CC BY
171
УДК 632.937.32
Профессор М.В. Лозовская, вед. науч. сотрудник И.И. Новикова, вед. науч. сотрудник И.В. Бойкова, доцент М.И. Пироговский, доцент Н.В. Смирнова, магистрант A.C. Павленко, магистрант Г.А. Кузнецова
(Астраханский гос. ун-т) кафедра зоологии и аквакультуры, Всероссийский институт защиты растений, тел. (8512) 52-49-95 E-mail: [email protected]
Professor M.V. Lozovskaya, Leading Researcher I.I. Novikova, Leading Researcher I.V. Boykova, Associate Professor M.I. Pirogovsky, Associate Professor N.V. Smirnova, Undergraduate A.S. Pavlenko, Undergraduate G.A. Kuznetsova
(Astrakhan state University) chair of zoology and aquaculture, Russian research institute of protection of plants, tel. (8512) 52-49-95 E-mail: [email protected]
Оценка лепидодидной активности биологических препаратов на основе штаммов Bacillus thuringiensis
Assessment of lepidotsidny activity of biological preparations on the basis of Bacillus thuringiensis strains
Реферат. Потери продукции растениеводства от различного рода фитофагов происходят на всех этапах выращивания растений. Серьезной проблемой для Астраханской области стало вселение в агроценозы вредителя риса - огневки желтой рисовой. Отмечено распространение вида на участки, удалённые на 20-30 км от площадей, используемых под выращивание риса, а также повреждение этим вредителем растений, принадлежащих к семействам пасленовых, гречишных, злаковых. Исследования, направленные на повышение эффективности растениеводства и понижение уровня потерь, весьма актуальны. Для уничтожения вредителей и болезней известны следующие методы борьбы: агротехнический, физический, механический, биологический, химический и карантин. Использование биологических методов борьбы с вредителями растений более предпочтительно, так как используемые средства не оказывают отрицательного воздействия на теплокровных, в том числе человека, не загрязняют окружающую среду. В настоящее время в борьбе с вредителями и болезнями растений широко используются бактерии. Среди наиболее популярных - спорообразуюгцие кристаллонос-ные факультативно-энтомопатогенные бациллы группы Bacillus thuringiensis. Однако различные штаммы Bacillus thuringiensis обладают разными патогенными свойствами по отношению к таксономическим группам насекомых. Цель исследования - оценка биологической активности некоторых коллекционных штаммов Bacillus thuringiensis по отношению к личинкам чешуекрылых в лабораторных условиях. Была проведена оценка биологической активности
коллекционных штаммов Bacillus thuringiensis (№ 67, 75, Нз), а также
(Q Лозовская М.В., Новикова И.И., Бойкова И.В., Пироговский М.И., Смирнова Н.В., Павленко A.C., Кузнецова Г.А., 2014
препарата Лепидоцид СП на гусеницах Galleria mellonella младших возрастов. Штаммы В.thuringiensis № 67, 75, Нз культивировали на стандартной питательной среде СПБ (сухой питательный бульон на основе гидролизата кильки) в качалочных колбах объемом 750 мл в 100 мл среды в течение 2 сут при температуре 28 °С. Для оценки вирулентности данных штаммов по отношению к гусеницам G.mellonella использовали культуральную жидкость, титр которой составлял 1011 КОЕ/мл.
Summary. Losses of production of plant growing from different phytophages happen at all stages of cultivation of plants. Installation in agrotsenoza of the wrecker of rice - a pyralid yellow rice became a serious problem for the Astrakhan region. Distribution of a view of the sites removed on 20-30 km from the areas used under rice cultivation, and also damage by this wrecker of the plants belonging to families the paslenovykh, the grechishnykh, cereals is noted. The researches directed on increase of efficiency of plant growing and lowering of the level of losses are very actual. For destruction of wreckers and diseases the following methods of fight are known: agrotechnical, physical, mechanical, biological, chemical and quarantine. Use of biological methods of pest control of plants more preferably as the used means don't make negative impact on warm-blooded, including the person, don't pollute environment. Now in pest control and diseases of plants bacteria are widely used. Among the most popular - spo-roobrazuyushchy crystalliferous facultative bacilli of Bacillus thuringiensis group. However various strains of Bacillus thuringiensis possess different pathogenic properties in relation to taxonomical groups of insects. A research objective - an assessment of biological activity of some collection strains of Bacillus thuringiensis in relation to larvae of Lepidoptera in vitro. The assessment of biological activity of collection strains of Bacillus thuringiensis (№ 67, 75, Нз), and also a preparation Lepidotsid by the joint venture on caterpillars of Galleria mellonella of younger age was carried out. Strains of B.thuringiensis № 67, 75, Нз cultivated on a standard nutrient medium of SPB (dry nutritious broth on the basis of a hydrolyzate of a sprat) in the kachalochnykh flasks of 750 ml in 100 ml of the environment during 2 days at a temperature of 28 °C. For an assessment of a virulent-nost of these strains in relation to caterpillars of G.mellonella used cultural liquid which caption made 1011, WHICH.
Ключевые слова: Bacillus thuringiensis, штаммы, биологическая активность, Galleria mellonella, модельный объект, Lepidoptera, Pyralidae.
Keywords: Bacillus thuringiensis, strains, biological activity, Chilo suppressalis, Galleria mellonella, model object, Lepidoptera, Pyralidae.
Потери продукции растениеводства от различного рода фитофагов происходят на всех этапах выращивания растений. Они начинаются от посевов или посадки до переработки или непосредственного потребления и колеблются в пределах от 25 до 50 %. Известно, что в странах с высоким уровнем земледелия, оптимальным уходом за посевами и высокотехнологическим уровнем переработки продукции потери несколько ниже - 25-30 %. В обоих случаях потери сельхозпродукции находятся в недопустимых пределах.
Серьезной проблемой для Астраханской области стало вселение в агроценозы вредителя риса - огневки желтой рисовой (Chilo suppressalis Wlk.). По имеющимся литературным сведениям [2] можно считать, что рисовая огнёвка на полях Астраханской области распространилась в середине 80-х гг. прошлого века. Этого времени оказалось достаточно, для того чтобы вид-вселенец сформировал популяцию и накопил большую численность. Среднемноголетняя численность личинок огнёвки рисовой желтой за период 1990 -2010 годы составила 30,76 экз/м2. Отмечено распространение вида на участки, удалённые на 20-30 км от площадей, используемых под выращивание риса, а также повреждение этим вредителем растений,
принадлежащих к семействам пасленовых (Solanaceae), гречишных (Polygonaceaé), злаковых (Poáceae).
Огнёвка рисовая желтая - поливольтинный вид, дающий в Астраханской области 3-4 поколения, чем и объясняется массовое количество гусениц в период вымётывания метёлок риса и огромный ущерб, наносимый урожаю. Понятно, что исследования, направленные на повышение эффективности растениеводства и понижение уровня потерь, весьма актуальны.
Для уничтожения вредителей и болезней известны следующие методы борьбы: агротехнический, физический, механический, биологический, химический и карантин. Однако ни один из этих методов не является универсальным. Биологические методы борьбы с вредителями растений более предпочтительны, так как используемые средства не оказывают отрицательного влияния на теплокровных, в том числе человека, не загрязняют окружающую среду [5]. Биологические методы защиты растений основаны на использовании естественных врагов вредных видов для предупреждения или подавления их массового размножения - энтомофагов (хищников и паразитов насекомых); насекомоядных птиц и зверей; микроорганизмов и виру-
В настоящее время в борьбе с вредителями и болезнями растений широко используются бактерии. Среди наиболее популярных - спорообразующие кристалло-носные факультативно-энтомопатогенные бациллы группы Bacillus thuringiensis. Известны препараты на их основе: дендробациллин, энтобактерин, гомелин, лепи-доцид и другие. Они не отпугивают насекомых, так как не имеют специфического запаха, не опасны для теплокровных животных и не повреждают растения.
Bacillus thuringiensis - энтомопатогенный аэробный почвенный грамположи-тельный микроорганизм, обладающий способностью в ходе споруляции образовывать кристаллоподобные включения, состоящие из энтомоцидных белков - дельта-эндотоксинов. При попадании в кишечник насекомого белковый кристалл растворяется в щелочной среде кишечного сока. Растворенные протоксины активируются протеолитическими трипсино- и химотрипсиноподобными ферментами кишечника до «истинных токсинов». Следующей стадией токсического воздействия является связывание «истинного токсина» с аффинным к нему белком (рецептором), экспонированным на поверхности апикальных мембран эпителиальных клеток кишечника. Связывание токсина с рецептором является обратимым [6, 7]. На следующей стадии происходит необходимая перестройка конформации молекулы токсина с последующим внедрением некоторых из формирующих её структур в мембранный бислой. После этого связывание токсина с мембраной становится необратимым [7]. Энтомопатогенные свойства проявляются при массовом развитии бактерий в кишечнике чувствительных видов насекомых. Однако различные штаммы Bacillus thuringiensis обладают разными патогенными свойствами по отношению к таксономическим группам насекомых. Так известны, штаммы, отличающиеся патоген -ностью по отношению к личинкам чешуекрылых, двукрылых [1, 3, 4]. Поэтому важна оценка энтомопатогенности отдельных штаммов Bacillus thuringiensis по отношению к конкретным таксономическим группам насекомых.
Цель исследования - оценка биологической активности некоторых коллекционных штаммов Bacillus thuringiensis по отношению к личинкам чешуекрылых в лабораторных условиях.
В работе использованы щтаммы Bacillus thuringiensis из коллекции Всероссийского научно-исследовательского института защиты растений.
Была проведена оценка биологической активности коллекционных штаммов Bacillus thuringiensis (№ 67, 75, Нз), а также препарата Лепидоцид СП на гусеницах Galleria mellonella младших возрастов.
Galleria mellonella L. (Lepidoptera, Pyralidae) - большая восковая моль или огневка пчелиная - является широко известным тест-объектом, используемым в качестве
лабораторного хозяина при выращивании насекомых - энтомофагов, применяемых для биологической защиты растений в сельском хозяйстве; в качестве тест-объекта для оценки активности и качества бактериальных препаратов; а также в качестве объекта биохимических и физиологических исследований в энтомологии.
Гусениц О.тейопейа 1-2 возраста для проведения опыта выращивали заранее в течение 3 недель на искусственной питательной среде (ИПС) следующего состава: крупа пшеничная, отруби пшеничные, мука пшеничная, молоко сухое, БВК (дрожжи), глицерин, мед, воск пчелиный. В эксперименте использовано 240 гусениц.
Штаммы ВЛНиппдгепзгз № 67, 75, Нз культивировали на стандартной питательной среде СПБ (сухой питательный бульон на основе гидролизата кильки) в ка-чалочных колбах объемом 750 мл в 100 мл среды в течение двух суток при температуре 28 °С. Для оценки вирулентности данных штаммов по отношению к гусеницам О.тейопейа использовали культуральную жидкость, титр которой составлял 1011 КОЕ/мл.
Стандартный препарат Лепидоцид СП применяли в концентрации 1 %.
В стерильные чашки Петри раскладывали по 1 г питательной среды (ИПС) для гусениц О.тейопейа. Для оценки активности штаммов ВЛНиппдгепзгз № 67, 75, Нзи Лепидоцида, СП на ИПС наносили по 1 мл суспензии (КЖ или 1 %-ный раствор ле-пидоцида). Среду тщательно перемешивали, после чего на нее подсаживали по 10 гусениц младшего возраста в трех повторностях. В контроле насекомых и корм обрабатывали водой. Опытные и контрольные чашки выдерживали при комнатной температуре. Учеты гибели проводили на 3-й, 5- и 7-е сут. (табл. 1).
Таблица 1
Биологическая активность штаммов №67, 75, Нз Bacillus thuringiensis и препарата Лепидоцид СП в отношении гусениц G. mellonella L.
№ штамма, препарат Повтор-ность Кол-во насекомых в опыте Учет смертности (сут) Смертность насекомых, %
3 5 7
Контроль 1 10 0/10 0/10 0/10 0
2 10 0/10 0/10 0/10
3 10 0/10 0/10 0/10
Лепидоцид, СП 1 10 0/10 0/10 0/10 3
2 10 1/10 1/10 1/10
3 10 0/10 0/10 0/10
В. thu ringiensis 1 10 4/10 4/10 4/10 36
штамм Нз 2 10 0/10 0/10 0/10
3 10 7/10 7/10 7/10
В. thu ringiensis 1 10 10/10 10/10 10/10 100
штамм 67 2 10 10/10 10/10 10/10
3 10 10/10 10/10 10/10
В. thu ringiensis 1 10 10/10 10/10 10/10 96
штамм 75 2 10 9/10 9/10 9/10
3 10 10/10 10/10 10/10
Анализ данных табл. 1 показал, что наиболее высокая смертность гусениц огневки пчелиной отмечена после обработки корма коллекционными штаммами ВЛНиппдгепзгз № 67 и 75 - уже через 3 сут практически все насекомые погибли. Стандартный препарат Лепидоцид СП не проявил инсектицидной активности в отношении тест-насекомого.
В следующей серии опытов была определена активность штаммов ВЛНиппдгепзгз № 67 и 75 в разведениях (табл. 2). Как видно из табл. 2, обработка
гусениц жидкой препаративной формой вызывала их высокую гибель во всех испытанных разведениях.
Таблица 2
Биологическая активность штаммов Bacillus thuringiensis №67 и 75 в сниженных концентрациях в отношении гусениц G. mellonella L.
№ штамма Разведение культур альн ой жидкости, титр жизнеспособных клеток Повтор-ность Кол-во гусениц в опыте Учет гибели гусениц на 3 сут Смертность насекомых, %
Контроль 1 10 0 0
2 10 0
3 10 0
В. thuringiensis штамм 67 Без разведения 1011 КОЕ/мл 1 10 10 100
2 10 10
3 10 10
Разведение 1:5 5x10ю КОЕ/мл 1 10 10 86
2 10 9
3 10 7
Разведение 1:10 1010 КОЕ/мл 1 10 7 86
2 10 10
3 10 9
В. thuringiensis штамм 75 Без разведения 1011 КОЕ/мл 1 10 9 93
2 10 9
3 10 10
Разведение 1:5 5x10ю КОЕ/мл 1 10 10 90
2 10 8
3 10 9
Разведение 1:10 1010 КОЕ/мл 1 10 8 86
2 10 9
3 10 9
Таким образом, предварительно полученные в лабораторных модельных опытах данные позволяют сделать вывод о перспективности использования штаммов В.thuringiensis № 67 и 75 5-го серотипа для борьбы с чешуекрылыми и, в частности, с представителями семейства огневок.
Работа выполнена при грантовой поддержке Министерства образования и науки Астраханской области.
ЛИТЕРАТУРА
1. Вятчина, О.Ф. Экологические особенности энтомопатогенных бактерий вида Bacillus thuringiensis, циркулирующих в биоценозах Камчатки [Текст] / О.Ф. Вятчина: дис. канд. биол. наук.- Иркутск, 2003. - 244 с.
2. Ковалёв, P.K. Chilo suppressalis Walk. - Представитель семейства Piralididae в рисовых севооборотах Астраханской области [Текст] / Р.К. Ковалёв, М.В. Лозовская, М.И. Пироговский // Естественные науки.- 2012.- № 3.- С. 29-31.
3. Парамонова, И.Е. Активный штамм Bacillus thuringiesis - продуцент белка б-эндотоксина [Текст] / И.Е. Парамонова, М.В. Фоменко, Д.С. Балпанов, O.A. Тен
// Вестник ЕНУ им. Л.Н. Гумилева.- 2013.- № 6.- С. 262-269.
4. Смирнов, О.В. Патотипы Bacillus thuringiensis и экологические основы их использования в защите растений [Текст] / О.В. Смирнов: автореф. дис. докт. биол. Наук.- СПб.: Пушкин, 2000. - 42 с.
5. Терентьев, О. Использование биологических препаратов на посевах сельскохозяйственных культур (обзор) [Текст] / О. Терентьев // Агро-Информ.- 2006.
- № 91. - С. 15-45.
6. Hofmann, С. Binding and activity of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin to invertebrate cells [Text] / C. Hofmann, P. Luthy // Arch. Microbiology.- 1986.-№ 146.-P. 7-11.
7. Hofmann, C. Binding of the delta-endotoxin from Bacillus thuringiensis to brush-border membrane vesicles of the cabbage butterfly (Pieris brassicae) [Text] / C. Hofmann, P. Luthy, R. Hutter, V. Pliska // European Journal of Biochemistry.
- 1988.- № 173.- P. 85-91.
8. Ihara, H. Specific toxicity of d-endotoxins from Bacillus thuringiensis to Bombyx mori [Text] / H. Ihara, E. Kuroda, A. Wadano, M. Himeno // Bioscience, Biotechnology, Biochemistry.- 1993.- № 57.- P. 200-204.
REFERENCES
1. Vjatchina, O.F. Jekologicheskie osobennosti jentomopatogennyh bakterij vida bacillus thuringiensis, cirkulirujushhih v biocenozah Kamchatki [Text] / O.F. Vjatchina: .-dis. kand.biol.nauk.- Irkutsk, 2003.-244 p. [Ecological features of entomopathogen bacteria «bacillus thuringiensis» passing in Kamchatka biocenoses // Thesis (PhD, Candidate of Science in Biology)]
2. Kovalev, R.K. Chilo suppressalis Walk, is a representative of family Piralididae in rice crop rotations of Astrakhan region [Text] / R.K. Kovalev, M.V. Lozovskaya, M.I. Pirogovsky // Natural Sciences.- 2012.- № 3.-P. 29-31.
3. Paramonova, I.E. Aktivnyj shtamm Bacillus thuringiesis - producent belka б -jendotoksina [Text] / I.E. Paramonova, M.V. Fomenko, D.S. Balpanov, O.A. Ten / / Vestnik ENU im. L.N. Gumileva.- 2013.- № 6.-P.262-269. [Active strain Bacillus thuringiesis is producer of б-endotoxin protein // L.N. Gumilev ENU Bulletin]
4. Smirnov, O.V. Patotipy Bacillus thuringiensis i jekologicheskie osnovy ih ispol'zovanija v zashhite rastenij [Text] : avtoref. dis.dokt. biol. nauk / O.V. Smirnov; Vseros. nauch.- issledovat. in-t s.-h. mikrobiologii. SPb.; Pushkin, 2000. - 42 p. [Pathotypes of Bacillus thuringiensis and ecological foundations of their use in plant defence // Thesis abstract (PhD, Candidate of Science in Biology) / Ail-Russian research institute of agriculture microbiology]
5. Terent'ev, O. Ispol'zovanie biologicheskih preparatov na posevah sel'skohozjajstvennyh kul'tur (obzor) [Text] / O. Terent'ev // Agro-Inform. 2006. - № 91.
- P. 15-45 [Use of biological preparations in agricultural corps (review) / / Agro-Inform]
6. Hofmann, C. Binding and activity of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin to invertebrate cells [Text] / C. Hofmann, P. Luthy // Arch. Microbiology.- 1986.-№ 146.-P. 7-11.
7. Hofmann, C. Binding of the delta-endotoxin from Bacillus thuringiensis to brush-border membrane vesicles of the cabbage butterfly (Pieris brassicae) [Text] / C. Hofmann, P. Luthy, R. Hutter, V. Pliska // European Journal of Biochemistry.
- 1988.- № 173.- P. 85-91.
8. Ihara, H. Specific toxicity of d-endotoxins from Bacillus thuringiensis to Bombyx mori [Text] / H. Ihara, E. Kuroda, A. Wadano, M. Himeno // Bioscience, Biotechnology, Biochemistry.- 1993.- № 57.- P. 200-204.
