckman Coulter, USA). We determined 3 subpopulations of monocytes: MO1 (CD14++CD16), MO2 (CD14++CD16+) and MO3 (CD14+CD16++).
Results. The study of blood monocyte subpopulation showed that the main subpopulation of peripheral blood monocytes in CLL is represented by MO1. Patients with CLL on therapy not containing ibrutinib showed a significant decrease in the relative content of the MO1 compared to other examined groups of patients. Also, there was a significant increase in the relative content of the MO2 subpopulation in all groups of CLL patients in relation to the donor group. Analysis of the relative content of the MO3 subpopulation revealed a significant increase in its value in patients on ibrutinib-free therapy in comparison with donors and groups of patients with CLL treated with other regimens.
Conclusion. In all groups of patients with CLL, changes in the subpopulation of monocytes were observed due to an increase in the relative content of intermediate forms (MO2). Decrease in the relative content of MO1 and increase in the relative content of MO3 were observed in patients receiving therapy without ibrutinib. Analysing the absolute content of monocyte subpopulations in CLL in the studied groups did not reveal significant differences.
Keywords: chronic lymphocytic leukemia; monocyte subpopulations; ibrutinib
Received 29.08.2024. Accepted 11.10.2024.
For citation: Pochtar E.V., Lugovskaya S.A., Naumova E.V., Pochtar M,E., Dmitrieva E.A., Kostin A.I., Evaluation of monocyte subpopulation composition in chronic lymphocytic leukemia. Immunology. 2024; 45 (5): 642-53. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-5-642-653 (in Russian)
For correspondence
Evgeniy V. Pochtar - PhD, Assistant of the Clinical Laboratory Diagnostics Chair with a Course
of Laboratory Immunology, RMACPE, MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-3743-3040
Funding. The study had no sponsor support.
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Authors' contribution. Concept and design of the study - Lugovskaya S.A., Pochtar E.V.; collection and processing of material - Pochtar E.V., Dmitrieva E.A.; statistics analysis - Pochtar E.V.; text writing - Lugovskaya S.A., Pochtar E.V.; editing - Naumova E.V., Pochtar M.E., Kostin A.I.
Введение
Моноциты относятся к клеткам врожденного иммунитета, которые осуществляют важные функции в иммунопатогенезе вирусных и бактериальных инфекций, системном воспалительном ответе, развивающемся на фоне инфекционного процесса [1, 2]. Кроме того, они являются ключевыми предшественниками опухоль-ассоциированных макрофагов и дендритных клеток, формирующих микроокружение опухоли. Представляя пул эффекторных клеток врожденного иммунитета с паттерн-распознающими рецепторами, они могут выступать в качестве регуляторов опухолевого роста.
В 2010 г. международной группой экспертов, входящих в состав Международного союза иммунологических обществ (ЩГБ), при поддержке Всемирной организации здравоохранения была утверждена официальная номенклатура, основанная на оценке экспрессии молекул СБ14 (рецептора к липополисахариду бактериальной стенки) и СБ16 (компонента рецепторного комплекса к Г§в), согласно которой были выделены 3 субпопуляции моноцитов: классические (МО1), промежуточные (МО2) и неклассические моноциты (МО3). Каждая субпопуляция обладает фенотипическими и функциональными особенностями (рис. 1) [3-6].
К МО1 относят субпопуляцию клеток с фенотипом СБ14++СБ16-. В норме они составляют ~ 80-85 % всей популяции моноцитов, характеризуются выраженной фагоцитарной и микробицидной активностью. При стимуляции эти клетки отличаются активным синтезом
СШ6+-моноциты
Промежуточные ^^^^
моноциты ^^^^^
СШ4++СШ6+ тт
Неклассические
моноциты
CD14+CD16++ »
Рис. 1. Номенклатура моноцитов периферической крови (по [3])
Число символов характеризует плотность рецепторов на клетке. Стрелки - этапы развития. Расположение неклассических моноцитов ближе к стенке сосуда указывает на предпочтительную локализацию данных клеток в маргинальной зоне сосудистого русла в составе пристеночного пула клеток.
хемокинов и умеренной продукцией провоспалитель-ных цитокинов (ФНОа, ИЛ-ip, ИЛ-10 и др.). Они первыми мигрируют в очаг воспаления, где трансформируются в воспалительные макрофаги [7].
МО2 (CD14++CD16+) составляют одну из минорных субпопуляций моноцитов. Считается, что эти клетки образуются в результате активации и дифференцировки МО1 [8]. Их основные функции - умеренная фагоцитарная способность, распознавание патоген-ассоции-рованных молекулярных паттернов (Pathogen-associated molecular patterns - PAMP), усиленный синтез провос-палительных цитокинов (ФНОа, ИЛ-1Р и др.) в ответ на стимуляцию бактериальными патогенами, выраженная способность к активации T-хелперов, индукция ангио-генеза [9].
Субпопуляция МО3 (CD14+CD16++) с минимальной плотностью экспрессирует CD14 и с максимальной плотностью - HLA-DR и костимуляторные молекулы. Они являются предшественниками резидентных тканевых макрофагов. Одна из основных функций МО3 -антиген-презентирующая. Активация этих клеток также приводит к синтезу и секреции цитокинов ИЛ-1 и ИФН-а при слабо выраженной способности к фагоцитозу. В исследованиях J. Skrzeczynska-Moncznik и соавт. (2008) [7] и R. Mukherjee и соавт. (2015) [8] показан высокий уровень продукции ФНОа и ИЛ-1 в МО3 в ответ на стимуляцию ЛПС и S. aureus, а также низкий уровень продукции ИЛ-10.
Разделение моноцитов на субпопуляции осуществляется методом проточной цитометрии с использованием МкАт CD14 и CD16 после выделения гейта моноцитов.
При сепсисе, по данным А. А. Калашниковой и соавт. (2018) [10], увеличивается абсолютное количество моноцитов, снижается численность МО1, увеличивается относительное и абсолютное число МО2, при этом численность субпопуляции МО3 меняется незначительно.
Наибольшее число работ по оценке субпопуляци-онного состава моноцитов приходится на исследования инфекционных и сердечно-сосудистых заболеваний и их осложнений [11, 12]. Так, в работе K.S. Rogacev и соавт. (2012) [13] при проспективном анализе сердечно-сосудистых событий у 951 пациента, направленного на плановую коронарную ангиографию, было показано, что только увеличение субпопуляции МО2 (CD14++CD16+) является независимым предиктором развития сердечно-сосудистых осложнений у данной группы пациентов.
Работы по анализу количества и субпопуляцион-ного состава моноцитов при хроническом лимфо-
О 250
200
150
100 -
50-
105
10:
103
0-
-3-56-16-14-45
102
10
3
10
4
105
CD45 APC-Cy7-A 3-56-16-14-45
мотоз
0 101
102
МОТО1
103
MONO2
104
105
-3-56-16-14-45
105
104
«. ы л
м
Рч
103 -.
0-
-1,092"
СБ14-СБ16-
• /¿'"'»И: • -'.л?»-
0 101
102 103 104 CD14 APC-A
105
Specimen Name: Tube Name: 3-56-16-14-45
Population #Events %Parent
| MONO 4,117 8,8
| MONO1 3,518 94,2
| MONO2 62 1,7
| MONO3 147 3,9
CD14 APC-A
Рис. 2. Выделение субпопуляций моноцитов донора на проточном цитометре
Здесь и на рис. 3—5: А—В — этапы гейтирования (см. описание в тексте); Г — данные статистики по субпопуляциям моноцитов.
лейкозе (ХЛЛ) малочисленны и противоречивы. Учитывая важную роль моноцитов как компонентов микроокружения клеток ХЛЛ, а также имеющиеся на сегодняшний день противоречивые данные при оценке субпопуляций моноцитов, заслуживает внимание дальнейшее изучение субпопуляционного состава моноцитов в зависимости от стадии ХЛЛ и проводимой терапии.
Материал и методы
Участники исследования. В исследование были включены 30 доноров и 196 пациентов с диагнозом ХЛЛ. Все доноры (20 мужчин и 10 женщин) в возрасте от 21 года до 54 лет (медиана - 38 лет) проходили
медицинское обследование в отделении клинической, производственной трансфузиологии и гравитационной хирургии крови ГБУЗ «НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского» ДЗМ (заведующий отделением -канд. мед. наук А.И. Костин) в соответствии с приказом МЗ РФ № 1166н от 28.10.2020 «Об утверждении порядка прохождения донорами медицинского обследования и перечня медицинских противопоказаний (временных и постоянных) для сдачи крови и (или) ее компонентов и сроков отвода, которому подлежит лицо при наличии временных медицинских показаний, от донорства крови и (или) ее компонентов».
Из 196 пациентов с ХЛЛ 50 человек (27 женщин и 23 мужчин) от 48 до 84 лет были с первично выяв-
Таблица 1. Сравнение субпопуляционного состава моноцитов по относительному содержанию (%) и абсолютному содержанию в исследуемых группах пациентов с хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ) и у доноров
Субпопуляции моноцитов Исследуемые группы Р
ХЛЛ (I группа) (n = 50) ХЛЛ (Па подгруппа) (n = 59) ХЛЛ (IIb подгруппа) (n = 57) ХЛЛ (III группа) (n = 30) Доноры (n = 30)
Классические (МО1) (CD14++CD16-), % Me (P10-P90) 89,50 (74,4896,98) 89,95 (71,2097,13) 88,95 (75,3497,28) 81,10 (61,5294,43) 91,00 (83,4296,22) III/D - 0,0003 III/I - 0,0019 III/IIa - 0,017 III/IIb - 0,0025
Классические (МО1) (CD14++CD16-), (109/л) Me (P10-P90) 0,37 (0,08-1,19) 0,43 (0,190,83) 0,45 (0,160,65) 0,31 (0,031,78) 0,43 (0,250,68) ns
Промежуточные (МО2) (CD14++CD16+), % Me (P10-P90) 5,5 (1,4416,36) 5,9 (1,5812,44) 6,2 (2,014,9) 5,75 (1,5514,11) 2,9 (1,046,5) I/D - 0,0234 IIa/D - 0,0051 IIb/D - 0,0061 III/D - 0,0332
Промежуточные (МО2) (CD14++CD16+), (109/л) Me (P10-P90) 0,018 (0,0040,06) 0,026 (0,0040,099) 0,025 (0,0070,081) 0,024 (0,0010,09) 0,016 (0,0030,033) ns
Провоспалительные (МО3) (CD14+CD16++), % Me (P10-P90) 3,4 (0,2614,94) 3,9 (0,512,55) 4,4 (0,6812,48) 10,8 (3,9631,8) 4,35 (1,0311,59) III/D - 0,0026 III/I < 0,0001 III/IIa - 0,0002 III/IIb - 0,0001
Провоспалительные (МО3) (CD14+CD16++), (109/л) Me (P10-P90) 0,013 (0,0010,09) 0,014 (0,0030,118) 0,014 (0,0030,084) 0,03 (0,00010,2) 0,023 (0,0060,049) ns
Примечание. Данные представлены в виде: Me - медиана; P10 - 10 % процентиль; P90 - 90 % процентиль; n - объем выборки; р - уровень значимости отличий: I/D, IIa/D, IIb/D, III/D - между показателями доноров и пациентов I группы, подгрупп 11а и IIb и III группы соответственн; ns - различия между сравниваемыми группами статистически недостоверны.
ленным, нелеченым ХЛЛ (I группа) и 146 - находящихся на различных схемах терапии. Пациентов, получающих терапию, разделили на 2 группы: II группа [116 человек; 48 женщин и 68 мужчин, медиана возраста 66 лет (от 36 до 92 лет)] - пациенты с ХЛЛ, получавших ибрутиниб-содержащие схемы лечения (ибрутиниб в виде монотерапии и в сочетании с гази-вой или венетоклаксом) и III группа (30 человек; 11 женщин и 19 мужчин) - пациенты с ХЛЛ, получавшие различные флюдарабин-содержащие схемы (РСЯ, РСЯ-Ше). Пациенты II группы имели длительность заболевания от 1 года до 20,5 лет. Число предшествующих линий терапии (лейкеран, РСЯ, РСЯ-Ше, КБ, ЯСУР, ЯС1Ъ, ВЯ, Я-СИОР преднизолон-Я, вВ/в, СУР/ЯСУР и др.) варьировало от 0 до 12 (медиана -2,5). По длительности приема ибрутиниб-содержа-щих схем II группа была разделена на 2 подгруппы: группа Па - пациенты, получавшие терапию от 8 до 24 нед (медиана - 19,0 нед) - 59 человек (23 женщины и 36 мужчин); группа ПЪ - пациенты с более длительной терапией (от 25 до 58 нед; медиана -39,0 нед) - 57 человек (25 женщин и 32 мужчины). Выбор тактики терапии зависел от соматического статуса пациента и результатов клинико-лабораторных исследований.
Все пациенты проходили обследование и лечение в Московском городском гематологическом центре (МГГЦ, заведующий дневным стационаром - д-р мед.
наук, проф. Е. А. Никитин) и 6-м гематологическом отделении ГБУЗ «Городская клиническая больница им. С.П. Боткина» ДЗМ (заведующий отделением - В.А. Доронин). В работе соблюдались нормы, утвержденные в Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации 1964 г. До включения в исследование у всех участников было получено письменное информированное согласие на участие в исследовании и обработку персональных данных. Исследование одобрено этическим комитетом РМАНПО Минздрава России (11.12.2018).
Лабораторные исследования. Материалом для исследования служила цельная венозная кровь, стабилизированная антикоагулянтом К2-ЭДТА. Для оценки абсолютного числа моноцитов выполняли общий анализ крови на гематологическом анализаторе ВС6800 (Mindray, Китай).
Иммунофенотипирование осуществлялось на проточном цитометре FACSCanto II (BD Biosciences, США) с использованием программного обеспечения BD FACSDiva Software version 6.1.3 с использованием многоцветной диагностической панели конъюгированных моноклональных антител (МкАт), включающей CD3-FITC, CD56-PE, CD16-PE-Cy7, CD14-APC и CD45-APC-Cy7 (BD Biosciences, США, и Beckman Coulter, США).
В ходе данного исследования определяли 3 субпопуляции моноцитов: классические моноциты (МО1 -CD14++CD16), промежуточные (МО2 - CD14++CD16+) и неклассические (МО3 - CD14+CD16++) (рис. 2). Для
g 250
200
150-
О и и
100-
50-
Э
102
3-56-16-14-45
10
3
10
|4
CD45 APC-Cy7-A 3-56-16-14-45
105
Э
3-56-16-14-45
105
104 -
y -C
м
P
CD103
0:
-2,049
: * * * . « •! ■ , ' ' л : • I/' «Hi •• • ■ м» ■ « }f * * -v Я' »•V »/ V#. • • * • i , iv в * в м * * i \
■ * . . 4 Щ
........1 1 1 ......1 1
228 0 102
103
CD14 APC-A
104
105
10
5. "
10
,4-
y -C
М
P
О 103-о 10
. monq3 а ' '
. ■ «II ♦ ' I
Ч . Л " Ъ А 4
»- л**, Н
' •ni^'.'j-.
0-
-2,049 = -228
Mono2
1 II",» »
0 10
103 104
CD14 APC-A
105
Specimen Name: Tube Name: 3-56-16-14-45
Population #Events %Parent
| MONO 6,056 1,7
Щ MONO1 4,389 92,2
| MONO2 106 2,2
Щ MONO3 262 5,5
Рис. 3. Пример субпопуляционного состава моноцитов периферической крови пациента с первичным нелеченым хроническим лимфолейкозом
этого, используя график CD45 vs SSC, выделяли популяцию лейкоцитов (гейт WBC) и моноцитов (гейт MONO) (рис. 2А). Исключали из гейта Т-лимфоциты (по CD3) и НК-клетки (по CD56). График CD 14 vs CD 16 строили в зависимости от гейта MONO, где выделяли гейт CD14CD16- (серый цвет) (рис. 2Б). Затем на графике CD14 vs CD16 выделяли 3 популяции моноцитов с учетом исключения последнего гейта [CD14CD16] (рис. 2В).
Статистическая обработка. Статистические данные обрабатывали с использованием программы GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., США). Для каждого массива данных проводили оценку нормальности распределения с использованием критерия Колмо-
горова-Смирнова с поправкой Большева для группы доноров. Так как распределение данных не соответствовало нормальному закону, результаты исследования представляли в виде медианы, 10 и 90 % процентилей, а для анализа значимости различий использовались непараметрические методы. В группах непрерывных данных с независимыми выборками применяли статистический анализ с использованием теста Краскелла-Уоллиса. Для выявления взаимосвязи между двумя непрерывными переменными, не распределенными по нормальному закону, использовали коэффициент ранговой корреляции Спирмена (р).
Критический уровень достоверности нулевой гипотезы принимался равным 0,05.
э
; 250-
200
150-
о
и
100-
50
Э
10
10
кУ
О
н
Рч
чо
3
О
10
-1,274
-2,212
3-56-16-14-45
102
10
10
4
105
CD45 APC-Cy7-A 3-56-16-14-45
Э
3-56-16-14-45
105т
104
о н
Рч
О 103
о
0-
-1,274'
"V / * г , • 1 '
V-'
% ■ ¿Шк - * . 1 г ■ „ V* '
Ж; < ■ ' ■
'' . * Щ
щ •
-2,212
103 104 CD14 APC-A
105
Specimen Name: Tube Name: 3-56-16-14-45
Population #Events %Parent
Щ MONO 2,404 0,9
Щ MONO1 1,557 88,4
| MONO2 75 4,3
| MONO3 125 7,1
CD14 APC-A
Рис. 4. Пример субпопуляционного состава моноцитов периферической крови пациента с хроническим лимфолейкозом на терапии ибрутинибом
0
Результаты
При исследовании субпопуляционного состава моноцитов периферической крови анализировали относительное и абсолютное содержание субпопуляций моноцитов.
Анализ нормальности распределения содержания субпопуляций моноцитов в группах пациентов с ХЛЛ и доноров показал наличие нормального распределения данных только для относительного содержания МО1. Относительное содержание МО2 и МО3, а также абсолютное содержание МО1, МО2 и МО3 носили логнормальный характер. В связи с этим анализ относительного содержания МО1 проводили с использованием параметрических, а анализ относительного содержания МО2, МО3, а также абсолютного содержания МО1, МО2 и МО3 -
непараметрических статистических методов. Результаты исследований приведены на рис. 3-5 и в табл. 1.
Проведенное исследование показало, что основной субпопуляцией моноцитов периферической крови при ХЛЛ являются МО1. У пациентов с ХЛЛ на терапии, не содержащей ибрутиниб, наблюдалось достоверное снижение относительного содержания МО1 по отношению к другим исследуемым группам (р = 0,0003; р = 0,0019; р = 0,017 и р = 0,0025 соответственно) (рис. 6А). Отмечалось достоверное увеличение относительного содержания МО2 во всех группах пациентов с ХЛЛ по отношению к группе доноров (р = 0,0234; р = 0,0051; р = 0,0061 и р = 0,0332 соответственно) (рис. 7А). Анализ относительного содержания МО3 выявил его достоверное
200
и
м м
150-
100
50
Э
105
104
о
И Гц
3 103
о
0-
-1,126
3-56-16-14-45
-162 0 102 (-153, -691)
103
CD14APC-A
104
105
Э
3-56-16-14-45
,■ 1 ■ \
\ WBC мото 1
\
■•''Ж1'' ■
ЙШ1
\ амвЩЛ
.......1 1 102 103 104 CD45 APC-Cy7-A 3-56-16-14-45 105
" . моте?- ■ ■ ■ ' / \ MONO2 ■,./ , . . \ чф . \ \
Г'^Щу у
1
^Г т | I
MONOÍ щ| .........
105
104
о
И Гц
6
3 103
о
-ч»
-1,126
........г
162 0 102
3
10
CD14 APC-A
104
105
Specimen Name: Tube Name: 3-56-16-14-45
Population #Events %Parent
■ MONO 1,801 1,6
■ MONO1 720 72,5
■ MONO2 173 17,4
■ MONO3 99 10,0
Рис. 5. Пример субпопуляционного состава моноцитов периферической крови пациента с хроническим лимфолейкозом на фоне терапии, не содержащей ибрутиниб
о 250
0
увеличение у пациентов, находящихся на терапии, не содержащей ибрутиниб, по отношению к другим группам пациентов с ХЛЛ (р = 0,0026; р < 0,0001; р = 0,0002 и р = 0,0001 соответственно) (рис. 8 А) и к группе доноров.
При оценке абсолютного содержания субпопуляций моноцитов не выявлено достоверных отличий этого показателя как между подгруппами пациентов с ХЛЛ, так и по отношению к группе доноров (рис. 6Б, 7Б, 8Б).
Обсуждение
Несмотря на то, что в литературе последних лет регистрируются многочисленные исследования субпопуляций моноцитов при различных патологиях (сердечно-сосудистые заболевания, воспалительные процессы, сахарный диабет и др.), отмечается крайне малочисленные и доста-
точно противоречивые сведения об изменениях субпопу-ляционного состава моноцитов при ХЛЛ. Так, в работе R. Maífei и соавт. (2013) [14] отмечалось значительное увеличение относительного содержания неклассических моноцитов при ХЛЛ. Однако относительное содержание МО2 было выше в группе здоровых добровольцев, а не в группе пациентов с ХЛЛ. Кроме того, в этой работе не обнаружена корреляция между относительным содержанием отдельных субпопуляций и стадией ХЛЛ, количеством лейкоцитов и экспрессией CD38 или ZAP-70, а также не выявлено связи между тремя субпопуляциями моноцитов и мутационным статусом гена ЮУИ.
В работе Ж Kowalska и соавт. (2022) [15] отмечалось повышение относительного содержания МО3-моно-цитов у пациентов с ХЛЛ, которое снижалось с про-
Классические моноциты (МО1) (относительное содержание)
100 -
50 -
ns ns ns **
I 11 11 11 I
Ttff Ф
У y ,/ ,/ y
^ y ** J
y y *
* y
* 1,0 -
Классические моноциты (МО1) (абсолютное содержание)
1
ns ns ns ns
* y
Рис. 6. Относительное (А) и абсолютное (Б) содержание субпопуляции MO1 у пациентов с хроническим лимфолейкозом и у доноров
Здесь и на рис. 7-8: данные представлены в виде медианы и размаха 10 % и 90 % процентиля. * - р = 0,01-0,05; ** - р = 0,010,001; *** - р = 0,001-0,0001; **** - р <0,0001; ns - различия между сравниваемыми группами статистически недостоверно.
э
Промежуточные моноциты (МО2) (относительное содержание)
1
40 -|
30 -
/ У </ </ / * У У У
/ ^ * у
э
0,8
0,6
Промежуточные моноциты (МО2) (абсолютное содержание)
1
ns ns ns ns
/ У </ </ / * / ^
* у
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
150 -
ns
к
0
к
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
0
Рис. 7. Относительное (А) и абсолютное (Б) содержание субпопуляции MO2 у пациентов с хроническим лимфолейкозом и у доноров Иммунология ■ Том 45 ■ № 5 ■ 2024
Неклассические моноциты (МО3) (относительное содержание)
20
10
1
1 Г
ns ns ns
f *
ШИУЙ
Z5 ж J
л
V/V
xS
Неклассические моноциты (МО3) (абсолютное содержание)
0,2 -
ns ns ns ns
4
¥
W
V/v
Рис. 8. Относительное (А) и абсолютное (Б) содержание субпопуляции МО3 у пациентов с хроническим лимфолейкозом и у доноров
грессированием ХЛЛ и обратно коррелировало с экспрессией прогностических факторов 2АР-70 и СБ38. Более того, оно был ниже у пациентов с ХЛЛ, нуждающихся в лечении, что, по мнению автора, может указывать на благоприятное влияние МО3 на противоопухолевый ответ. В то же время в работе Б. БатаБсепо и соавт. (2016) [16] отмечалось, что определение субпопуляций моноцитов на основе экспрессии 8ЬАМ (6-БиНо ЬасМАс) значительно увеличивает содержание 8ЬА№-МО2.
В работе 2. М1кц1коуа и соавт. 2021 [17] было показано, что активация циркулирующих моноцитов и Т-клеток коррелирует с количеством опухолевых клеток при ХЛЛ и применяемой терапией. Наименьшая активация моноцитов наблюдается у пациентов с прогрессирующей формой заболевания, а самая высокая активация - при индолентном течении ХЛЛ, у пациентов без лечения и пациентов, получающих терапию новыми таргетными препаратами (ибрутиниб, иделали-сиб и венетоклакс).
Целью изучения субпопуляционного состава моноцитов крови стало получение данных о распределении МО1, МО2 и МО3 у пациентов с ХЛЛ. Проведенное исследование показало, что основная субпопуляция
моноцитов, циркулирующих в периферической крови при ХЛЛ, представлена МО1, относительное содержание которых снижалось при использовании терапевтических схем, не содержащих ибрутиниб. Одновременно в этой же группе пациентов отмечалось увеличение относительного содержания МО3. Во всех исследуемых группах пациентов с ХЛЛ наблюдались изменения субпопуляционного состава моноцитов за счет увеличения относительного числа МО2. Однако анализ абсолютного содержания исследуемых субпопуляций моноцитов не выявил достоверных различий.
Заключение
Точный механизм изменения субпопуляционного состава моноцитов при использовании различных схем терапии ХЛЛ недостаточно изучен и требует более детального исследования с расширением спектра диф-ференцировочных маркеров. Мониторинг изменений абсолютного и относительного содержания субпопуляций моноцитов целесообразен для изучения фенотипи-ческой и функциональной гетерогенности этих клеток в динамике лечения пациентов с ХЛЛ.
А А
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
40
30
0
■ Литература
1. Taylor P.R., Gordon S. Monocyte heterogeneity and innate immunity. Immunity. 2003; 19 (1): 2-4. DOI: https://doi.org/10.1016/s1074-7613 (03)00178-x
2. Lee H.W., Choi H.J., Ha S.J., Lee K.T., Kwon Y.G. Recruitment ofmono-cytes/macrophages in different tumor microenvironments. Biochim. Biophys. Acta. 2013; 1835 (2): 170-9. DOI: https://doi.org/10.1016/j.bbcan.2012.12.007
3. Ziegler-Heitbrock L., Ancuta P., Crowe S., Dalod M., Grau V., Hart D.N., Leenen P. J. M, Yong-Jun Liu, MacPherson G., Randolph G.J., Scherberich J., Schmitz J., Shortman K., Sozzani S., Strobl H., Zem-bala M., Austyn J.M., Lutz M.B. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 2010; 116 (16): 74-80. DOI: https://doi.org/10.1182/ blood-2010-02-258558
4. Земсков В.М., Ревишвили А.Ш., Козлова М.Н., Шишкина Н.С., Куликова А.Н., Балбуцкий А.В., Алексеев А.А., Земсков А.М., Демидова В.С., Попов В.А., Плотников Г.П., Гришина Т.И., Сучков С.В., Васильев О.С., Соловьева М.С. Анализ субпопуляций моноцитов при сердечно-сосудистой, ожоговой и иной патологии (классификация 2010 г.). Медицинский совет. 2023; 17 (4): 154-63. DOI: https://doi. org/10.21518/ms2023-002
5. Савченко А.А., Мартынова Г.П., Иккес Л.А., Борисов А.Г., Кудрявцев И.В., Беленюк В.Д. Изменение субпопуляционного состава и фагоцитарной активности моноцитов у детей с инфекционным моно-нуклеозом при воздействии GM-CSF in vitro. Инфекция и иммунитет. 2023; 13 (3): 446-56. DOI: http://dx.doi.org/10.15789/2220-7619-CII-4666
6. Ginhoux F., Mildner A., Gautier E. L., Schlitzer A., Jakubzick C., Varol C., Bain C., Guermonprez P.. Editorial: Monocyte Heterogeneity and Function. Frontiers in Immunology. 2021; 11 (1): 5-8. DOI: https://doi. org/10.3389/fimmu.2020.626725
7. Skrzeczynska-Moncznik J., Browska M., Loseke S., Grage-Griebe-now E., M.Zembala, Pryjma J. Peripheral blood CD14highCD16+ monocytes are main producers of IL-10. Scand. J. Immunol. 2008; 67 (2): 152-9. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1365-3083.2007.02051.x
8. Mukherjee R., Kanti Barman P., Kumar Thatoi P., Tripathy R., Kumar Das B., Ravindran B. Non-Classical monocytes display inflammatory features: Validation in sepsis and System Lupus Erythematous. Sci. Rep. 2015; 13886 (5). DOI: https://doi.org/10.1038/srep13886
9. Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Меледина И.В., Желтова О.И., Шевела Е.Я., Останин А. А., Черных Е.Р. Субпопуляции циркулирующих моноцитов как потенциальные биомаркеры тяжести заболевания у больных вирусным циррозом печени. Инфекция и иммунитет. 2022; 12 (3): 475-85. DOI: http://dx.doi.org/10.15789/2220-7619-CMS-1810
10. Калашникова А.А., Ворошилова Т.М., Чиненова Л.В., Давыдова Н.И., Калинина Н.М. Субпопуляции моноцитов у здоровых лиц и у пациентов с сепсисом. Медицинская иммунология. 2018; 20 (6): 815-24. DOI: https://doi.org/10.15789/1563-0625-2018-6-815-824
11. Чумакова С.П., Винс М.В., Уразова О.И., Азарова Д.А., Шипулин В.М., Пряхин А.С., Букреева Е.Б., Буланова А.А., Кошель А.П., Чурина Е.Г., Ситникова А.В., Гарганеева Н.П., Новицкий В. В. Субпопуляции моноцитов крови у больных с генерализованной гипоксией. Бюлл. Сиб. Мед. 2019; 189 (1): 277-85. DOI: https://doi. org/10.20538/1682-0363-2019-1-277-285
12. Кухарчик Г.А., Лебедева О.К., Гайковая Л.Б. Моноцитарный ответ при инфаркте миокарда у пациентов с сахарным диабетом 2 типа. Российский кардиологический журнал. 2023; 28 (2): 5183. DOI: https://doi.org/10.15829/1560-4071-2023-5183
13. Rogacev K.S., Cremers B., Zawada A.M., Seiler S., Binder N., Ege P., Grobe-Dunker G., Heisel I., Hornof F., Jeken J., Rebling N.M., Ulrich C., Scheller B., Böhm M., Fliser D., Heine G.H. CD14++CD16+ Monocytes independently predict cardiovascular events. Journal of the American College of Cardiology. 2012; 60 (16): 1512-20. DOI: https:// doi.org/10.1038/srep13886
14. Maffei R., Bulgarelli J., Fiorcari S., Bertoncelli L., Martinelli S., Guarnotta C., Castelli I., Deaglio S., Debbia G., De Biasi S. et al. The Monocytic Population in Chronic Lymphocytic Leukemia Shows Altered Composition and Deregulation of Genes Involved in Phagocytosis and Inflammation. Haematologica. 2013; 98: 1115-23. DOI: https://doi. org/10.3324/haematol.2012.073080
15. Kowalska W., Zarobkiewicz M., Tomczak W., Wo's J., Morawska I., Bojarska-Junak A. Reduced Percentage of CD14dimCD16+SLAN+ Monocytes Producing TNF and IL-12 as an Immunological Sign of CLL Progression. Int. J. Mol. Sci. 2022; 23: 3029. DOI: https://doi.org/10.3390/ ijms23063029
16. Damasceno D., Andrés M.P., van den Bossche W.B., Flores-Montero J., de Bruin S., Teodosio C., van Dongen J.J., Orfao A., Almeida J. Expression profile of novel cell surface molecules on different subsets of human peripheral blood antigen-presenting cells. Clin. Transl. Immunol. 2016; 5: 100. DOI: https://doi.org/10.1016/jjaci.2019.02.030
17. Mikulkova Z., Manukyan G., Turcsanyi P., Kudelka M., Urbanova R., Savara J., Ochodkova E., Brychtova Y., Molinsky J., Sim-kovic M., Starostka D., Novak J., Janca O., Dihel M., Ryznerova P., Mohammad L., Papajik T., Kriegova E. Deciphering the complex circulating immune cell microenvironment in chronic lymphocytic leukaemia using patient similarity networks. Scientific Reports. 2021; 11: 322. DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-020-79121-4
■ References
1. Taylor P.R., Gordon S. Monocyte heterogeneity and innate immunity. Immunity. 2003; 19 (1): 2-4. DOI: https://doi.org/10.1016/ s1074-7613(03)00178-x
2. Lee H.W., Choi H.J., Ha S.J., Lee K.T., Kwon Y.G. Recruitment of monocytes/macrophages in different tumor microenvironments. Biochim Biophys Acta. 2013; 1835 (2): 170-9. DOI: https://doi.org/10.1016/j.bbcan. 2012.12.007
3. Ziegler-Heitbrock L., Ancuta P., Crowe S., Dalod M., Grau V., Hart D.N., Leenen P. J. M, Yong-Jun Liu, MacPherson G., Randolph G.J., Scherberich J., Schmitz J., Shortman K., Sozzani S., Strobl H., Zem-bala M., Austyn J.M., Lutz M.B. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 2010; 116 (16): 74-80. DOI: https://doi.org/10.1182/ blood-2010-02-258558
4. Zemskov V.M., Revishvili A.S., Kozlova M.N., Shishkina N.S., Kulikova A.N., Balbutsky A.V., Alekseev A.A., Zemskov A.M., Demi-dova V.S., Popov V.A., Plotnikov G.P., Grishina T.I., Suchkov S.V., Vasiliev O.S., Solovyova M.S. Analysis of monocyte subpopulations with cardiovascular, burn and other pathologies (2010 classification). Medical Council. 2023; 17 (4): 154-63. DOI: https://doi.org/10.21518/ms2023-002 (in Russian)
5. Savchenko A.A., Martynova G.P., Ikkes L.A., Borisov A.G., Kudryavcev I.V., Belenjuk V.D. Changes in in vitro GM-CSF-exposured monocyte subset composition and phagoc ytic activity in children with infectious mononucleosis. Russian Journal of Infection and Immunity. 2023; 13 (3): 446-56. DOI: https://doi.org/10.15789/2220-7619-CII-4666 (in Russian)
6. Ginhoux F., Mildner A., Gautier E. L., Schlitzer A., Jakubzick C., Varol C., Bain C., Guermonprez P. Editorial: Monocyte Heterogeneity and Function. Frontiers in Immunology. 2021; 11 (1): 5-8. DOI: https://doi. org/10.3389/fimmu.2020.626725
7. Skrzeczynska-Moncznik J., Browska M., Loseke S., Grage-Griebenow E., Zembala M., Pryjma J. Peripheral blood CD14highCD16+ monocytes are main producers of IL-10. Scand J Immunol. 2008; 67 (2): 152-9. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1365-3083.2007.02051.x
8. Mukherjee R., Kanti Barman P., Kumar Thatoi P., Tripathy R., Kumar Das B., Ravindran B. Non-Classical monocytes display inflammatory features: Validation in sepsis and System Lupus Erythematous. Sci Rep. 2015; 13886 (5). DOI: https://doi.org/10.1038/srep13886
9. Leplina O.Yu., Tikhonova M.A., Meledina I.V., Zheltova O.I., Shevela E.Ya., Ostanin A.A., Chernykh E.R. Topical issues of clinical symptoms and diagnostics of septic shock. Russian Journal of Infection and Immunity. 2022; 12 (3): 475-85. DOI: https://doi.org/10.15789/2220-7619-CMS-1810 (in Russian)
10. Kalashnikova A.A., Voroshilova T.M., Chinenova L.V., Davydova N.I., Kalinina N.M. Monocyte subpopulations in healthy individuals and in patients with sepsis. Medical Immunology. 2018; 20 (6): 815-24. DOI: https://doi.org/10.15789/1563-0625-2018-6-815-824 (in Russian)
11. Chumakova S.P., Vince M.V., Urazova O.I., Azarova D.A., Shipu-lin V.M., Pryakhin A.S., Bukreeva E.B., Bulanova A.A., Koshel A.P., Chu-rina E.G., Sitnikova A.V., Garganeeva N.P., Novitskiy V.V. Subpopulations of blood monocytes in patients with generalized hypoxia. Bulletin of Siberian Medicine. 2019; 189 (1): 277-85. DOI: https://doi.org/10.20538/1682-0363-2019-1-277-285
12. Kukharchik G.A., Lebedeva O.K., Gaykova L.B. Mono-cyte response in myocardial infarction in patients with type 2 diabetes. Russian Journal of Cardiology. 2023; 28 (2): 5183. DOI: https://doi. org/10.15829/1560-4071-2023-5183 (in Russian)
13. Rogacev K.S., Cremers B., Zawada A.M., Seiler S., Binder N., Ege P., Grobe-Dunker G., Heisel I., Hornof F., Jeken J., Rebling N.M., Ulrich C., Scheller B., Böhm M., Fliser D., Heine G.H. CD14++CD16+
Monocytes independently predict cardiovascular events. Journal of the American College of Cardiology. 2012; 60 (16): 1512-20. DOI: https:// doi.org/10.1038/srep13886
14. Maffei R., Bulgarelli J., Fiorcari S., Bertoncelli L., Martinelli S., Guarnotta C., Castelli I., Deaglio S., Debbia G., De Biasi S., et al. The Monocytic Population in Chronic Lymphocytic Leukemia Shows Altered Composition and Deregulation of Genes Involved in Phagocytosis and Inflammation. Haematologica. 2013; 98: 1115-23. DOI: https://doi. org/10.3324/haematol.2012.073080
15. Kowalska W., Zarobkiewicz M., Tomczak W., Wo's J., Morawska I., Bojarska-Junak A. Reduced Percentage of CD14dimCD16+SLAN+ Monocytes Producing TNF and IL-12 as an Immunological Sign of CLL Progression. Int J Mol Sci. 2022; 23: 3029. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms23063029
■ Cведения об авторах
Почтарь Евгений Владимирович - канд. мед. наук, ассистент каф. клинической лабораторной диагностики с курсом лабораторной иммунологии ФГБОУ ДПО РМАНПО Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-3743-3040
Луговская Светлана Алексеевна - д-р мед. наук, проф., проф. каф. клинической лабораторной диагностики с курсом лабораторной иммунологии ФГБОУ ДПО РМАНПО Минздрава России, Москва, Российская Федерация
E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-6405-3422
Наумова Елена Владимировна - канд. мед. наук, доцент каф. клинической лабораторной диагностики с курсом лабораторной иммунологии ФГБОУ ДПО РМАНПО Минздрава России, Москва, Российская Федерация
E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-6048-5746
Почтарь Маргарита Евгеньевна - канд. мед. наук, доцент, доцент каф. клинической лабораторной диагностики с курсом лабораторной иммунологии ФГБОУ ДПО РМАНПО Минздрава России, Москва, Российская Федерация
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-4733-7925
Дмитриева Елена Александровна - врач-гематолог МГГЦ ММНКЦ им. С.П. Боткина ДЗМ, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-3866-4510
Костин Александр Игоревич - канд. мед. наук, зав. отд. клинической и производственной трансфузиоло-гии и гравитационной хирургии крови ГБУЗ НИИ СП им. Н.В. Склифосовского ДЗМ, Москва, Российская Федерация
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-7542-851X
16. Damasceno D., Andrés M.P., van den Bossche W.B., Flores-Montero J., de Bruin S., Teodosio C., van Dongen J.J., Orfao A., Almeida J. Expression profile of novel cell surface molecules on different subsets of human peripheral blood antigen-presenting cells. Clin Transl Immunol. 2016; 5: 100. DOI: https://doi.org/10.1016/jjaci.2019.02.030
17. Mikulkova Z., Manukyan G., Turcsanyi P., Kudelka M., Urbanova R., Savara J., Ochodkova E., Brychtova Y., Molinsky J., Simkovic M., Sta-rostka D., Novak J., Janca O., Dihel M., Ryznerova P., Mohammad L., Papajik T., Kriegova E. Deciphering the complex circulating immune cell microenvironment in chronic lymphocytic leukaemia using patient similarity networks. Scientific Reports. 2021; 11: 322. DOI: https://doi. org/10.1038/s41598-020-79121-4
■ Authors' information
Evgeny V. Pochtar - PhD, Assistant of the Clinical Laboratory Diagnostics Chair with a Course of Laboratory Immunology, RMACPE MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-3743-3040
Svetlana A. Lugovskaya - MD, PhD, Prof., Prof. of the Clinical Laboratory Diagnostics Chair with a Course of Laboratory Immunology, RMACPE MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-6405-3422
Elena V. Naumova - PhD, Associate Prof. of the Clinical Laboratory Diagnostics Chair with a Course of Laboratory Immunology, RMACPE MOH of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-6048-5746
Margarita E. Pochtar - PhD, Associate Prof. of the Clinical Laboratory Diagnostics Chair with a Course of Laboratory Immunology, RMACPE MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-4733-7925
Elena A. Dmitrieva - Hematologist of MCHC S.P. Botkin MMRCC DOH of the City of Moscow, Moscow, Russian Federation
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-3866-4510
Alexander I. Kostin - PhD, Head of the Dept. of Blood Collection, Clinical Transfusiology and Gravitational Blood Surgery, N.V. Sklifosovsky RIEC DOH of the City of Moscow, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-7542-851X
