CC BY
14
D3-07 b-.qxd 25.08.2007 15:05 Page 60
-e-
ниям, которые происходят в организме при употреблении молочных продуктов.
Полученные в результате проведенных исследований данные указывают, что отсутствие склонности к употреблению молочных продуктов старшеклассниками промышленного города приводит к ухудшению их самочувствия (пре-морбидным состояниям). Это проявляется, в основном, более частыми жалобами на головную боль, общее недомогание, грусть, раздражительность и неприятные ощущения в области сердца, по сравнению со сверстниками, предпочитающими употребление молочных продуктов.
Эти болезненные явления говорят об отрицательных функциональных изменениях, происходящих в нервной системе (головной боли, общем недомогании, грусти, раздражительности) и сердечно-сосудистой (неприятных ощущениях в области сердца). Указанные функциональные изменения при определенных условиях в дальнейшем могут привести к заболеваниям этих и других систем организма.
Для профилактики ухудшения самочувствия старшеклассников промышленного города следует рекомендовать им употребление ежедневно (по 13 раза в сутки) молочных продуктов. Как минимум, необходимо, в соответствии с рекомендациями В.Д. Ванханена и В.В. Ванханена, выпивать за час перед сном по стакану молочного продукта (молока, кефира, простокваши, ряженки).
ЛИТЕРАТУРА
1. Петровский К.С., Ванха-нен В.Д. Гигиена питания. — М., 1982. — 528 с.
2. Ванханен В. В., Ванха-нен В.Д. Учение о питании. — Донецк, 2000. — 352 с.
3. Капранов С.В., Капранова Г В., Тарасова И.О., Безруч-ко Д.Ю., Головина Т.Ю., Дога-дина Я.А., Наумова Ю.Ю., Несвит М.А., Ковалева О.С., Стрельцова И.В. Анализ жалоб у старшеклассников промышленного города на ухудшение самочувствия // Матерiали IV Мiжнародноí науково-практич-ноТ конференци "Динамика на-укових дослщжень, 2005". 2030 червня 2005 року. — Дшпро-петровськ: Медицина, 2005. — Т. 30. — С. 51-52.
THE EVALUATION OF THE STABILITY OF THE BIOLOGICAL MEMBRANES ON THE EFFECTS OF CROWN-AETHER
Kratenko R.I.
ОЦЕНКА СТАБИЛЬНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН ПРИ ДЕЙСТВИИ КРАУН-ЭФИРОВ
КРАТЕНКО Р.И.
Харьковский государственный медицинский университет
УДК 577.1: 615.9: 614.7: 661.185
ОЦ1НКА СТАБ1ЛЬНОСТ1 Б1ОЛОГ1ЧНИХ МЕМБРАН П1Д Д16Ю КРАУН-ЕФ1Р1В Кратенко Р.1.
Вивчено вплив краун-еф1р1в (12-краун-4, 15-краун-5, 18-краун-6) та псевдо-краун-еф1р1в (т'ю-12-краун-4, тю-15-краун-5, аза-12-краун-4) на фосфол1пщний склад еритроцит1в / гепатоцит1в, проникнють мембран для К+ та ¡нтенсивн1сть б1охемшюм1несценци тканин / б1олопчних рщин. Виявлено пдвищення вм'юту л1зофосфо-л1пщ1в у мембранах гепатоци-тв та еритроцит1в, пщвищення проникност1 еритроцитарних мембран для ¡ошв К+, зрос-тання ¡нтенсивност бохемлю-м1несценцИ тканин та б1олопч-них рщин у тварин. Показано залежн'ють м1ж досл1дженими показниками, що дае змогу розглядати б1охемшюм1нес-ценц1ю як швидкий та ефек-тивний метод оц1нки сталост б1олопчних мембран.
ногие химические соединения, преимущественно синтезированные в последние годы, мало изучены в отношении их медико-биологических свойств. Это в полной мере относится и к новой группе веществ органического синтеза — классическим краун-эфирам марок 12-краун-4, 18-краун-6, 15-краун-5, а также псевдо-краун-соединениям, таким как тио-12-краун-4, тио-15-краун-5, аза-12-кра-ун-4, содержащим вместо кислорода атомы серы или азота в циклических кольцах своих молекул. Данная группа веществ нашла широкое применение в экстракции, разделении ионов металлов, межфазном катализе, электрохимии, катализе окислительно-восстановительных реакций, электронике, моделировании биохимических процессов [1]. Большие объемы производства и широкое применение макроциклических эфиров в различных отраслях народного хозяйства предполагают значительное воздействие их на здоровье населения [2]. Это определяет актуальность исследований тонких биохимических механизмов влияния этих ксенобиотиков на организм теплокровных животных и человека.
В силу особенностей химического строения, физико-химических свойств и биотрансформации в организме макро-циклические эфиры могут оказывать как прямые, так и опосредованные мембра-нотропные эффекты [2, 3]. Опосредованное влияние изучаемых ксенобиотиков на биологические мембраны реализуется через активацию сво-боднорадикальных процессов (СРО) и перекисного окисления липидов (ПОЛ) [3, 4]. Об этом свидетельствуют полу-
Е&Н*60
Б3-07 Ь-.qxd 25.08.2007 15:05 Раде 61
-е-
ченные нами данные о накоплении диеновых конъюгатов и малонового диальдегида в печени и сыворотке крови, снижении восстановленного глу-татиона, изменении активности ферментов антиокси-дантной защиты у крыс, подвергнутых воздействию кра-ун-эфиров [3, 4].
Целью работы было исследование влияния краун- и псев-до-краун-эфиров на стабильность биологических мембран эритроцитов и гепатоцитов.
Объект и методы исследования. Работа выполнена на белых крысах популяции Вис-тар, массой 200-220 г. Животным перорально с помощью металлического зонда вводили водные растворы исследуемых соединений. В подостром эксперименте испытана доза 1/100 ДЛ50, что соответственно составляло для 12-краун-4 — 11,17 мг/кг массы животного; 15-краун-5 — 13,5 мг/кг; 18-краун-6 — 12,7 мг/кг; тио-12краун-4 — 36,5 мг/кг; тио-15-краун-5 — 48,0 мг/кг; аза-12-краун-4 — 22,0 мг/кг. Длительность внутрижелудочной
=З ДОСВ1ДУ САН1ТАРНОТ ТА Л1КУВАЛЬНОТ ПРАКТИКИ™
трифугировании. Для исследования мембран гепатоцитов печень животных гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе Поттера. Мембраны выделяли по общепринятым методам, используя рекомендации Финдлея и Эванса [5].
Экстракцию липидов проводили по методу Кейтса [6]. Для разделения индивидуальных фосфолипидов на фракции использовали двухмерную тонкослойную хроматографию [7]. Количественное содержание общих и индивидуальных фосфолипидов в липидных экстрактах оценивали по количеству неорганического фос-
Таблица 1
Влияние краун- и псевдо-краун-эфиров (1/100 ДЛ50) на фосфолипидный состав мембран гепатоцитов
Вещество Фракция фосфолипидов, %
ФХ СМ ЛФЭА ЛФХ ФИ КЛ
Контроль 38±2 16±1 1,5±0,4 1,6±0,5 7,6±0,1 0,60±0,1
12-краун-4 47±1 * 11±1* 4,2±0,7* 5,0±0,7* 3,8±0,3* 0,81±0,03*
15-краун-5 45±1* 11±1* 6,5±1,2* 4,6±0,8* 4,5±0,4* 0,78±0,02*
18-краун-6 46±1* 11±1* 5,5±1,1* 5,1±0,7* 4,3±0,6* 0,79±0,03*
Тио-12-краун-4 39±3 10±1* 4,3±0,6* 4,0±0,4* 3,7±0,4* 0,5±0,1
Тио-15-краун-5 42±4 11±1* 4,6±0,5* 4,9±0,3* 3,3±0,6* 0,80±0,25
Аза-12-краун-4 40±3 11±1* 6,2±0,7* 5,2±0,6* 4,4±0,7* 0,6±0,2
Примечание к таблицам 1-5:
* — различия с контролем статистически достоверны.
затравки составляла 30 суток. В каждой группе насчитывалось по 15 животных.
Было исследовано влияние данных веществ на фосфоли-пидный состав мембран эритроцитов и гепатоцитов, проницаемость мембран эритроцитов для К+, а также изучена биохемилюминесценция (БХЛ) тканей и биологических жидкостей.
Для анализа фосфолипид-ного состава использовались эритроциты крыс, отмытые от плазмы раствором хлористого натрия при 3-4-кратном цен-
61*Е&Н
фора, который определяли с помощью молибденового реактива с последующим коло-риметрированием. Соотношение фосфолипидных фракций рассчитывали в процентах фосфора фосфолипидов каждой фракции к сумме фосфора всех липидов, принятых за 100%.
Для выявления нарушения проницаемости эритроцитар-ных мембран использовали метод измерения скорости выхода ионов К+ с помощью стеклянного селективного электрода 2407 К+ в бескалиевую среду. Измерение проницаемости эритроцитарных мембран для ионов К+ производилось по двум показателям: скорости самопроизвольного выхода ионов К+ в бескалиевую среду и скорости индуцированного специфическим ионофором (валино-мицином) выхода ионов К+.
Интенсивность биохемилю-минесценции, индуцированной 0,5% раствором перекиси водорода, измеряли на хеми-люминометре ХЛМ-Ц1-01, как описано Журавлевым [8]. Оценка результатов осуществлялась по интенсивности и кинетике протекания реакции свечения после добавления индуцента.
Таблица 2
Влияние краун- и псевдо-краун-эфиров (1/100 ДЛ50) на фосфолипидный состав мембран эритроцитов
Вещество Фракция фосфолипидов, %
ФЭ ФХ СМ ФС ЛФХ
Контроль 22±2 44±1 12±1 12±1 3,5±0,6
12-краун-4 22±2 49±1* 18±1* 8±1* 7,4±0,5*
15-краун-5 23±1 48±1* 15±1* 9±1* 7,6±0,4*
18-краун-6 22±2 47±1* 17±1* 9±1* 6,5±0,3*
Тио-12-краун-4 21±1 47±2 18±1* 9±2 6,8±0,6*
Тио-15-краун-5 22±2 48±2 17±2* 10±2 7,3±0,7*
Аза-12-краун-4 24±2 48±4 17±2* 11±2 6,2±0,6*
D3-07 b-.qxd 25.08.2007 15:05 Page 62
-e-
Статистическая обработка результатов проведена по Стьюденту-Фишеру [9].
Результаты исследования. Цифровые данные, приведенные в таблицах 1 и 2, свидетельствуют о более существенном влиянии класси-
ношение СМ и ФС в мембранах гепатоцитов и эритроцитов существенно отличалось. Так, в отличие от мембран гепатоцитов, в эритроцитах все три представителя краун-эфиров снижали процентное содержание ФС, а процентное содержание СМ под влиянием этих веществ в эритроцитах достоверно повышалось. Эти отличия, возможно, связаны с ролью печени как в обмене липидов вообще, так и в обмене фосфолипидов в частности [10]. Биосинтез фосфолипидов в печени необходим не только для обеспечения обновления и приспособления структурных фос-фолипидов в мембранных элементах гепатоцитов, но и
Таблица 3
Влияние краун-эфиров (1/100 ДЛ50) на проницаемость мембран эритроцитов для К+ (мкмоль К+/мин. *106эритр.)
Вещество Свободный выход К+ Выход, индуцированный валиномицином
Контроль 0,100±0,008 6,15±0,26
12-краун-4 1,53±0,04* 10,47±0,35*
15-краун-5 1,44±0,03* 11,15±0,37*
18-краун-6 1,260±0,025* 9,72±0,43*
ческих краун-эфиров на фос-фолипидный состав эритроцитов и гепатоцитов, по сравнению с тио- и аза-соедине-ниями. Так, в гепатоцитах (табл. 1) 12-краун-4, 15-кра-ун-5 и 18-краун-6 повышали процентное содержание фос-фатидилхолина (ФХ) и карди-олипина (КЛ), снижая при этом процентное содержание фосфатидилинозитола (ФИ) и сфингомиелина (СМ). Процентное соотношение фос-фатидилэтаноламина (ФЭА) и фосфатидилсерина (ФС) оставалось без изменений.
Тио- и аза-краун-эфиры изменяли процентное содержание только СМ и ЛФХ. Направленность этих изменений была такой же, как и при воздействии классических краун-эфиров.
Статистически достоверно возрастало содержание лизоформ фосфатидилхолинов (ЛФХ) и фосфатидилэтанола-минов (ЛФЭА) под действием обеих групп исследуемых соединений.
Влияние исследуемых соединений на процентное соот-
для образования фосфолипидов, которые транспортируются липопротеинами крови к другим тканям [11].
Так как КЛ являются основными липидными компонентами мембран митохондрий [10, 11], изменение их концентрации, а вследствие этого и ли-пидного окружения ферментов митохондриальных мембран может быть одной из причин нарушения процессов биоэнергетики, о чем свидетельствуют полученные нами результаты снижения активности сукцинатдегидрогеназы и АТФ-азы в печени [3].
Следует отметить, что повышение содержания лизоформ в фосфолипидных фракциях
гепатоцитов и эритроцитов под влиянием двух групп исследуемых веществ было практически одинаковым.
Обнаруженные изменения в фосфолипидном составе эритроцитов и гепатоцитов (в частности, накопление ЛФХ и ЛФЭА) свидетельствуют о снижении стабильности биологических мембран под влиянием данных ксенобиотиков. Прямым подтверждением нарушения проницаемости мембран под воздействием мак-роциклических эфиров служат результаты экспериментов по изучению их влияния на скорость выхода ионов К+ из эритроцитов.
Все исследованные краун-эфиры существенно (в 12-15 раз) повышали свободный и на 40-86% — индуцированный валиномицином выход К+ из эритроцитов (табл. 3). Антибиотик валиномицин является ионофором, специфически связывающим ионы К+, тем самым способствуя его транспорту через биологические мембраны. Способность валиномицина транспортировать ионы К+ через мембраны связана с его ли-пофильной природой. Изменения в фосфолипидном составе мембран эритроцитов, очевидно, облегчают роль ва-линомицина в качестве переносчика ионов К+. Действие представителей псевдо-кра-ун-эфиров на выход К+ из эритроцитов было менее выраженным.
Повышение процентного содержания лизоформ фос-фолипидов, нарушение проницаемости мембран, очевидно, является следствием активации ПОЛ [3, 8, 12]. Это подтверждается и результатами по БХЛ тканей и биологических жидкостей. БХЛ биосубстратов и биологических жидкостей характеризует, в первую очередь, интенсив-
Таблица 4
Интенсивность БХЛ (имп/с) органов и сыворотки крови белых крыс при воздействии краун-эфиров (1/100 ДЛ50)
Вещество Сыворотка крови Печень Головной мозг Надпочечники
Контроль 280±20 820±30 370±23 400±20
12-краун-4 638±12* 1860±44* 680±18* 128±25*
15-краун-5 582±23* 1223±55* 620±51* 805±11*
18-краун-6 560±21* 1120±26* 530±26* 1060±19*
Е&Н*62
D3-07 b-.qxd 25.08.2007 15:05 Page 63
THE EVALUATION OF THE STABILITY OF THE BIOLOGICAL MEMBRANES ON THE EFFECTS OF CROWN-AETHER Kratenko R.I.
The influence of crown-ethers (12-crown-4, 15-crown-5, 18-crown-6) and pseudo-crown-ethers (thio-12-crown-4, thio-15-crown-5, aza-12-crown-4) derivatives on hepatocyte and erythrocyte phospholipid composition, membrane permeability to K+ and intensity of biochemiluminescence of tissues and
biological liquids was studied. The increase in lysophospholipid concentration in hepatocyte and erythrocyte membranes, enhancing erythrocyte membrane permeability to K+, increasing intensity of biochemiluminescence of tissues and biological liquids were found. Correlation between investigated parameters may be the base to consider biochemiluminescence as a rapid and effective method of membrane stability indication.
-e-
ность свободнорадикального окисления тканевых липидов и служит основным тестом в комплексной диагностике свободнорадикальной патологии [8].
Как видно из таблиц 4 и 5, оба класса исследуемых веществ оказывали одинаковое влияние на интенсивность БХЛ (повышали ее приблизительно в 2 раза). Результаты БХЛ хорошо коррелировали с интенсивностью ПОЛ, изменениями в структуре мембран и их проницаемостью.
Нами было обнаружено, что у крыс, затравленных краун-эфирами, повышалось образование активных форм кислорода — инициаторов сво-боднорадикальных процессов [2-4]. При этом выявлено накопление продуктов ПОЛ (малонового диальдегида и диеновых конъюгатов) в печени и сыворотке крови.
БХЛ используется как интегральный показатель интенсивности протекания свободно-радикальных процессов и ПОЛ [8]. Хемилюминограммы несут также информацию о суммарной мощности системы анти-оксидантной защиты.
Сопоставление полученных нами данных по состоянию компонентов антиоксидан-тной системы (ферментативных и неферментативных) о накоплении первичных и вто-
ричных метаболитов ПОЛ по изменению проницаемости мембран и их фосфолипидно-го состава с результатами по спонтанной и индуцированной БХЛ дает основание рассматривать хемилюминесценцию как быстрый и эффективный метод оценки стабильности биологических мембран. При этом важным является сочетание разных индуцентов (в первую очередь, Fe2*, люминола, перекиси водорода), а также полная расшифровка хемилю-минограмм.
Выводы
□ Краун- и псевдокраун-эфиры существенно изменяли фосфолипидный состав мембран эритроцитов и гепатоци-тов белых крыс, увеличивая процентное содержание лизоформ.
□ Действие исследованных веществ также приводило к увеличению проницаемости мембран и интенсивности би-охемилюминесценции тканей и сыворотки крови крыс.
ЛИТЕРАТУРА
1. Максютина Н.П., Ветютне-ва П.А., Назаренко А.Ю., Мит-ченко Ф.А. Перспективы применения краун-эфиров для экстракционно-фотометри-ческого определения щелочных металлов в лекарственных препаратах // Фармацевтический журнал. — 1991. — № 3. — С. 67-74.
Таблица 5
Интенсивность БХЛ (имп/с) сыворотки крови и мочи белых крыс при воздействии псевдо-краун-эфиров (1/100 ДЛ50)
Вещество Сыворотка крови Моча
15 суток 30 суток 15 суток 30 суток
Контроль 976±28 1020±40 750±20 830±18
Аза-12-краун-4 1809±58* 2150±79* 1379±57* 1656±59*
Тио-12-краун-4 1730±54* 1890±31* 1206±35* 1380±50*
Тио-15-краун-5 1700±62* 1720±46* 1166±30* 1420±33*
2. Кратенко Р.И. Биологическая активность краун-эфиров в связи с проблемой охраны водных объектов. — Харьков: ХГМУ, 2001. — 207 с.
3. Кратенко Р.И. Состояние антиоксидантной системы, окислительно-восстановительных процессов и перекис-ного окисления липидов у крыс при действии ксенобиотиков // Експериментальна i кл^чна медицина. — 2002, № 4. — С. 12-16.
4. Жуков В.1., М^ряев А.Б., Кратенко Р.1. Дiя юшзувально-го випромшення та 12-краун-4 на активнють антиоксидантноУ системи й штенсивнють пере-кисного окислення лт^в // УкраУнський радюлопчний журнал. — 2001. — № 1. — С. 37-40.
5. Биологические мембраны / Под ред. Дж. Финдлея и У. Эван-са. — М.: Мир, 1990. — 400 с.
6. Кейтс М. Техника липидо-логии. — М.: Мир, 1975. — 322 с.
7. Vaskovsky V.E., Terekki-ve T.A. URTTC of phospholipids mixtures containing phosphatidyl glycerols // J. High Res. Chromatogr. — 1979. — V. 2, № 11. — P. 671-672.
8. Журавлев А.И. Спонтанная биохемилюминесценция животных тканей / В кн: Биохе-милюминесценция. — М., 1983. — С. 3-29.
9. Лакин Г.Ф. Биометрия. — М.: Высшая школа, 1990. — 154 с.
10. Мак-Мюррей У. Обмен веществ у человека. — М.: Мир, 1980. — 366 с.
11. Murray R.K., Granner D.K., Mayers P.M. Harper's biochemistry. — USA: Appleton & Lange. — 1993. — 567 р.
12. Барабой В.А., Карна-ух И.М., Орел В.Н. Перекис-ное окисление и радиация. — К.: Наукова думка, 1991. — 256 с.
63bH
-е-
