CC BY
198
УДК 612.6.052.4: 615.217.22: [615.076.8+ 616-092.8]
ОЦЕНКА МУТАГЕННОЙ И АНТИМУТАГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ЛИГАНДОВ АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ НА ВОЗДУШНО-СУХИХ СЕМЕНАХ CREPIS CAPILLARIS
Миляуша Якубовна Ибрагимова1-2*, Валерий Васильевич Семенов2,
Ренад Ибрагимович Жданов1,3, Лилия Якубовна Сабирова4, Илдария Хайрулловна Валеева2
‘Казанский (Приволжский) федеральный университет, 2Казанский государственный медицинский университет, 3НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН, г. Москва,
4ГУП «Таттехмедфарм», г. Казань
Реферат
Приведены результаты экспериментов по оценке антимутагенного действия стимуляторов и блокаторов ад-ренорецепторов на мутагенез, индуцированный этилметансульфонатом и циклофосфамидом у воздушно-сухих семян скерды (Crepis capillaris). Оценены генетические эффекты следующих стимуляторов и блокаторов адреноре-цепторов: эпинефрина гидротартрата, норэпинефрина гидротартрата, фенилэфрина, орципреналина, пророксана и пропранолола.
Ключевые слова: мутагенез, антимутагенез, лиганды адренорецепторов.
EVALUATION OF MUTAGENIC AND ANTIMUTAGENIC ACTIVITY OF ADRENERGIC RECEPTOR LIGANDS ON THE AIR-DRY SEEDS OF CREPIS CAPILLARIS
M. Ya. Ibragimova1-2 *, V. V. Semenov2, R. I. Zhdanov1-3, L. Ya. Sabirova4, I. Kh. Valeeva2
1 Kazan (Volga region) Federal University, 2 Kazan State Medical University,3 Research Institute of General Pathology and Pathophysiology of the RAMS, Moscow,4 Tattehmedfarm, Kazan
Summary
Presented were the results of experiments, which assessed the antimutagenic activity of adrenergic agonists and blockers on mutagenesis induced by ethyl-methanesulphonate and cyclophosphamide in an air-dry seeds of Crepis capillaris. Evaluated were the genetic effects of the following agonists and blockers of adrenergic receptors: epinephrine hydrotartrate, norepinephrine hydrotartrate, phenylephrine, orciprenaline, and propranolol.
Key words: mutagenesis, antimutagenesis, adrenoceptor ligands.
Лиганд-рецепторные взаимодействия в клетке приводят к развитию специфического ответа и сопровождаются модуляцией целого ряда биохимических процессов, которые изменяют, в свою очередь, режим работы многих внутриклеточных систем жизнеобеспечения [15, 17, 24]. С учетом сопряженности мембранной рецепции с регуляторными системами клетки, а также исходя из предположения о том, что циклазные системы (в частности цАМФ-зависимая система) способны активизировать внутриклеточные системы защиты генома [7], можно думать, что лиганды, взаимодействующие с адренорецептора-ми, влияют на чувствительность клеток к мутагенам. Особый интерес вызвал у нас вопрос о способности адреномиметиков и адреноблокаторов проявлять генопротек-
* Автор для переписки: [email protected]
торные свойства. Это особенно актуально в настоящее время, когда ухудшение экологической ситуации в мире приводит к тревожному возрастанию удельного веса наследственных болезней, врожденных пороков развития, опухолевых заболеваний, тесно связанных с повреждением генома человека [3, 9, 11, 14, 21, 23]. Поиск антимутагенов, т.е. веществ, защищающих генетический аппарат соматических и половых клеток человека от повреждения, является необходимым [1, 5, 6,12, 16, 18, 19]. В настоящее время открыто несколько сотен антимутагенов, однако широкого применения они не нашли до сих пор [13, 20, 25, 26]. Во многом это связано с тем, что механизм генопротекторного действия большинства антимутагенов неизвестен; не оценена степень их безвредности для человека; отсутствуют традиционные фармакотоксикологичес-кие исследования антимутагенов на чело-
107
Таблица 1
Максимальный антимутагенный эффект (МАЭ) и диапазоны активных концентраций (ДАК) препаратов
в опыт ах на Crepis сарШага
Вещества Концен- трация вещества, М Параметры и индукторы мутаций
ЭМС ЦФ ДАК (в М)
частота аберраций (в %) МАЭ (в%) Р частота аберраций (в %) МАЭ (в%) Р ЭМС ЦФ
СТ Эпи- нефрина гидротар- трат 3,04010- 5,410-3 1,43±0,41 64,3 <0,001 3,50±0,65 60,8 <0,001 10-10-10-4 10-10-10-4
Норэпи- нефрина гидротар- трат 2,961с-8 -2,9610-3 2,64±0,49 43,5 <0,05 4,89±0,60 47,4 <0,001 10-7 10-8, 10-7
Фенилэф- рин 4,9110-9- 4,9110-3 не активен 5,44±0,78 39 <0,01 не активен 10-5, 10-4
Орципре- налин 3,80-10-8 -3,80 10-3 1,83±0,36 59,3 <0,001 5,07±0,60 45,5 <0,001 10-8-10-3 10-7, 10-4, 10-3
БК Пророк- сан 2,6810-8 -2,0110-2 1,03±0,34 76,8 <0,001 4,89±0,60 47,4 <0,001 10-3, 10-2 10-8-10-5
Пропрано- лол 3,8610-8 -3,86 10-3 0,94±0,42 77,5 <0,001 3,58±0,59 61,5 <0,001 10-7-10-3 10-8-10-6 10-4, 10-3
Примечание. СТ — стимуляторы, БК — блокаторы, ЭМС — этилметансульфонат, ЦФ — циклофосфамид.
веке. Понятно, что в таких условиях поиск эффективных супрессоров мутагенеза наиболее рационально проводить среди лекарственных препаратов с изученным механизмом действия и разрешенных к применению Фармакологическим комитетом [4].
В качестве индуктора мутаций использовали супермутаген — этилметансульфонат (ЭМС, “Sigma”) и алкилирующий цитостатический препарат циклофосфамид — ЦФ (АО “Биохимик”, г. Саранск) в концентрациях 1,61 «10 '5 М и 0,125 мг/мл соответственно [10, 25]. Отобранные воздушно-сухие семена Crepis capillaris (100 штук) равномерно распределяли в чашках Петри с фильтровальной бумагой, смоченной дистиллированной водой (контроль), и помещали в термостат при +250С. При определении мутагенной активности через 4 часа семена обрабатывали раствором исследуемого вещества и помещали в термостат на 2 часа. Затем семена промывали в проточной воде в течение 20 минут, проращивали в 0,01% растворе колхицина до появления проростков длиной 1,5— 2,0 мм. При оценке антимутагенной активности в опыте семена после замачивания (2 часа) обрабатывали 2 часа БАВ в
108
различных концентрациях (табл.2), промывали их 20 минут в проточной воде и обрабатывали 2 часа ЭМС (или ЦФ). Вновь промывали 20 минут и помещали в 0,01% раствор колхицина для прорастания (+250С). Предварительные исследования показали, что колхицин в такой концентрации и при такой методике применения не оказывал существенного влияния на результаты опыта. Кроме того, [22] блокатор микротрубочек колхицин в аналогичной концентрации не препятствует специфическому действию катехоламинов и их агонистов у растений. В период от 24 до 36 часов роста отбирали проростки с длиной корешков 1,5—2,0 мм. Верхушку корешков срезали, фиксировали в фиксаторе Карнуа, окрашивали ацетокармином и готовили давленые препараты [2]. Регистрировали все типы хромосомных и хроматидных аберраций, гепы не учитывали.
Оценка антимутагенной активности веществ, как правило, осуществляется в стадии предсинтеза ДНК, когда интенсивность репарационных процессов в клетке максимальна [2]. Поскольку фаза предсинтеза ДНК у семян первого года сбора наступает примерно через 8 часов
Таблищ 2
Антимутагенный эффект (АЭ) эпинефрина гидротартрата и его модификация адреноблокаторами в условиях
предварительной обработки
Вариант опыта Общее число метафаз Общее число аберраций Частота аберраций, % АЭ Р
Контроль 888 8 0,90+0,32 — —
ЭГТ 1031 19 1,84+0,42 — >0,05*
ПРС 1081 20 1,85+0,41 — >0,05*
ППЛ 574 9 1,57+0,52 — >0,05*
ПРС+ЭГТ 938 17 1,81+0,44 — >0,05*
ППЛ+ЭГТ 1073 18 1,68+0,39 — >0,05*
ЭМС 554 28 5,05+0,93 — <0,001*
ЭГТ+ЭМС 1184 22 1,86+0,39 63,2 <0,01**
ПРС+ЭМС 866 42 4,85+0,73 4 >0,05**
ППЛ+ЭМС 1207 52 4,31+0,58 14,7 >0,05**
ПРС+ЭГТ+ЭМС 1108 34 3,07+0,52 39,2 >0,05**
ППЛ+ЭГТ+ЭМС 1180 44 3,73+0,55 26,1 >0,05**
Примечание. * уровень значимости по сравнению с контролем, ** по сравнению с ЭМС, ЭГТ — эпинефрина гидро-тартра, ПРС — пророксан, ППЛ — пропранолол, ЭМС — этилметансульфонат, ЦФ — циклофосфамид.
после замачивания, то желательно, чтобы продолжительность всего опыта по оценке антимутагенной активности не превышала 8-10 часов.
Расчет антимутагенного эффекта (АЭ) производили по формуле, позволяющей вычислить процент снижения аберраций хромосом относительно индуктора мутаций [8]:
АЭ = (М1 — М2) / М 1X100,
где М£ — процент метафаз с нарушениями при действии мутагена, М2 — процент метафаз с нарушениями при действии мутагена и протектора.
Анализ генетической активности исследуемых биологически активных веществ (БАВ) осуществлялся в два этапа. Вначале изучалась мутагенная активность БАВ, что давало возможность отобрать для второго этапа исследования протекторной активности немутагенные концентрации препаратов. В этом случае мутагенный эффект БАВ не перекрывал антимутагенный.
В большинстве случаев изучаемые БАВ в исследованном диапазоне концентраций достоверно не повышали уровень генетических перестроек по сравнению с контролем. Исключение составил эпинефрина гидротартрат (ЭГТ), который в высокой концентрации (5,4^10-3М) индуцировал значительный уровень аберраций (2,50%; р<0,01) относительно контроля (0,71%), т.е. в 3,5 раза увеличил формиро-
вание мутаций. Способность снижать уровень аберраций, индуцированных мутагенами, показали как стимуляторы, так и блокаторы а- и Р-адренорецепторов. Однако в большей степени этот эффект был выражен у адреноблокаторов (АЭ пророк-сана — 76,8%, пропранолола —77,5%).
Следует отметить, что антимутагенный эффект сохранялся в широком диапазоне концентраций исследуемых препаратов, особенно эпинефрина гидротартрата, ор-ципреналина и пропранолола. Из всех исследованных препаратов по диапазону активных концентраций (ДАК) и максимальному антимутагенному эффекту (МАЭ) наиболее эффективными оказались эпинефрин (адреномиметик) и про-пранолол (адреноблокатор), наименее — а-адреномиметик фенилэфрин. Особо следует указать на разную способность препаратов снижать уровень аберраций, индуцированный ЭМС и ЦФ. Наиболее эффективно препараты подавляли мутагенез, индуцированный ЭМС. При этом выявлена следующая характерная особенность: при подавлении ЭМС-индуци-рованного мутагенеза МАЭ препаратов приходился на высокие концентрации. Напротив, при редукции аберраций, индуцированных ЦФ, МАЭ был ниже, но выявлялся у препаратов в низких концентрациях. Исключение составил а-адрено-миметик фенилэфрин, который редуцировал мутагенный эффект ЦФ, совершенно
109
не влияя на формирование аберраций, возникших под действием ЭМС.
Как известно, эпинефрин (адреналин) относится к стимуляторам а- и Р-адре-норецепторов. В наших исследованиях он показал себя как эффективный антимутаген. Было интересно определить его протекторный эффект в условиях, когда клетка обрабатывается блокаторами а- и Р-адренорецепторов до воздействия эпинефрина. Сложность постановки такого опыта заключалась в том, что сами блокаторы проявляют антимутагенный эффект. С этой целью концентрации блокаторов подбирались таким образом, чтобы они не оказывали по отдельности антимутагенный эффект. Для пророкса-на такой концентрацией была 2,68^10-7М, а для пропранолола — 3,86^10-8М. ЭГТ использовали в концентрации 3,0^10-9М. В этой концентрации ЭГТ эффективно снижал уровень аберраций, индуцированный ЭМС (табл. 2). Как видно по данным табл.2, ЭГТ эффективно (на 63,2%) подавлял уровень ЭМС-индуцированных аберраций. В присутствии блокаторов независимо от их типа происходило снижение протекторной активности ЭГТ. При этом Р-адреноблокатор пропранолол в большей степени подавлял АЭ эпинефри-на, чем а-адреноблокатор пророксан. При блокаде пророксаном АЭ был равен 39,2%, а пропранолола — 26,1%.
Таким образом, можно заключить, что а- и Р-блокаторы адренорецепторов активно снижают антимутагенный эффект адреналина. В большей мере ингибирующий эффект выражен у Р-блокатора.
ВЫВОДЫ
1. Стимуляторы и блокаторы а- и Р-адренорецепторов, за исключением эпи-нефрина гидротартрата, не обладают мутагенной активностью в клетках Crepis capillaris. Эпинефрина гидротартрат в высокой концентрации (5,4^10-3М) достоверно повышает уровень аберраций в клетках Crepis capillaris.
2. Стимуляторы и блокаторы адреноре-цепторов снижают уровень хромосомных аберраций в клетках растений.
3. Генопротекторный эффект эпи-нефрина гидротартрата предупреждается соответствующими блокаторами при
условии предварительной обработки ими клеток Crepis capillaris.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бочков Н. П., Дурнев А Д., Журков В. С. и др. Система поиска и изучения соединений с антимутагенными свойствами // Хим.-фарм. ж. — 1992. — Т. 26, № 9—10. — С. 42—46.
2. Дубинина Л. Г. Структурные мутации в опытах с Crepis capillaris.— М.: Наука, 1978. — 188 с.
3. Дурнев А. Д., Середенин С. Б. Мутагены (скрининг и фармакологическая профилактика воздействий). — М.: Медицина, 1998. — 328 с.
4. Золотарева Г. Н, Акаева Э. А. Лекарственный антимутагенез // Хим.-фарм. ж. — 1981. — Т. 15, № 12. — C. 9—14.
5. Ибрагимова М.Я., Семенов В.В., Ибрагимова Л.Я., Смоленская С.И. Адреналин — модификатор мутагенеза, индуцированного этилметансульфонатом // Казанский мед. ж. — 2005. — Т. 86, № 3. — С. 231—232.
6. Ибрагимова М.Я., Семенов В.В., Харитонов В.С. и др. Имеется ли мутагенная и антимутагенная активность у стимуляторов а- и p-адренорецепторов? // Казанский мед. ж. — 2007. — Т. 88, № 3. — С. 280.
7. Семенов В. В. Рецепторно-регуляторные механизмы действия антимутагенов // Вестн. РАМН. — 1997. — № 7. — С. 28—33.
8. Урбах В. Ю. Биометрические методы. — М.: Наука, 1964. — 415 c.
9. Худолей В.В. Методы регистрации и процедура тестирования загрязнителей среды на канцерогенность в хронических экспериментах на лабораторных животных: протокол, возможности, ограничения. // Мутагены и канцерогены окружающей среды и наследственность человека. — М., 1994. — Ч. 1. — С. 67—105.
10. Anderson D, Bishop J. B, Garner R. C. et al. Cyclophosphamide: review of its mutagenicity for an assessment of potential germ cell risk // Mutat. Res. — 1995. — Vol. 330. — P. 115—181.
11. Brand R. E, Lynch H. T. Genotype/phenotype of familial pancreatic cancer // Endocrinol Metab. Clin. North. Am. — 2006. — Vol. 35, № 2. — P. 405—415.
12. Cherdshewasart W, Sutjit W, Pulcharoen K, Chulasiri M. Mutagenic and antimutagenic effects of the traditional herb used for treating erectile dysfunction, Butea superba Roxb // Biosci. Biotechnol. Biochem. — 2010. — Vol. 74, № 5. — P. 923—927.
13. Di Sotto A., Mazzanti G, Carbone F. et al. Inhibition by beta-caryophyllene of ethyl methane-sulfonate-induced clastogenicity in cultured human lymphocytes // Mutat. Res. — 2010. — Vol. 699, №1—2. — P. 23—28.
14. Dorne J. L, Walton K, Renwick A.G. Human variability in xenobiotic metabolism and pathway-related uncertainty factors for chemical risk assessment: A review // Food Chem. Toxicol. — 2005. — Vol. 43, № 2. — P. 203—216.
15. Estrada-Camarena E., Lopez-Rubalcava C, Vega-Rivera N. et al. Antidepressant effects of estrogens: a basic approximation // Behav. Pharmacol. — 2010. — № 5—6. — P. 451— 464.
16. Gangar S.C., Sandhir R, Koul A. Anti-clastogenic activity of Azadirachta indica against benzo(a)pyrene in
murine forestomach tumorigenesis bioassay // Acta Pol. Pharm. - 2010. - Vol. 67, № 4. - P. 381-390.
17. Ho D, Yan L., Iwatsubo K. et al. Modulation of beta-adrenergic receptor signaling in heart fail-ure and longevity: targeting adenylyl cyclase type 5 // Heart Fail. Rev. — 2010. — № 5. - P. 495-512.
18. Limem I., Bouhlel I., Bouchemi M. et al. Phlomis mauritanica extracts reduce the xanthine oxidase activity, scavenge the superoxide anions, and inhibit the aflatoxin B1-, sodium azide-, and 4-nitrophenyldiamine-induced mutagenicity in bacteria // J. Med. Food. - 2010. - Vol. 13, № 3. - P. 717-724.
19. Maslat A. O., Jibril I., Mizyed S. Antimutagenic activities of two suspected anticarcinogenic bifunctional organoiron seleno-terephthalate derivatives // Drug Chem. Toxicol. - 2010. - Vol. 33, № 3. - P. 254-260.
20. Mosovska S., Mikulasova M, Brindzova L. et al. Genotoxic and antimutagenic activities of ex-tracts from pseudocereals in the Salmonella mutagenicity assay // Food Chem. Toxicol. - 2010. - Vol. 48, № 6. - 1483-1487.
21. Okey A. B, Franc M. A, Moffat I. D. et al. Toxicological implications of polymorphisms in receptors for xenobiotic chemicals: The case of the aryl hydrocarbon receptor //
Toxicol. Appl. Pharmacol. — 2005. — Vol. 207, Suppl. 2. — P. 43—51.
22. Roshchina V. V. Biomediators in chloroplasts of higher plants. 3. Effect of dopamine on photo-chemical activity // Photosynthetica. — 1990. — Vol. 24, № 1. — P. 117—121.
23. Thorgeirsson S. S., Lee J. S., Grisham J. W. Functional genomics of hepatocellular carcinoma // Hepatology. — 2006. — Vol. 43, 2 Suppl. 1. — P. 145—150.
24. Wacker D., Fenalti G., Brown M. A. et al. Conserved binding mode of human beta2 adrenergic receptor inverse agonists and antagonist revealed by X-ray crystallography // J. Am. Chem. Soc. — 2010. — Vol. 132, № 33. — P. 11443— 11445.
25. Wang C. G, Dai Y, Li D. L, Ma K. Y. Ginkgo biloba leaf extract action in scavenging free radicals and reducing mutagenicity and toxicity of cigarette smoke in vivo // J. Environ. Sci. Health. A Tox. Hazard. Subst. Environ. Eng. — 2010. — Vol. 45, № 4. — P. 49—505.
26. Waters M. D., Stack H. F., Jackson M. S. et al. Activity profiles of antimutagens: in vitro and in vivo data // Mutat. Res. — 1996. — Vol. 350. — P. 109—129.
Ill
