CC BY
15
во
70 60 50 40 ЗО
го ю о
<10000 <юоооо >100000
Рис. 1. Эффективность предобогащения в зависимости от индексов ЛКП.
По оси абсцисс — индекс ЛКП (в КОЕ/дм1). Здесь и на рис. 2: по оси ординат — находка сальмонелл (в %); а — с предобогашением, б — без предобогащения.
пробы на неэлективной среде предобогащения. В связи с этим мы проанализировали эффективность предобогащения на П Б проб воды с различными индексами лак-тозопозитивных кишечных палочек (ЛКП) и уровнями общей микробной обсемененности. Полученные при этом результаты свидетельствуют о том, что количество ЛКП практически не влияет на выделение сублетально поврежденных сальмонелл (наиболее высокая эффективность предобогащения отмечена при индексах ЛКП более 10 ООО клеток на 1 дм3) (рис. 1). Высеваемость сальмонелл при увеличении общего количества бактерий до 2000 клеток на 1 см3 и более как с использованием предобогащения, так и без него оказалась одинаковой (рис. 2).
Этот факт может быть обусловлен двумя причинами: во-первых, обилие микробной флоры может свидетельствовать о минимальном уровне воздействия стресси-рующих факторов, а следовательно, и об отсутствии сублетально поврежденных сальмонелл; во-вторых, явление микробного антагонизма может негативно сказаться на процедуре предобогащения. Однако, учитывая, что и при высоких уровнях микробного загрязнения высеваемость сальмонелл с использованием предобогащения не снизилась ниже уровня прямого посева, чего скорее следовало бы ожидать в результате интенсивного подавления роста этих микроорганизмов на неэлективной среде, более обоснованным представляется первое предположение.
Таким образом, использование предобогащения в неэлективной питательной среде позволило в 1,4—1,6 раза повысить высеваемость сальмонелл из воды поверхностных водоемов, при этом эффективность метода мало зависит от типа среды предобогащения (ПБ или ЗПВ) и температуры инкубации. В то же время использование этого методического приема значительно увеличивает трудоемкость исследования. Поэтому его использование целесообразно, на наш взгляд, при проведении исследований по эпидемическим показаниям или же в случаях изучения воздействия комплекса физических и химиче-
80 г 10 ■
<гоо <гооо >2000
Шб
Рис. 2. Эффективность предобогащения в зависимости от общего количества бактерий.
По оси абсцисс — общее количество бактерий (в КОЕ/см1).
ских факторов на находящиеся в воде микроорганизмы и формирование при этом у них сублетальных повреждений.
Л итература
1. Бойцов А. Г. // Гиг. и сан. - 1991. - № 8. - С. 67-69.
2. Виноградова Л. А. // Методы индикации биоценоза патогенных и потенциально патогенных микроорганизмов в объектах окружающей среды. — М., 1985.
- С. 42-53.
3. ГОСТ Р 50455—92. Мясо и мясные продукты. Обнаружение сальмонелл (арбитражный метод). — М., 1993.
4. ГОСТ Р 50480—93. Продукты пищевые. Метод выделения бактерий рода Salmonella. — М., 1993.
5. Методические указания по санитарно-микробиоло-гическому анализу воды поверхностных водоемов. № 2285-81. - М„ 1981.
6. Alcaide £., Martinez J. P., Garay E. // J. Appl. Bacteriol.
- 1984. - Vol. 56, № 3. - P. 365-371.
7. Alcaide E., Aznar R., Pujalate M. J., Garay E. // Zbl. Bacteriol. - 1987. - Bd 184, № 1. - S. 34-41.
8. Fricker C. R. // Ibid. - 1984. - Bd 119, №2. -S. 170-178.
9. Harvey R. W. S., Price Т. H. // J. Hyg. - 1987. -Vol. 87, № 2. - P. 219-224.
10. Mattick K. L., Jorgensen F., Legan J. D et al. //J. Food Prot. - 2001. - Vol. 64, № 10. - P. 1472-1476.
11. Tongpim S., Weumer R. R., Tammings S. K., Kam-plemacher E. H. // Int. J. Food Microbiol. — 1984. — Vol. 1, № 1. - P. 33-42.
12. Vassiliadis P., Trichopoulos D., Kalapothaki V., Serie Ch. I I J. Hyg. - 1981. - Vol. 87, № 1. - P. 35-41.
Поступила 18.04.02
Иа Ш
С КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2003 УДК 614.37:«15.46/.47)-07
В. Г. Лаппо, Н. М. Перова, Р. И. Каюмов, А. П. Еськов
ОЦЕНКА МЕСТНО-РАЗДРАЖАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ МЕДИЦИНСКИХ ИЗДЕЛИЙ IN VITRO НА СПЕРМЕ БЫКА
Всероссийский научно-исследовательский и испытательный институт медицинской техники Минздрава РФ, Москва
Оценка местно-раздражающего действия занимает важное место при токсикологических испытаниях изделий медицинского назначения. Этому виду испытаний подвергается более 80% всех медицинских изделий. В связи с этим актуален поиск новых методов, повышающих токсиколого-гигиеническую значимость испытаний, а также позволяющих снизить их продолжительность и стоимость. В настоящей работе нами исследова-
на возможность применения для оценки местно-раздражающего действия изделий медицинского назначения метода in vitro на кратковременной суспензионной культуре подвижных клеток — сперме быка. Этот метод in vitro давно и успешно используется в практике аккредитованных лабораторий для оценки общей токсичности самых разнообразных изделий [1, 5]. В последнее время были разработаны методики, позволившие применить
Таблица I
Оценка токсичности медицинских изделий методами in vivo (действие на слизистые оболочки глаза) и in vitro (действие на сперму быка)
Группа изделий
Количество образцов
Метод ¡m vitro
индекс токсичности /. Ж
минимальное и максимальное значения
средняя арифме-тиче-екая (х)
среднее квадра-тиче-ское отклонение (о)
Метод in vivo
токсический эффект
Изделия длительно- 14 85—106 го контакта с тканями глаза 4 38—50 Изделия, контакта- 42 74—120
руюшие с кожей 2 2—55 Перевязочные материалы
95 6.3
45 5,7 100 11,5
32 74-118 102 10.7
+ +
Примечание. Здесь и в табл. 2—4: плюс — наличие, минус — отсутствие эффекта.
этот метод для оценки местно-раздражающего действия парфюмерно-косметической продукции [7] и товаров бытовой химии [4].
Чтобы заменить какой-либо метод испытаний in vivo методом in vitro, необходимо провести нормирование метода in vitro. Нормирование сводится к определению норматива — значения экспериментально оцениваемого параметра метода in vitro, используя которое можно разделять все испытуемые образцы на токсичные и нетоксичные. При этом результаты деления испытуемых образцов на токсичные и нетоксичные обоими методами (in vivo и in vitro) должны совпадать. Определение норматива для метода in vitro осуществляют путем сопоставления результатов параллельных испытании in vivo и in vitro.
В параллельных экспериментах in vivo и in vitro были исследованы следующие группы изделий: изделия, длительно контактирующие с тканями глаза (интраокуляр-ные линзы); изделия, контактирующие с вагиной; гигиенические прокладки; перевязочные материалы; изделия, контактирующие с неповрежденной кожей; изделия из латекса (перчатки и презервативы); резиносодержащие изделия. Деление испытуемых изделий на группы проводилось с учетом вида контакта с целостным организмом, его продолжительности, а также материала изделия. В испытуемые группы не входят медицинские изделия и материалы, содержащие бактерицидные и бактериоста-тические компоненты.
Таблица 2
Оценка токсичности медицинских изделий методами in vivo (раздражающее действие на ткани влагалища) и in vitro (действие на сперму быка)
Группа изделий Количество образцов Метод in vitro Метод in vivo
индекс токсичности /„ % токсический эффект
минимальное и максимальное значение средняя арифметическая, (х) среднее квалрз-тиче-ское отклонение (о)
Изделия, контакти-
рующие с вагиной 16 77-115 104 12,3 -
Гигиенические
прокладки 13 80-119 100 9,3 -
Изделия из латекса 29 12-116 71 30 -
Таблица 3
Оценка токсичности медицинских изделий методами in vivo (кож-но-раздражающее действие) и in vitro (действие на сперму быка)
Группа изделий Количество образцов Метод in vitro Метол in vivo
индекс токсичности 1„ % токсический эффект
минимальное и максимальное значения средняя арифме-тиче-скля (х) среднее квадра-тиче-ское отклонение (о)
Изделия, контакти-
рующие с кожей 53 60-120 99 13,7 -
Перевязочные ма-
териалы 42 74-120 101 10,5 -
Резино-содержа-
шис изделия 16 36-107 78 22,8 -
Изделия из латекса 50 1 ± 116 65 34 -
В экспериментах на животных (кролики, крысы, морские свинки) исследовалось раздражающее и сенсибилизирующее действие. При этом использовался набор рекомендованных методик [3, 6].
Оценка токсичности методом in vitro проводилась на анализаторе токсичности АТ-05, который позволяет определить индекс токсичности вытяжки изделия:
' JCOHTP
'ср
100%,
где и — средние арифметические значения среднего времени подвижности сперматозоидов в контроле и опыте |1, 2].
Результаты параллельных испытаний in vivo и in vitro и их статистический анализ представлены в табл. 1—4. Для возможной замены методов in vivo на метод in vitro по результатам параллельных испытаний определяли нормативные значения индекса токсичности. За нижнюю границу нормативного интервала принимали наименьшую величину индекса токсичности среди всех вытяжек, не оказавших действие in vivo. За верхнюю границу нормативного интервала принимали наибольшую величину индекса токсичности среди всех вытяжек, не оказавших действия in vivo. Меньшее нормативное значение индекса токсичности отсекает образцы, оказывающие сильное угнетающее действие, большее — сильное стимулирующее действие. Ситуация подобна той, которая наблюдается при испытаниях на целостном организме млекопитающих, где отклонение от "нормы" как в сторону угнетения, так и в сторону стимуляции признается одинаково неблагоприятным.
Таблица 4
Оценка токсичности медицинских изделий методами in vivo (сенсибилизирующее действие) и in vitro (действие на сперму быка)
Метол im vitro Метод in vivo
Количество образцов индекс токсичности /„ % токсический эффект
Группа изделий минимальное и максимальное значения средняя арифметическая (х) среднее квадра-тиче-скос отклонение (о)
Изделия, контактирующие с кожей
Изделия из латекса 33
15 84-116
I 2 12-114
99 54
9,4 32,4
Для групп изделий, длительно контактирующих с тканями глаза, изделий, контактирующих с вагиной, гигиенических прокладок, перевязочных материалов, изделий, контактирующих с неповрежденной кожей, ни из литературы, ни из собственного опыта нам не известно о рекламациях потребителя по признаку токсичности, что свидетельствует об адекватности используемых методов in vivo требованиям, предъявляемым к данным изделиям по признаку нетоксичности. Диапазон индексов токсичности для вытяжек, не оказавших токсического действия in vivo, простирается от 60 до 120%. Отсутствие токсического действия in vivo для данной группы изделий и небольшое значение среднего квадратического отклонения для выборки индексов токсичности при испытаниях in vitro отражают сложившийся стабильно высокий уровень качества данной группы изделий по параметру нетоксичности. Следуя изложенному выше принципу нормирования для конкретной группы изделий, нормативный интервал оказывается между минимальным и максимальным значением индексов токсичности для соответствующей выборки данных. Для всех этих групп изделий нормативные интервалы не выходят за пределы 60—120%. Используя данный нормативный интервал, мы разделяем изделия соответствующей группы на токсичные и нетоксичные так же, как это делают методики с использованием животных.
Из приведенных в таблицах данных, видно, что для группы изделий из латекса и резиносодержащих изделий при испытаниях in vitro выборки экспериментальных данных характеризуются сравнительно большим средним квадратическим отклонением. Диапазон индексов токсичности для вытяжек, не оказавших токсического действия in vivo, простирается от 1 до 116% для группы изделий из латекса и от 36 до 107% для резиносодержащих изделий. Такой широкий диапазон индекса токсичности свидетельствует о нестабильном качестве этих групп изделий по признаку цитотоксичности. Полученные результаты перекликаются с результатами анализа мирового и отечественного опыта применения изделий из латекса и резиносодержащих изделий. У части людей, контактирующих с прошедшими токсикологические испытания изделиями из латекса, наблюдается контактная гиперчувствительность. В США сенсибилизацией к латексу страдают 17% медицинских работников, использующих перчатки [8]. В Дании у 3% медицинских работников выявлена аллергическая реакция на латекс [9]. Данные факты свидетельствуют, что применяемые методики оценки их качества не в полной мере адекватны требованиям, предъявляемым к этим изделиям по признаку нетоксичности. Можно предположить, что в латек-сах содержатся вещества, оказывающие действие на кожу части людей, но не улавливаемые при токсикологических испытаниях методами in vivo. В то же время действие этих веществ хорошо улавливается клеточным тест-объектом, что проявляется в виде цитотоксического эффекта. Полученные данные для группы изделий из латекса (см. табл. 3) можно разбить на две выборки, используя эмпирический нормативный интервал 60—120%.
Получившиеся выборки характеризуются соответственно средними арифметическими значениями 92 и 32% при значениях среднего квадратического отклонения 17 и 16% соответственно. Таким образом, метод in vitro показывает, что группа перчаток и презервативов состоит из двух выборок: изделий высокого качества и изделий низкого качества. Решение проблемы выбора наиболее адекватной методики оценки качества изделий из латекса может быть упрощено и ускорено, если подвергать испытаниям in vitro изделия, прошедшие токсикологические испытания на животных, но "забракованные" потребителем на стадии применения. При этом быстро может быть набран материал по параллельным испытаниям методом in vitro и на человеке. До окончательного решения проблемы при испытаниях in vitro для этих групп изделий целесообразно использовать нормативный интервал 60-120%.
Выводы. Показана возможность применения и определены нормативные интервалы индекса токсичности для оценки местно-раздражающего действия для нескольких групп изделий медицинского назначения методом in vitro. Применение этого метода позволит не только ускорить и удешевить испытания, но, возможно, и повысить качество и надежность испытаний резиносодержащих изделий и изделий из латекса.
Л итература
1. Биотестирование продукции из полимерных и других материалов (МУ 1.1.037-95). - М., 1996.
2. ГОСТ Р ИСО 10993.5—99. Изделия медицинские. Исследование на цитотоксичность: методы in vitro. - М„ 2000.
3. ГОСТ Р ИСО 10993.10—99. Изделия медицинские. Исследование раздражающего и сенсибилизирующего действия. — М., 2000.
4. Оценка токсичности товаров бытовой химии. Экспресс-метод оценки токсичности моющих средств с использованием в качестве тест-объекта спермы крупного рогатого скота: Метод, рекомендации. — М„ 2002.
5. Регламент, устанавливающий порядок проведения санитарно-химических, токсикологических и биологических испытаний стерилизованных шприцев инъекционных однократного применения. — М., 1991.
6. Сборник руководящих методических материалов по токсиколого-гигиеническим исследованиям полимерных материалов и изделий на их основе медицинского назначения. — М., 1987.
7. Экспресс-метод оценки общетоксического и кож-но-раздражающего действия парфюмерно-косметической продукции in vitro (на культуре подвижных клеток): Метод, рекомендации. — М., 2001.
8. Fay М. F. // Allergologie. - 1995. - Bd 18, N 10. -S. 451.
9. Knudsen В. В. // Ibid. - S. 451-452.
Поступила 13.05.02
