CC BY
34
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Бывалов А.А., Паутов В.И., Чичерин Ю.В. и др. // ЖМЭИ. - 1984. - № 4 . - С. 74-76. - 2. Гинсбург Н.Н. Живые вакцины. - М.: Медицина, 1969. - С. 336. - 3. Г орбань
A.Н., Россиев Д.А. Нейронные сети на персональном компьютере. - Новосибирск: Наука, 1996. - С. 276. - 4. Дальва-дянц С.М., Белобородов Р.А., Сероглазов В.В. и др. // Матер. науч.-практ. конф., посв. 100-летию образования противочумной службы России. - Саратов, 1997. - Том 1. -С. 200-201. - 5. Дальвадянц С.М., Дятлов И.А., Еремин С.А., Кутырев В.В. // Пробл. особо опасных инф. -Саратов, 2003. - Вып. 86. - С. І23-132. - 6. Дальвадянц С.М., Дятлов И.А., Еремин С.А., Кутырев В.В. // Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 2006. - Вып. 1 (91). -С. 57-61. -7. Дальвадянц С.М., Королев В.В., Сероглазов В.В. и др. // Матер. науч-практ. конф., посв. 100-летию образования противочумной службы России. - Саратов,
1997. - Том 1. - С. 201. - 8. Дальвадянц С.М., Пономарев
Н.Г., Белобородов Р. А. и др. // Сост. и перспект. профи-лакт. чумы. - Саратов, 1978. - С. 158-159. - 9. Евстигнеев
B.И., Кутырев В.В., Дальвадянц С.М. и др. // Диагн., леч. и профилакт. опасных инф. забол. Биотехнология. Ветеринария: Матер. юбил. науч. конф., посв. 70-летию НИИ микро-биол. МО РФ. - Киров, 1998. - С. 86-87. - 10. Карпухин Т.И., Шапиро Н.И, Андриевская Р. А. // Инф. и парази-тарн. бол. - М.: Медицина, 1979. - С. 191. - 11. Коробкова Е.И. // Пробл. особо опасных инф. - 1968. - Вып. 3. - С. 147156. - 12. Коробкова Е.И. Живая противочумная вакцина. -М.: Медгиз, 1956. - 256 с. - 13. Коробкова Е.И. Профилактика инфекций живыми вакцинами. - М.: Медгиз, 1960. -
C. 303-323. - 14. Котлярова Р.И. Значение дозы и кратности вакцинации и ревакцинации в иммуногенезе при чуме: Авто-реф. дис. ... канд. мед. наук. - Саратов, 1965. - 22 с. -
15. Лебединский В.А., Чичерин Ю.В., Паутов В.Н. и др. // ЖМЭИ. - 1982. - № 5. - С. 60-63. - 16. Майер К.Ф. // Инф. бюл. - М., 1968. - № 119. - С. 5-10. - 17. Питенко А.А.
Методы информатики / Под. ред. А.Н.Горбаня. - Красноярск,
1998. - С. 205. - 18. Самойлова Л.В. Динамика развития иммунитета к чуме после прививки живой чумной вакциной и особенности иммуногенеза при этой вакцинации: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Саратов, 1963. - 19. Уоссерман Ф. Нейрокомпьютерная техника: Теория и практика / Пер. с англ. -М.: Мир, 1992. - С. 240. - 20. Фролов И.Т. Очерки методологии биологического исследования. - М.: Мысль, 1965. -
С. 185. - 21. Kutyrev V.V., Dalvadjans S.M., Djatlov S.A. Perspectives of vaccine prophylaxis of plague 8th International Symposium on Yersinia. September 4-8. - Finland, 2002. -P. 108. - 22. Meyer K.F., Cavanaugh D.C., Bartelloni P.J. etal. // J. Infect. Dis. - 1974. - Vol. 129. - P. 13-18.
V.A.Safronov, A.A.Lopatin, S.M.Dalvadyants
Artificial Neuron Networks Used to Predict the Efficacy of Specific Plague Prevention Preparations
Russian Anti-Plague Research Institute "Microbe ", Saratov
Presented in the work is a brief analysis of the problem of modeling experiments in immunology. The efficacy of applying specific plague prevention drugs was predicted using the neural network on the model of Guinea pigs with varying post-vaccination status. Based on these experimental data, an informational model of immunologic reactions was developed and verified for the cases of revaccination, taking into account indirect analytical and integral immunity characteristics. The model of neural network makes it possible to predict the efficacy of the immunization expressed as a percentage of surviving animals within the group of those revaccinated and subsequently challenged with plague.
Key words: plague, live plague vaccine, chemical plague vaccine, immunization, vaccination, modeling, prognosis, neural network.
Поступила 25.05.06.
УДК 616.981.51:616-097
Т.Н.Щуковская, В.В.Фирстова, А.Л.Кравцов, С.Н.Клюева, Ю.А.Попов, Н.И.Микшис
ОЦЕНКА ПРИОБРЕТЕННОГО ИММУНИТЕТА ПРОТИВ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ ПО СТЕПЕНИ ПОВРЕЖДЕНИЯ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ IN VITRO АНТРАКСИНОМ
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Исследовано влияние антраксина в плане повреждающего действия на лейкоциты крови мышей линии BALB/c при наличии и отсутствии поствакцинального противосибиреязвенного иммунитета. Методом проточной цитофлуориметрии обнаружено, что происходит повреждение только сенсибилизированных лейкоцитов на уровне внутриклеточных дегенеративных изменений, типичных для теста альтерации нейтрофилов и сопутствующих, как известно, механизму гибели лейкоцитов по типу апоптоза. Предложено использовать проточно -цитофлуориметрический метод учета реакции лейкоцитов in vitro на антраксин для оценки напряженности по-ствакцинального противосибиреязвенного иммунитета.
Ключевые слова: B. anthracis СТИ-1, антраксин, лейкоциты, проточная цитофлуориметрия, апоптоз.
Оценка клеточного звена приобретенного иммунитета после вакцинации против сибирской язвы осуществляется с использованием кожной пробы с антраксином (in vivo). Альтернативные кожной пробе тесты in vitro не разработаны. Противотуляре-мийный иммунитет также оценивают по кожной аллергической реакции с тулярином. На основании экспериментальных данных установлено, что у людей при поствакцинальном или постинфекционном противотуляремийном иммунитете интенсивность повреждения (гибели и лизиса) нейтрофильных
лейкоцитов цельной крови тулярином in vitro (реакции лейкоцитолиза) в присутствии специфических антител коррелирует с результатами постановки кожных проб [7, 14]. Возможность использования реакции лейкоцитолиза взамен кожной пробы с тулярином [7] позволяет исключить дополнительную антигенную нагрузку на организм человека.
Реакция повреждения сенсибилизированных лейкоцитов антраксином в условиях in vitro не изучалась. Характер повреждения лейкоцитов может быть интенсивным на уровне всей клетки вплоть до
полного ее лизиса как в случае с тулярином [8], так и на уровне внутриклеточных дегенеративных изменений (дегрануляция, пикноз и фрагментация ядер), типичных для теста альтерации нейтрофилов [9] и сопутствующих, как известно, механизму гибели лейкоцитов по типу апоптоза [6]. В последнем случае количественный учет реакции повреждения клеточных элементов часто представляет проблему для визуальной микроскопии и требует использования специальных цитохимических методов [4]. В.А. Фрадкин еще в 1975 г. отмечал более высокую информативность теста повреждения лейкоцитов при использовании флуоресцирующих красителей (акридинового оранжевого) и люминесцентной микроскопии, особенно в сочетании с количественной оценкой интенсивности флуоресценции клеточных ядер и цитоплазмы [9]. В дальнейшем это получило подтверждение в многочисленных исследованиях, и для быстрого определения относительного содержания погибших клеток в гетерогенных лейкоцитарных популяциях в настоящее время широко применяются про-точно-цитофлуориметрические методы анализа, регистрирующие в отдельных лейкоцитах деградацию молекулы ДНК как ключевой индикатор клеточной гибели [3, 4, 5]. Ранее нами была установлена высокая эффективность использования метода проточной цитометрии при учете результатов реакции лейкоци-толиза с тулярином [13].
Цель данной работы - изучить характер повреждения лейкоцитов крови in vitro антраксином для оценки напряженности иммунитета после иммунизации коммерческой вакциной B . anthracis СТИ-1 с использованием микроскопического (морфологического) и проточно-цитофлуориметрического методов анализа.
Материалы и методы
Биомодель. В работе использовали адекватную модель для изучения вакцинального и инфекционного процессов при сибирской язве [17] - мышей линии BALB/c в количестве 30 особей, полученных из питомника «Столбовая». Животных делили на две группы. Опытную группу мышей иммунизировали однократно подкожно протективной дозой (10 спор) коммерческой вакцины B. anthracis СТИ-1 согласно п. 12.7.8. регламента производства вакцины сибиреязвенной живой № 831-98 (от 25 декабря 1998 г.). В качестве контрольной группы использовали интакт-ных животных. На 21 -е сутки иммуногенеза полноценность сформированного у животных приобретенного иммунитета подтверждали в опытах по заражению (9 вакцинированных и 9 интактных мышей) вирулентным штаммом - В. anthracis 2-я вакцина Цен-ковского (значение индекса иммунитета составило 125,9.). Венозную кровь лабораторных животных для постановки реакции с антраксином получали на 21 -е сутки после вакцинации.
Реакция in vitro с антраксином. Постановку и учет реакции проводили по методу, разработанному для оценки приобретенного противотуляремийного иммунитета (тест лейкоцитолиза с тулярином) [7]. От каждой особи кровь с гепарином (150 мкл) раскапывали в две лунки, в одну из которых (опыт) до-
бавляли 50 мкл антраксина (серия № 1-03, Ставрополь), а в другую - 50 мкл физиологического раствора (контроль). Через 2 ч инкубирования учет результатов реакции проводили микроскопическим и цитометрическим методами.
Микроскопический учет результатов реакции с антраксином. По окончании срока инкубации кровь в лунках тщательно перемешивали и переносили микропипеточным дозатором по 20 мкл в лунки планшета, содержащие 0,4 мл 3 % уксусной кислоты, подкрашенной до светло-голубого цвета метиленовой синькой. В каждой из лунок подсчитывали количество лейкоцитов крови в камере Горяева с использованием микроскопа Olympus CX31. Коэффициент лейкоцитолиза вычисляли по формуле:
К% = Мк~М° X100,
Мк
где Мо - количество лейкоцитов в опыте (первая лунка); Мк - количество лейкоцитов в контроле (вторая лунка).
Для оценки результатов использовали следующую шкалу показателей:
К = 15 % - отрицательный или сомнительный результат;
К = 16-20 % - слабо положительный результат;
К = 21-30 % - положительный результат;
К = 31 % и выше - резко положительный результат.
Цитометрический учет результатов реакции с антраксином. Для проведения цитометрических исследований из цельной крови, находящейся в каждой из лунок, выделяли лейкоцитарную взвесь. Кровь в количестве 0,1 мл на 15 с добавляли к 2 мл деионизованной воды для лизиса эритроцитов. Лизис лейкоцитов предотвращали восстановлением осмотического баланса - добавлением 1 мл 1,5 М NaCl в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,2. Лейкоциты осаждали и дважды отмывали от сыворотки центрифугированием (10 мин при 400g). Клеточный осадок фиксировали путем добавления в каждую из пробирок 1 мл 70° спирта [15]. Для определения в лейкоцитах внутриклеточного содержания ДНК и РНК клетки осаждали из спирта центрифугированием и осадок ресуспендировали в 2 мл 10-5 М фосфатно-солевого буфера, рН 6,0, содержащего 10-4 ЭДТА. Добавляли 2 мл 10-5 г/мл акридинового оранжевого (АО) в фосфатно-солевом буфере и через 1-2 мин проводили цитофлуориметрический анализ на импульсном проточном цитофлуориметре ICP-22 PHYWE (Германия) [12].
Гистограммы, выводимые на экране дисплея, регистрировали с помощью цифровой камеры «Olympus» с последующей компьютерной обработкой данных (программа Corel Photo-Paint).
Результаты и обсуждение
При планировании экспериментальных исследований мы предполагали, что через 2 ч контакта лейкоцитов крови вакцинированных животных с ан-траксином будет происходить лейкоцитолиз, как и в реакции лейкоцитолиза с тулярином. Однако результаты реакции, полученные микроскопическим мето-
Сравнительная оценка изменения количества лейкоцитов в крови иммунизированных B. anthracis СТИ-1 вакциной и интактных мышей линии BALB/c в ответ на стимуляцию антраксином in vitro
Исследуемый материал Количество лейкоцитов в 1 мл крови ( хЮ6) Коэффициент
до инкубации после инкубации К (%)
Кровь вакцинированных особей без антраксина 1,4 і 0,2 1,35 і 0,18 3,6
Кровь вакцинированных особей + антраксин 1,4 і 0,15 1,2 і 0,09 8,6
Кровь не вакцинированных особей без антраксина 1,3 і 0,11 1,1 і 0,09 3,8
Кровь не вакцинированных особей + антраксин 1,15 і 0,1 1,10 і 0,08 4,3
дом, не выявили в этот срок изменений относительно исходной концентрации лейкоцитов ни у вакцинированных, ни у интактных особей (таблица).
Основываясь на том, что лизис лейкоцитов свидетельствует уже о посмертных изменениях в погибших клетках, а сам факт их повреждения (ги-
Рис. 1. ДНК-гистограммы, отражающие разную степень повреждения лейкоцитов крови вакцинированных (Б) и не вакцинированных B. anthracis СТИ-1 (А) мышей линии BALB/c в ответ на стимуляцию антраксином in vitro
Каждая из гистограмм отражает распределение лейкоцитов по относительному содержанию ДНК на клетку (по клеточному циклу) в условных единицах (каналах от 0 до 512) интенсивности зелепой флуоресценции (ось абсцисс). По оси ординат - число клеток па единицу измерения (капал). На гистограмме, характерной для лейкоцитов крови интактных животных (контроль), видно фактическое отсутствие повреждающего эффекта антигена - подавляющее число клеток регистрируется в диплоидном пике с одинаковым (ровпо 2С) содержанием ДНК. В крови мышей, иммунизированных вакциной B. anthracis СТИ-1, аптраксип индуцировал появление до 30 % поврежденных лейкоцитов, несущих менее 2С ДНК на клетку (в апоптозе), которые учитывались цитометром слева от диплоидного пика на ДНК гистограмме
бели) лучше отражает процесс деградации ядерного хроматина [4], мы провели сравнительную оценку относительного содержания ДНК в лейкоцитах крови иммунизированных и интактных мышей в ответ на стимуляцию антраксином in vitro. Одновременное измерение в цитоплазме лейкоцитов содержания РНК использовали в качестве доказательства того, что повреждение лейкоцитов крови антраксином происходит по типу апоптоза, а не по типу разрушения их ципоплазматической мембраны (лизиса или некроза).
Типичная ДНК-гистограмма лейкоцитов крови интактных мышей отображена на рис. 1, A. Основной пик представлен диплоидными клетками (83,41 і 3,82). Величина гиподиплоидных лейкоцитов колеблется в пределах (9,16 і 2,51) % от общей популяции. Как показали исследования, инкубация лейкоцитов с физиологическим раствором в течение 2 ч достоверно не изменяла (P> 0,05) процентного соотношения гиподиплоидных (14,04 і 4,35 %), диплоидных (78 і 7,91 %) и пролиферирующих (7,96 і 4,14 %) клеток. Взаимодействие лейкоцитов ин-тактных животных с антраксином (2 ч, 37 °С) также не влияло на процессы пролиферации (13,01 і 3,42 %) и повреждение клеточных элементов (16,22 і 1,77 %). То есть, характер распределений лейкоцитов крови интактных мышей по клеточному циклу (ДНК-гистограмм) фактически не изменялся под действием антраксина in vitro. После контакта с
■ МП #•** Ml*
А
т
Б
Рис. 2. РНК-гистограммы, отражающие разную степень активации РНК лейкоцитов крови вакцинированных (Б) и не вакцинированных B. anthracis СТИ-1 (А) мышей линии BALB/c в ответ на стимуляцию антраксином in vitro
Гистограммы отражают распределение лейкоцитов по интенсивности красной флуоресценции цитоплазмы (по относительному содержанию РНК па клетку) в условных единицах от 0 до 512 (каналах). По оси ордипат - число клеток па капал. РНК-гистограмма (А) отражает низкий уровень содержания РНК в лейкоцитах крови интактных животных спустя 2 ч их контакта с аптигепом, а также однородность лейкоцитарной популяции по данному показателю (один пик флуоресценции).
На РНК гистограмме (Б) видно, что в популяции лейкоцитов вакцинированных животных появляются активированные клетки, несущие повышенное содержание РНК па клетку
«
і
антраксином относительное содержание поврежденных лейкоцитов, несущих ДНК на стадии деградации (менее 2С ДНК на клетку), достоверно повышалось до (29,01 ± 2,69) %, P < 0,01, только в крови вакцинированных животных, что наглядно демонстрирует ДНК гистограмма на рис. 1, Б.
Полученные экспериментальные данные о повышении повреждающего эффекта антраксина на лейкоциты крови вакцинированных животных согласуются с результатами других исследователей [1, 10]. Активированные лейкоциты (нейтрофилы) после реализации своей физиологической функции подвергаются, как известно, гибели по типу апопто-за [4]. Различная интенсивность повреждения лейкоцитов антигеном свидетельствовала о различной степени функциональной активации лейкоцитов крови у интактных животных и животных с приобретенным противосибиреязвенным иммунитетом.
О функциональной активации лейкоцитов крови свидетельствует, как известно, активация синтеза в них РНК. Результаты цитофлуориметрии относительного содержания РНК (интенсивности красной флуоресценции цитоплазмы) [12, 16] в лейкоцитах крови позволили выявить выраженные различия по данному показателю, так как антраксин индуцировал синтез РНК только в клетках вакцинированных животных (рис. 2). Кроме того, наличие окраски клеточной цитоплазмы по РНК красителем акридиновым оранжевым - это важное свидетельство целостности лейкоцитарной цитоплазматической мембраны [16], указывающее на то, что в наших исследованиях антраксин индуцировал гибель (деградацию ДНК) лейкоцитов крови животных не по типу некроза, а по типу апоптоза.
Таким образом, выявлены различия в реакции лейкоцитов, полученных от вакцинированных B. anthracis СТИ-1 и интактных белых мышей линии BALB/c, на антраксин in vitro. В сенсибилизированных лейкоцитах под влиянием антраксина происходило повреждение по типу апоптоза, отмечалась активация синтеза внутриклеточной РНК. Повышенная реактивность лейкоцитов крови вакцинированных животных на антраксин in vitro, вероятно, может быть использована для оценки напряженности приобретенного сибиреязвенного иммунитета. С точки зрения индивидуального подхода к оценке результатов вакцинации и ревакцинации людей, взамен небезопасной кожной пробы, может быть перспективен тест повреждения лейкоцитов in vitro с использованием метода импульсной проточной цитофлуориметрии.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ада Г., Рамсей А. Вакцины, вакцинация и иммунный ответ. - М.: Медицина, 2002. - 344 с. - 2. Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В.. Иммунологические проблемы апоп-тоза. - М.: Эдиториал УРСС, 2002. - 320 с. - 3. Козинец Г.И., Погорелов В.М., Шмаров Д.А. и др. Клетки крови - современные технологии их анализа. - М.: Триада-фарм, 2002. - 200 с. - 4. Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю. Гибель клетки (апоптоз). - М.: Медицина, 2001. - 192 с. - 5. Ма-янский А.Н., Маянский Н.А., Заславская М.И. // Иммунология. - 1999. - № 6. - С. 11-20. - 6. Понякина И. Д., Лебедев К.А. // Мед. иммунол. - 2002. - Т. 4, № 2. - С. 159164. - 7. Приказ № 125 «Об усилении мероприятий по профилактике туляремии». Министерство Здравоохранения РФ. -2002. - 8. Савельева Р.А., Ананова Е.В., Пронин А.В. и др. // ЖМЭИ. - 1995. - № 6. - С. 51-52. - 9. Фрадкин В. А. Аллергодиагностика in vitro. - М.: Медицина. - 1975. - 142 с. -10. Ф р а дки н В . А . Диагностика аллергии реакциями нейтро-филов крови. - М.: Медицина. - 1985 - 176 с. - 11. Andreeff M., Darzynkiewicz Z., Sharpless T.K. et al. // Blood. -1980. - Vol. 55, N 2. - P. 282-289. - 12. Braunstain J.D., Melamed M.R., Darzynkiewicz Z. et al. // Clin. immunol. im-munopathol. - 1975.- N 4. - P. 209-215. - 13. Firstova V.V., Kravtsov A.L., Schmelkova T.P., Shchuko vskaya T.N. // Proc. SPIE. - 2005. - Vol. 5771. - P. 311-316. -
14. Kambara T., Yasaka T., Nakamura T. // Virchows Arch. Abt. A. Path. Anat. - 1981. - Bd. 37, N 2. - P. 191-198. -
15. Kravtsov A.L., Grebenyukova T.P., Bobyleva E.V. et al. // Proc. SPIE. - 2000. - Vol. 4241. - P. 260-267. -
16. Traganos F., Darzynkievicz Z., Sharpless T., Melamed N.R. // J. Histochem. Cytochem. - 1977. - Vol. 25, N 1.-P. 46-56. - 17. Welkos S.L., Friedlander A.M. // Microb. Pathogen. - 1988. - N 5. - P. 127-139.
T.N.Shcukovskaya, V.V.Firstova, A.L.Kravtsov, S.N.Kluyeva, Yu.A.Popov, N.I.Mikshis
Estimation of the Acquired Immunity Against Anthrax According to the Extent of Blood Leucocytes Damage in vitro Caused by Anthraxin
Russian Anti-Plague Research Institute "Microbe ", Saratov
Damaging effects of anthraxin upon the blood leucocytes was studied in BALB/c mice with or without the postvaccinal anti-anthrax immunity. The flow cytofluorimetric analysis revealed only sensitized leucocytes to be injured at the level of intracellular degenerative changes, typical of the neutrophile alteration tests and known to be concomitant to the mechanism of apoptosis-type death of the leucocytes. The flow cytofluorimetric technique is offered as a useful method of registering leucocytic responses to anthraxin in vitro with the aim of assessing the strength of post-vaccination antianthrax immunity.
Key words: B. anthracis, CTI-1, anthraxin, leucocytes, flow cytofluo-rimetry, apoptosis.
nocTynn^a 14.12.05.
