CC BY
31УДК 619:616.98:578.824.11
ОЦЕНКА ПРИГОДНОСТИ ВЫДЕЛЕННЫХ АНТИРАБИЧЕСКИХ ГЛОБУЛИНОВ ДЛЯ МЕТОДОВ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ: ИФА И МФА
'М.А.Ефимова - доктор биологических наук, зав.лабораторией; 1А.Г.Мухамеджанова - аспирант;
'А.Н.Чернов - доктор биологических наук, зам. директора; 12К.С.Хаертынов - кандидат биологических наук, вед.н.с.; 'Р.М.Ахмадеев - кандидат ветеринарных наук, вед.н.с.; 'Ш.М.Насыров - кандидат ветеринарных наук, вед.н.с.; 'И.И.Самерханов - н.с.; 'З.З.Алеева - мл.н.с.;
'Г.С.Арутюнян - мл.н.с.; 'Г.М.Яруллина - мл.н.с.
'ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г.Казань (420075, Казань, Научный городок-2); e-mail: [email protected]). 2Казанская государственная медицинская академия - филиал ФГБОУ ДПО РМАНПО Минздрава России,
г.Казань (420012, Казань, ул. Бутлерова, 36).
Для выделения и очистки антирабических иммуноглобулинов использовали сыворотку овец, иммунизированных высокоочищенным антигеном вируса бешенства из штамма «Овечий» ГНКИ. Выделение глобулинов производилось методом трёхкратного переосаждения насыщенным раствором сульфата аммония с последующим диализом в трисовой буферной системе, в результате чего были получены очищенные фракции, для предварительной оценки активности которых использовали электрофорез в 7, 5% разделяющем полиакриламидном геле. Данная характеристика исследуемых фракций была подтверждена методом непрямого иммуноферментного анализа (нИФА) с гомологичными и гетерологичным антигенами вируса бешенства. В дальнейшем, полученные иммуноглобулины были подвергнуты маркировке флуоресцеин-5-изотиоцианатом (ФИТЦ) с последующей гель-фильтрацией на хроматографическим колонках с использованием геля сефадекс G-25. Активность и специфичность флуоресцирующих иммуноглобулинов оценивалась методом флуоресцирующих антител (МФА) в мазках-отпечатках головного мозга мышей, заражённых вирусом бешенства и вирусом болезни Ауески, в мазках-отпечатках головного мозга интактных мышей, а также по показателям концентрации меченого белка и молярного соотношения ФИТЦ/белок. Нами были выявлены наиболее активные фракции иммуноглобулинов и определены их оптимальные рабочие разведения, что в перспективе сделает возможным их использование в качестве специфических компонентов экспресс-тест-систем для диагностики бешенства на основе ИФА и МФА.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: вирус бешенства, антирабический иммуноглобулин, электрофорез, иммуно-ферментный анализ, иммунофлуоресценция.
На протяжении последнего десятилетия эпизоотическая обстановка по бешенству на территории большинства регионов Российской Федерации остаётся крайне напряжённой [5]. Являясь летальной острой антропозоонозной инфекцией, бешенство, по оценке ВОЗ, занимает 5 место среди инфекционных болезней по наносимому экономическому ущербу, значительная часть которого складывается из затрат на активную специфическую профилактику среди диких и сельскохозяйственных животных [6], а также на проведение диагностических исследований, являющихся основой разработки комплекса противоэпизо-отических мероприятий.
Общепринятые методы постмортальной диагностики бешенства основаны, как правило, на обнаружении цитоплазматических включений или специфического антигена (световая и люминесцентная микроскопия, реакция диффузионной преципитации, иммуноферментный анализ (ИФА) и др.) либо на индикации рабического вируса (биопроба на лабораторных животных или в культуре клеток), а также на обнару-
жении генома возбудителя бешенства [8]. В связи с этим для повышения эффективности противоэпизоот-ических мероприятий необходимо не только активное проведение плановых мониторинговых исследований [2], но и совершенствование методик экспресс-диагностики бешенства, в частности, тест-систем на основе методов флуоресцирующих антител (МФА) и ИФА с применением высокоочищенных специфических компонентов - рабических антигенов и иммуноглобулинов. Обозначенные методы обладают рядом преимуществ перед другими серологическими тестами: низким порогом чувствительности, стабильностью реактогенных соединений, возможностью автоматизации анализа и простотой интерпретации полученных результатов. Более того, сочетанное применение данных методов наряду с биопробой позволит значительно расширить возможности лабораторной диагностики бешенства [1].
Неотъемлемыми этапами конструирования экспресс-тест-систем для диагностики бешенства являются получение и наработка высокоспецифичных
антирабических иммуноглобулинов, используемых как в качестве сенсибилизирующего материала, так и для приготовления пероксидазного антирабического конъюгата. Основной характеристикой, предъявляемой к иммуноглобулинам, является высокая специфичность, что в ходе проведения реакции обеспечит оптимальную связываемость с иммобилизованными антигенами. Повышение данного свойства иммуноглобулинов может быть достигнуто предлагаемой методикой их выделения и очистки, а также поэтапным контролем их активности и специфичности в ходе технологического процесса.
Целью настоящего исследования явились получение антирабических иммуноглобулинов и оценка их активности и специфичности методами иммунофер-ментного анализа и флуоресцирующих антител.
Материалы и методы. Для получения высокоспецифичных антирабических иммуноглобулинов использовали сыворотку крови овец, иммунизированных инактивированным высокоочищенным антигеном вируса бешенства шт. «Овечий» ГНКИ с инфекционным титром lg10-4,25 из коллекции ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», предварительно подвергнутого пассажированию. Клинически здоровые овцы были гипериммунизированы путём последовательного четырёхкратного введения инактивированного антигена вируса бешенства с интервалом в 14 суток в смеси с неполным адъювантом Фрейнда (Incomplete Freund's adjuvant, Thermo Fisher Scientific) внутримышечно в суммарном объёме 16 см3. Забор крови производился стандартным методом из ярёмной вены через месяц после заключительной иммунизации при достижении титров сыворотки 1:800-1:1600 в ИФА. Контролем служила сыворотка крови интактной овцы.
Выделение иммуноглобулинов из пула гипериммунной сыворотки осуществлялось методом трёхкратного высаливания насыщенным раствором 2,78 М сульфата аммония с последующим диализом против 0,025 М трис-HCl буфера, рН 7,8, и хроматографиче-ской очисткой с ДЭАЭ целлюлозой со скоростью элю-ции 0,7 мл/мин [3].
Последующее разделение первичных иммуноглобулинов на фракции производилось методом гель-фильтрации на хроматографе NGC Discovery (Bio-Rad) с последующим измерением концентрации белка на спектрофотометре UV5 (Mettler Toledo) при длине волны 280 нм. В качестве ключевого метода для оценки серологической активности полученных фракций использовали электрофорез в 7,5% разделяющем полиакриламидном геле (ПААГ) с последующим окрашиванием коллоидным раствором Кумасси G-250 (ООО «ДИА-М»). Дальнейшее определение специфичности препаратов производили методом сэндвич-ИфА в концентрациях по белку, равных 100, 200, 300 и 400 мкг/мл. В качестве контролей для постановки ИФА нами были использованы контрольные положительный и отрицательный антигены вируса бешенства, полученные из мозговой ткани инфицированных и
интактных мышей соответственно (производство ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ), а также гетерологичный антиген, полученный из мозговой ткани мышей, инфицированных вирусом болезни Ауески (производственный штамм «Арский» с инфекционным титром lg10-3). Гомологичные и гетерологичные антигены использовали в разведении 1:800, антирабический пероксидазный конъюгат (ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ») - 1:3200; постановка реакции воспроизводилась в пяти повторностях. Для предварительной оценки электрофоретической активности иммуноглобулинов применяли метод Laemmli [7].
Мечение иммуноглобулинов флуоресцеин-5-изотиоцианатом (ФИТЦ, Merck) производилось методом конъюгации из расчёта 0,05 мг красителя на 1 мг белка в течение 18 часов при +40C в темноте. Последующее удаление несвязавшегося красителя достигалось гель-фильтрациейна колонках с использованием геля сефадекс G-25. Полученные фракции были проанализированы на спектрофотометре UV5 (Mettler Toledo) при длинах волн 280 нм и 495 нм, соответствующих областям максимального поглощения для белка и ФИТЦ соответственно [4]. Концентрацию меченого белка (К6) и молярное соотношение ФИТЦ/ белок (Кф/б) на основе данных спектрального анализа рассчитывали по формулам [4]:
Кб = (ОП280 - 0,32 х ОП495) : 1,4
(1)
Кф/б= 2,87 -°П495/ (ОП280 - 0,32 х ОП495) (2) где:
ОП280 -значение оптической плотности при длине волны 228800 нм;
ОП495 - значение оптической плотности при длине волны 449955 нм;
0,32, 1,4, 2,87 - расчётные коэффициенты.
Чувствительность и специфичность полученных меченых иммуноглобулинов оценивались посредством МФА при люминесцентной микроскопии. Постановка реакции осуществлялась на мазках-отпечатках ткани из четырёх отделов головного мозга (продолговатого мозга, мозжечка, гиппокампа и коры больших полушарий) мышей, инфицированных вирусом бешенства из производственного штамма «Овечий» ГНКИ, в качестве положительного контроля, и интактных мышей и мышей, инфицированных вирусом болезни Ау-ески из штамма «Арский» - в качестве отрицательного контроля на предметных стёклах, предварительно высушенных и зафиксированных в ацетоне. На отпечатки наносили исследуемые препараты в разведениях 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64 по общепринятой методике в пяти повторностях и просматривали в полях зрения люминесцентного микроскопа Nikon E-200 на предмет наличия флуоресцирующих внутриклеточных включений вируса бешенства. Об активности препарата судили по степени интенсивности специфической флуоресценции в виде округлых включений желтовато-зелёно-
НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ ЖУРНАЛ
№ 4/2018
го цвета в нейронах и их отростках.
Результаты исследований. В результате использования ранее изложенной методики хромато-графической очистки глобулинов [3], выделенных сульфатом аммония из гипериммунной антираби-ческой сыворотки овец на колонке с диэтиламиноэ-тил-целлюлозой (ДЭАЭ) были получены две основные фракции !дв1 и !дв2, концентрация белка в которых составила 3,582 мг/мл и 6,627 мг/мл, соответственно. Подобное разделение фракций было обусловлено из-
менением градиента молярности в системе и связей с носителем. Проведённый анализ белкового спектра данных фракций в ПААГ подтверждает содержание в них высококонцентрированных иммуноглобулинов с минимальными примесями вторичных белков.
Следующий этап исследования заключался в установлении степени активности полученных фракций иммуноглобулинов методом непрямого ИФА с гомологичными и гетерологичными антигенами (табл. 1).
Таблица 1
Иммунологическая специфичность полученных фракций антирабических иммуноглобулинов в нИФА
Фракции 1дЭ Концентрация белка, мкг/мл ОП при длине волны 490 нм в наибольшем разведении
АГ вируса бешенства Контрольный отрицательный антиген АГвируса болезни Ауески
!д01 (Сб = 3,582 мг/мл) 100 0,592±0,01112 0,062+0,003 0,091+0,002
200 0,684±0,01212 0,068+0,002 0,093+0,001
300 0,821±0,00412 0,071+0,002 0,096+0,003
400 0,911±0,00512 0,074+0,003 0,108+0,001
!д02 (Сб = 6,627 мг/мл) 100 0,647±0,00612 0,061+0,002 0,089+0,004
200 0,705±0,00612 0,067+0,004 0,094+0,006
300 0,846±0,00312 0,071+0,001 0,112+0,002
400 0,914+0,00512 0,079+0,002 0,118+0,005
Примечание: 1 - достоверно по сравнению с гомологичным антигеном (р<0,0001);
2 - достоверно по сравнению с гетерологичным антигеном (р<0,0001).
Согласно результатам нИФА, наибольшей активностью характеризуется фракция !д02 с концентрацией белка 6,627 мг/мл. Предположительно высокая активность фракции обусловлена содержанием в ней пептидов, соответствующих антигенным детерминантам вируса бешенства, что визуально подтверждено электрофореограммой.
Далее из фракции !дС1 было отобрано несколько проб для конъюгации с ФИТЦ. По завершению хроматографической очистки с использованием геля сефадекс в-25 выход препарата был зафиксирован в виде пика, восходящая и нисходящая части которого сформировали фракции №1 и №2 с концентрациями белка 7,607 мг/мл и 9,956 мг/мл
соответственно. Результаты спектрального анализа полученных проб при длинах волн 280 нм и 495 нм представлены в таблице 2.
Исходя из представленных данных, при незначительных различиях показателей плотности мечения наибольшей концентрацией меченого белка характеризуется фракция 1, что объясняет её высокую активность в РИФ (табл. 3).
При визуальном учёте результатов реакции в мазках-отпечатках с положительным антигеном вируса бешенства наблюдалось яркое (3-4 креста) характерное желтовато-зелёное свечение в виде округлых гранул. За оптимальное рабочее разведение фракции 1 было принято 1:8-1:16, фракции 2 - 1:4-1:8.
Таблица 2
Данные спектрального анализа фракций иммуноглобулинов, меченых ФИТЦ
Показатель Фракция 1 (Сб = 7,607 мг/мл) Фракция 2 (Сб= 9,956 мг/мл)
ОП при длине волны 280 нм 0,73221 0,09556
ОП при длине волны 495 нм 1,36818 0,18486
Концентрация меченого белка 0,21 0,03
Соотношение ФИТЦ/белок 13,34 17,2
Плотность мечения 14,4 15,8
Таблица 3
Активность в РИФ фракций иммуноглобулинов, меченых ФИТЦ
Фракции флуоресцирующих иммуноглобулинов Рабочее разведение Интенсивность свечения
АГ вируса бешенства Контрольный отрицательный антиген АГ вируса болезни Ауески
Проба №1 (Сб= 7,607 мг/мл) 1:4 ++++ + +
1:8 ++++ + +
1:16 +++ -
1:32 +++ - -
Проба №2 (Сб= 9,956 мг/мл) 1:4 +++ + +
1:8 +++ + -
1:16 ++ - -
1:32 ++ - -
При визуальном учёте результатов реакции в мазках-отпечатках с положительным антигеном вируса бешенства наблюдалось яркое (3-4 креста) характерное желтовато-зелёное свечение в виде округлых гранул. За оптимальное рабочее разведение фракции 1 было принято 1:8-1:16, фракции 2 - 1:4-1:8.
В мазках-отпечатках с контрольным отрицательным антигеном и антигеном вируса болезни Ауески была отмечена определённая фоновая активность. Предположительно, подобная побочная активность может быть связана как с высокой чувствительностью самого метода, как и с относительно высокой концентрацией меченого белка в исследуемых фракциях.
Заключение. Нами была изучена активность и специфичность наиболее активных фракций ан-
тирабических иммуноглобулинов, выделенных из гипериммунной сыворотки овец методом трёхкратного высаливания насыщенным раствором сульфата аммония. Отбор фракций в процессе их выделения осуществлялся согласно выявлению первичной активности в электрофореограммах, которая в дальнейшем была подтверждена методами нИФА и РИФ. В результате постановки данных реакций были выявлены наиболее активные разведения исследуемых препаратов. Наличие фона в отрицательных мазках при визуальном учёте РИФ в дальнейшем может быть устранено путём оптимизации методик по выделению и очистке специфических антирабических иммуноглобулинов, что сделает возможным их использование в качестве специфических компонентов соответствующих экспресс-тест-систем.
Литература
1. Гулюкин, А.М. Значимость современных методов лабораторной диагностики и индикации возбудителя бешенства для иммунологического мониторинга данного зооноза / А.М.Гулюкин // Вопросы вирусологии. - 2014.
- № 3. - С. 5-10.
2. Мониторинг бешенства у диких животных в Брянской области / А.Л.Елаков [и др.] // Ветеринария. - 2015.
- №1. - С. 11-14.
3. Выделение, очистка и оценка серологической активности антигенов вируса бешенства / М.А.Ефимова [и др.] // Проблемы особо опасных инфекций. - 2017. - №4. - C. 27-30.
4. Разработка и применение иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих для выявления возбудителей кампилобактериоза, лептоспироза / И.В. Жарникова [и др.] // Медицинский вестник Северного Кавказа.
- 2006. - №1. - С. 12-14.
5. Мовсесянц, А.А. Бешенство: особенности современной эпизоотической и эпидемиологической ситуации в России / А.А.Мовсесянц // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2011. - №5(60). - С.4-5.
6. Черкасский, Б.Л. Эпидемиологический надзор за бешенством в Российской Федерации / Б.Л.Черкасский, О.С.Хадарцев, А.А.Мовсесянц // Бюллетень «Вакцинация. Новости вакцинопрофилактики». - 2005. - №1(37). -С. 7-8.
7. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K.Laemmli // Nature. - 1970. - № 227 (5259). - Р. 680-5.
8. Meslin, F.X. Laboratory techniques in rabies / F.X.Meslin, M.M.Kaplan, H.Koprowski // Laboratory techniques in rabies. - 4-th ed. - Geneva: WHO, 1996. - P. 9-27.
6
НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ ЖУРНАЛ
№ 4/2018
EVALUATION OF SUITABILITY OF THE ISOLATED ANTIRABIC GLOBULINS FOR METHODS OF LABORATORY DIAGNOSIS: ELISA AND MFA
1Efimova M.A. - Doctor of Biological Sciences; 1Mukhamedzhanova A.G. - postgraduate;
1ChernovA.N. - Doctor of Biological Sciences; 12Khaertynov K.S. - Candidate of Biological Sciences;
1Akhmadeev R.M. - Candidate of Veterinary Sciences; 1Nasyrov Sh.M. - Candidate of Veterinary Sciences;
1Samerkhanov I.I. - Researcher Officer; 1Aleeva Z.Z. - Researcher Assistant;
1Arutyunyan G.S. - Researcher Assistant; 1Yarullina G.M. - Researcher Assistant.
1Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, Kazan (e-mail: [email protected]).
2Kazan State Medical Academy - Branch Campus of Russian Medical Academy
of Continuous Professional Education, Kazan.
To isolate and purify antirabic immunoglobulins we used serum of sheep immunized with a highly purified rabies virus antigen from the strain "Ovechiy" of the GNKI. The globulin isolating was carried out by the method of triple reprecipitation with a saturated solution of ammonium sulfate, with subsequent dialysis in the buffer system, which resulted in the preparation of purified fractions. For the preliminary evaluation of these fractions activity we used electrophoresis in a 7.5% separating polyacrylamide gel. This characteristic of the investigated fractions was confirmed by the method of indirect immunoenzyme (ELISA) with homologous and heterologous antigens of the rabies virus. Subsequently, the obtained immunoglobulins were labelled with fluorescein-5-isothiocyanate (FITC) followed by gel filtration using gel Sefadex G-250. The activity and specificity of fluorescent immunoglobulins were assessed by the method of fluorescent antibodies (MFA) in brain prints of mice infected with rabies virus and Aujeszky's disease virus, in brain prints of intact mice as well as according to indicators of concentration of labelled protein and the molar ratio of FITC / protein. We identified the most active immunoglobulin fractions and determined their optimal working dilutions, that in prospects will make it possible their using as specific components of express test systems to diagnosing rabies based on ELISA and MFA.
KEYWORDS: rabies virus, antirabic immunoglobulin, electrophoresis, immunoenzyme analysis, immunofluorescence.
References
1. Gulyukin, A.M. Znachimost sovremennyh metodov laboratornoy diagnostiki I indikatsii vozbuditelya beshenstva dlya immunologicheskogo monitoringa dannogo zoonoza [The importance of modern methods of laboratory diagnosis and indications of rabies for the immunological monitoring of this zoonosis] / A.M.Gulyukin // Voprosy virusologii. - 2014.
- № 3. - P. 5-10.
2. Monitoring beshenstva u dikih zhivotnyh v Bryanskoy oblasti [Monitoring of rabies in wild animals in the Bryansk region] / A.L.Elakov [et al.] // Veterinariya. - 2015. - №1. - P. 11-14.
3. Vydelenie, ochistka I otsenka serologicheskoy aktivnosti antigenov virusa beshenstva [Isolation, purification and evaluation of serological activity of rabies virus antigens] / M.A.Efimova [et al.] // Problemy osobo opasnyh infekciy. -2017. - № 4. - P. 27-30.
4. Razrabotka I primenenie immunoglobulinov diagnosticheskih fluoresciruyushchih dlya vyyavleniya vozbuditeley kampilobakterioza, leptospiroza [Development and using immunoglobulins diagnostic fluorescent for detection of causative agents of campylobacteriosis, leptospirosis] / I.V.Zharnikova [et al.] // Meditsinskiy vestnik Severnogo Kavkaza.
- 2006. - №1. - P. 12-14.
5. Movsesyants, A.A. Beshenstvo: osobennosti sovremennoy epizooticheskoy I epidemiologicheskoy situatsii v Rossii [Rabies: features of the modern epizootic and epidemiological situation in Russia] / A.A.Movsesyants // Epidemiologiya I vaktsinoprofilaktika. - 2011. - №5(60). - P.4-5.
6. Cherkasskiy, B.L. Epidemiologicheskiy nadzor za beshenstvom v Rossiyskoy Federatsii [Epidemiological surveillance of rabies in the Russian Federation] / B.L.Cherkasskiy, O.S.Hadartsev, A.A.Movsesyants // Bulleten «Vakcinatsiya. Novosti vaktsinoprofilaktiki». - 2005. - №1 (37). - P. 7-8.
7. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature. - 1970. - № 227(5259). - P. 680-5.
8. Meslin, F.X. Laboratory techniques in rabies / F.X.Meslin, M.M.Kaplan, H.Koprowski // Laboratory techniques in rabies. 4-th ed. - Geneva: WHO, 1996. - P. 9-27.
