CC BY
36
УДК 631.46: 631.461.5
DOI 10.24411/0235-2516-2018-10076
ОЦЕНКА КОНСОРЦИУМА МИКРООРГАНИЗМОВ С ВЫСОКОЙ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ И УСТОЙЧИВОСТЬЮ К ПЕСТИЦИДНОМУ СТРЕССУ
Т.Ю. Мотина, к.б.н., И.А. Дегтярева, д.б.н., А.Я. Давлетшина, к.с.-х.н., И.А. Яппаров, д.б.н., А.Х. Яппаров, д.с.-х.н.
Татарский научно-исследовательский институт агрохимии и почвоведения ФИЦКазанский научный центр РАН, e-mail: [email protected]
Из различных почв Республики Татарстан выделены автохтонные диазотрофные (Azotobacter chroococcum 5 V(e), Pseudomonas brassicacearum 26W(в)) и фосфатмобилизующие (Achromobacter xylosoxidans 5 F(6), Sphingobacterium multivorum 6 F(6)) микроорганизмы с полифункциональными положительными свойствами. На основе лучших из них по нитрогеназной активности, способности продуцировать антибиотические вещества, подавляющие рост фитопатогенов, влиянию на энергию прорастания и всхожесть семян, морфо- и биометрические параметры проростков и другим свойствам созданы бинарные ассоциации и консорциум. Выявлено, что из трех бактериальных сообществ максимальную устойчивость к действию пестицидов различного назначения (Актара, Лонтрел, Ордан, Раундап, Фитоверм) проявляет консорциум из четырех штаммов. Консорциум микроорганизмов снижает токсичность по отношению к тест-растениям, особенно при совместном действии с гербицидом Лонтрел. Комплексное применение консорциума микроорганизмов и пестицидов обусловливает интегрированную систему защиты растений.
Ключевые слова: диазотрофы, фосфатмобилизующие микроорганизмы, ассоциации микроорганизмов.
ESTIMATION OF THE MICROORGANISMS' CONSORTIUM WITH HIGH BIOLOGICAL ACTIVITY AND STABILITY TO PESTICIDE STRESS
PhD. T.Yu. Motina, Dr. Sci. I.A. Degtyareva, PhD. A.Ya. Davletshina, Dr. Sci. I.A. Yapparov, Dr. Sci. A.Kh. Yapparov
Tatar Scientific Research Institute of Agrochemistry and Soil Science, FRC Kazan Scientific Center, Russian Academy of Sciences, e-mail: [email protected]
Autochthonous diazotrophic (Azotobacter chroococcum 5 V(e), Pseudomonas brassicacearum 26W(b) and phosphate-mobile (Achromobacter xylosoxidans 5 F(b), Sphingobacterium miltivorum 6 F(b)) microorganisms with multifunctional positive properties were isolated from various soils of the Republic of Tatarstan. On the basis of the best of them on nitrogenase activity, ability to produce antibiotic substances suppressing growth ofphytopato-gens, the effect on the energy of germination and germination of seeds, morpho- and biometric parameters of sprouts and other properties binary associations and consortium are created. It was revealed that the maximum resistance to the action of pesticides for various purposes (Actara, Lontrel, Ordan, Roundup, Fitoverm) is shown by consortium offour strains from three bacterial communities. The consortium of microorganisms reduces toxicity to the test plants, especially when combined with the herbicide Lontrel. The integrated application of a consortium of microorganisms and pesticides provides an integrated plant protection system.
Keywords: diazotrophic, phosphate-mobilizing microorganisms, association of microorganisms.
Использование биопрепаратов на основе эффективных микроорганизмов - одно из наиболее перспективных направлений в борьбе с возбудителями болезней растений [1, 2]. Защитный эффект микроорганизмов, составляющих основу биопрепаратов, связан с активной колонизацией ризосферы и фил-лосферы растений, пролонгированным синтезом ан-
тибиотических веществ и ферментов хитинолитиче-ского ряда, а также индукцией иммунитета растений [3, 4]. Сложность при создании биопрепаратов заключается в разнообразии видового состава микроорганизмов, требующих подбора индивидуальных питательных сред, условий культивирования, стабилизации готового продукта и т.д. В последние годы
большинство исследователей поддерживают прогрессивную форму интегрированной системы защиты растений, при которой биоудобрения и химические пестициды используют совместно [5, 6]. Комплексное применение обеспечивает синергизм действия препаратов и оказывает наибольший инги-бирующий эффект на фитопатогенные микроорганизмы сельскохозяйственных культур [7-9]. Возможность совместного применения биоудобрений с пестицидами позволяет уменьшить нормы расхода препаратов и снизить стоимость предпосевного протравливания семян, а также пестицидный прессинг на аг-рофитоценозы и получить безопасную продукцию.
Цель исследования - оценка устойчивости и активности новых штаммов микроорганизмов при создании комплексных биопестицидных препаратов.
Объекты и методы исследования. Из различных типов почв Республики Татарстан выделены и изучены почвенные микроорганизмы, способные фиксировать атмосферный азот и мобилизовать соединения фосфора, на их основе сформированы бинарные ассоциации и консорциум [1, 10-12]. По совокупности культурально-морфологических признаков осуществляли идентификацию микроорганизмов до рода [13]. В ходе создания консорциума, поддержания активного состояния и учета количества микроорганизмов использовали питательные среды: Эшби - для аэробных азотфиксирующих ассоциаций, Муромцева - для фосфатмобилизующих, Бэрка - для микроорганизмов консорциума [14-16].
При отборе автохтонных микроорганизмов из различных почв Татарстана учитывали многие их свойства, в частности нитрогеназную активность, способность ризосферных микроорганизмов продуцировать антибиотические вещества, подавляющие рост фитопатогенов, влияние на энергию прорастания, всхожесть семян, биометрические параметры проростков и др. Нитрогеназную активность выделенных микроорганизмов определяли ацетиленовым методом [17]. Исследуемые штаммы характеризовались различной степенью активности нитроге-назы (110,2-1501,9 нМ ^/мл х ч), большинство из них может быть отнесено к высокоактивным, так как величина ацетиленредукции у них выше 150 нМ №/мл х ч (таблица).
Антагонистическую способность исследовали методом лунок. В качестве тест-организмов использовали микроскопические грибы: Fusarium oxysporum,
Нитрогеназная активность азотфиксирующих и фосфатмобилизирующих микроорганизмов
Штамм Нитрогеназная активность, нМ №/мл х ч
Azotobacter chroococcum 5 V(e) 1126,5
Pseudomonas brassicacearum 26W(e) 1501,9
Achromobacter xylosoxidans 5F(6) 237,8
Sphingobacterium multivorum 6 F(6) 374,9
Aspergillus sp. и Trichoderma lignorum [16, 18-20]. Выделенные штаммы обладали антагонистической способностью к фитопатогенным грибам, наиболее часто встречающимся в ризосфере сельскохозяйственных культур. Наиболее сильное антагонистическое действие микроорганизмы проявляли по отношению к микромицетам родов Fusarium и Aspergillus. Все изученные штаммы почти не угнетали развития представителей рода Trichoderma.
Наиболее активные по комплексу показателей штаммы идентифицировали методом установления нуклеотидной последовательности 16S рРНК и депонировали в коллекции ФГУП ГосНИИгенетика. Из микроорганизмов были созданы бинарные ассоциации азотфиксирующих (Azotobacter chroococcum 5 У(е), Pseudomonas brassicacearum 26W^)) и фосфат-мобилизующих микроорганизмов (Achromobacter xy-losoxidans 5 F(6), Sphingobacterium multivorum 6 F(6)), и сформирован консорциум из этих штаммов с плотностью бактериальной суспензии - 2,0 х 109 КОЕ/см3.
Использовали следующие пестициды в производственной и полупроизводственной дозах: гербициды Лонтрел-300 Д, водный раствор (действующее вещество - клопиралид; 300 г/л) и Раундап, водный раствор (глифосата кислоты; 360 г/л); инсектициды Актара, водно-диспергируемые гранулы (тиаметок-сам; 250 г/кг) и Фитоверм, концентрат эмульсии -порошок (аверсектин С, 2 г/л); фунгицид Ордан, смачивающийся порошок (хлорокись меди 689 г/кг + цимоксанил 42 г/кг).
Изучение влияния пестицидов на сохранение жизнеспособности и рост микроорганизмов, входящих в консорциумы, проводили по схеме: контроль 1 - консорциум азотфиксирующих микроорганизмов (КАМ); контроль 2 - консорциум фосфатмобилизующих микроорганизмов (КФМ); контроль 3 -консорциум азотфиксирующих и фосфатмобилизу-ющих микроорганизмов (КМ); пестицид (производственная и полупроизводственная дозы) + КАМ, пестицид (производственная и полупроизводственная дозы) + КФМ; пестицид (производственная и полупроизводственная дозы) + КМ. Доза консорциумов в опыте - 10,0% от общего объема. Число жизнеспособных клеток регистрировали на 7 и 14 сутки.
При изучении влияния пестицидов в производственной дозе на всхожесть, энергию прорастания, длину и биомассу проростков в качестве тест-растений применяли: зерновые (яровая пшеница Triticum aestivum L. и просо Panicum miliaceum), крупяные (гречиха Fagopyrum esculentum L.), кормовые (кукуруза Zea mays L.), бобовые (горох Pisum sativum L.) [21].
Эксперименты и измерение всех параметров проводили в трехкратной повторности, статистическую обработку - с помощью электронных таблиц Excel и программы Origin 4.1. Достоверность различий полученных результатов оценивали с использованием коэффициента Стьюдента.
Результаты. При изучении возможности совместного применения бинарных ассоциаций и консорциума микроорганизмов с пестицидами различного назначения установлено, что гербицид Лонтрел не оказывал токсического действия на все изучаемые бактериальные сообщества, он стимулировал рост микроорганизмов (рис. 1). Так, численность диазо-трофов возрастала в 2,4-3,3 раза, фосфатмобилизую-щих и микроорганизмов консорциума - в 1,7 раза.
Гербицид Раундап оказался токсичным ко всем трем изучаемым ассоциациям во всех дозах, в обе точки отбора. Особенно выраженное токсическое действие он оказал на бинарную ассоциацию диазотрофов.
*106 КОЕ/г 600
Сильное токсическое действие на все изучаемые ассоциации микроорганизмов в начале опыта проявил инсектицид Актара (рис. 2). При этом снижение численности азотфиксирующих бактерий составило 2,0-3,2 раза, фосфатмобилизующих - 2,2-5,0 раз, микроорганизмов консорциума - 1,9-10,7 раз. Через две недели токсичность этого инсектицида не только резко снизилась, но и была отмечена стимуляция развития диазотрофов (до 3,0 раз) и микроорганизмов консорциума (в 2,2-2,4 раза). Возможно токсичность пестицида Актара упала на 14 сутки из-за деградации препарата или потере его активности.
500 400 300 200 100 0
контроль
0,5 пр. д.
□ 7 сут □ 14 сут
1 пр. д.
а)
*106 КОЕ/г
160
140 120 100 80 60 40 20 0
—^
—1— —±— —1—,
—ш—
контроль
0,5 пр. д.
□ 7 сут □ 14 сут
1 пр. д.
б)
*106 КОЕ/г
300
250 200 150 100 50 0
контроль
0,5 пр. д.
□ 7 сут □ 14 сут
1 пр. д.
в)
Рис. 1. Влияние гербицида Лонтрел на динамику численности микроорганизмов консорциума: а) бинарной ассоциации диазотрофов; б) бинарной ассоциации фосфатмобилизующих микроорганизмов; в) микроорганизмов консорциума
*106 КОЕ/г 400
350
300
250
200
150
100
50
0
контроль
0,5 пр. д.
□ 7 сут □ 14 сут
1 пр. д.
а)
*106 КОЕ/г 160
140 120 100 80 60 40 20 0
контроль
0,5 пр. д.
1 пр. д.
□ 7 сут □ 14 сут
б)
*106 КОЕ/г 450
400 350 300 250 200 150 100 50 0
контроль
0,5 пр. д.
1 пр. д.
□ 7 сут □ 14 сут
в)
Рис. 2. Влияние инсектицида Актара на динамику численности микроорганизмов консорциума: а) бинарной ассоциации диазотрофов; б) бинарной ассоциации фосфатмобилизую-щих микроорганизмов; в) микроорганизмов консорциума
Инсектицид Фитоверм в обеих исследуемых дозах не оказывал токсического действия только на микроорганизмы консорциума. Диазотрофные и
фосфатмобилизующие бактерии снижали активность роста при контакте с ним, однако, как и в случае с Актарой, спустя 14 суток восстанавливали ее.
%
120 100 80 60 40 20 0
КМ
Актара + КМ
Лонтрел + КМ Фитоверм + КМ
□ Горох □ Пшеница
Рис. 3. Совместное влияние консорциума микроорганизмов и пестицидов на энергию прорастания тест-растений, % к дистиллированной воде
Фунгицид Ордан был токсичен для всех бактериальных сообществ, особенно для фосфатмобилизу-ющей ассоциации. Так, подавление роста этих микроорганизмов составило 17,5-31,4 раз на 7 сутки и 1,4-4,2 раза на 14 сут. Что касается диазотрофов и микроорганизмов консорциума, то в начале опыта этот фунгицид подавлял развитие бактерий (в 2,73,4 раза). Только у бинарной азотфиксирующей ассоциации на 14 сутки отмечен небольшой рост микроорганизмов под действием Ордана.
Таким образом, бинарные ассоциации и консорциум микроорганизмов отличались по чувствительности и способности адаптироваться к разным дозам изучаемых пестицидов. Из всего спектра выделены два - гербицид Лонтрел и инсектицид Актара, которые не подавляли развитие микроорганизмов, входящих и в ассоциации, и в консорциум.
Исследование влияния пестицидов различного назначения в производственной дозе на энергию прорастания и всхожесть тест-растений показало, что наиболее чувствительной культурой была гречиха, особенно при действии на нее инсектицида Актара и фунгицида Ордан. Остальные тест-растения оказались более устойчивыми к действию изучаемых пестицидов.
В публикациях Ч. Болормаа с соавторами [22] и А.З. Миндубаева с соавторами [23] изучение морфологических и биохимических изменений проведено у микроорганизмов, выделенных из различных местообитаний. В процессе их адаптации к присутствию ксенобиотика и формирования новой экологической ниши пять штаммов стрептомицетов сравнивали на предмет антагонистического подавления тест-организмов различной таксономической принадлежности (бактерий, дрожжей, одноклеточных
зеленых водорослей и растений). В наших исследованиях с яровой пшеницей сорта Хаят (представитель однодольных растений) и горохом сорта Тан (представитель двудольных растений) использовали консорциум микроорганизмов как наиболее устойчивый к токсическому действию изучаемых пестицидов (гербицид Лонтрел, инсектициды Актара и Фитоверм).
Установлено, что большую чувствительность к токсическому действию пестицидов, особенно гербицида Лонтрел, проявил горох (снижение энергии прорастания 40,0%). При совместном применении консорциума с пестицидом микроорганизмы оказали положительное влияние на эффективность прорастания семян гороха во всех вариантах, в том числе на фоне Лонтрела - снижение токсичности составило более 20,0%. Сходная тенденция была выявлена и на пшенице, хотя это растение оказалось устойчивее к токсическому действию пестицидов (рис. 3).
Микроорганизмы консорциума оказали положительное влиянй на длину корешка и проростка у гороха, а также на длину проростка у пшеницы только на фоне инсектицида Актара. При этом масса корешка существенно (в 3,0 раза) увеличилась у гороха в варианте с инсектицидом Фитовермом, а у пшеницы - в варианте с Актарой (около 6,0%). Стимулирующий эффект микроорганизмов консорциума на массу проростков тест-растений не выявлен. Следовательно, консорциум микроорганизмов снижает токсичность по отношению к тест-растениям, особенно при совместном действии с гербицидом Лонтрел.
Таким образом, для создания эффективных консорциумов (основы биоудобрения) необходимы
следующие этапы: выделение аборигенных агрономически значимых микроорганизмов и определение их численности; отбор эффективных штаммов; характеристика нитрогеназной активности; изучение антагонистической способности ризосферных микроорганизмов в отношении фитопатогенных микромицетов; влияние микроорганизмов на энергию прорастания, всхожесть семян, морфо- и биометрические параметры проростков. Сформированные из эффективных штаммов бинарные ассоциации и консорциум микроорганизмов отличаются по чувстви-
тельности и способности адаптироваться к дозам пестицидов различного назначения. Из спектра пестицидов выделены два - гербицид Лон-трел и инсектицид Актара, которые не подавляют развитие микроорганизмов, входящих и в ассоциации и в консорциум. Выявлено, что консорциум микроорганизмов снижает токсичность по отношению к тест-растениям, особенно при совместном действии с гербицидом Лонтрел. Только консорциум микроорганизмов, являющийся основой биоудобрения, показывает максимальную устойчивость к действию пестицидов.
Литература
1. Дегтярева И.А., Яппаров А.Х., Давлетшина А.Я., Мотина Т.Ю. Влияние комплексного удобрения на микробиоценоз кукурузы и ее урожайность // Ученые записки КГАВМ, 2015, Том 223, № 3. - С. 61-64.
2. Yuan J.L., Li B., Zhang N., Waseen R., Shen Q., Huang Q. Production of bacillomycin-type antibiotics by Bacillus amyloliquefaciens NJN-6 for suppressing soilborne plant pathogens // J. Agric. Food Chem, 2012, V. 60, № 3. - P. 2976-2981.
3. Wang X., Luo C., Liu Y. Sporulation, competence development and biopesticide activity of a Bacillus subtilis mutant // Acta microbial. sinica, 2009, V. 49, № 10. - P. 1295-1300.
4. Velbo R.V., Medina L.F., Segalin J., Brandelli A. Production of lipopeptides among Bacillus strains showing inhibition of phytopathogenic fungi // Folia Microbiol, 2011, V. 56, № 4. - P. 297-303.
5. Сираева З.Ю. Биопрепарат для стимуляции роста и защиты растений от болезней на основе Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11008: дисс. к.б.н. - Казань, 2012. - 203 с.
6. Zihlmann U., Jossi W., Scherrer C. Integrierter und biologischer Anbau im Vergleich: Resultate aus dem Anbausystemversuch burgrain 1991 bis 2008 // Schweiz. Eidgenossenschaft Eidgenossisches Volkswirtschaftsdep, 2010, № 722. - 16 p.
7. Злотников А.К., Дуринина Е.П., Костина Н.В., Кураков А.В., Янушевская Э.Б., Леонов Н.Н., Подварко А.Т., Злот-ников К.М. Влияние биопрепарата Альбит на микрофлору почв // Защита и карантин растений, 2016, № 5. - С. 24-26.
8. Pacanoski Z. The myth of organic agriculture // Plant Prot. Sc., 2009, V. 45, № 2. - P. 39-48.
9. Todd K.J., Svircev A.M., Goettel M.S., Woo S.G. The use and regulation of microbial pesticides in representative jurisdictions worldwide // IOBC Global, 2010. - 99 p.
10. Дегтярева И.А., Яппаров А.Х., Дмитричева Д.С., Зарипова С.К. Предпосевная обработка семян сельскохозяйственных культур диазотрофными и фосфатмобилизующими микроорганизмами // Вестник Казанского технологического университета, 2012, Том 15, № 7. - С. 133-137.
11. Дегтярева И.А., Яппаров Д.А., Хидиятуллина А.Я., Зарипова С.К. Оценка эффективности жидких форм биопрепаратов // Ученые записки КГАВМ, 2013, Том 215. - С. 96-100.
12. Мотина Т.Ю., Дегтярева И.А., Давлетшина А.Я., Яппаров И.А., Алиев Ш.А., Бабынин Э.В. Биоудобрения комплексного действия на основе консорциума микроорганизмов и наноструктурных агроминералов для получения экологически безопасной продукции растениеводства // Вестник Казанского технологического университета, 2017, Т. 20, № 12. - С. 122-126.
13. Определитель бактерий Берджи: в 2 т. / Под ред. Дж. Хоулта. - М.: Мир, 1997. - 800 с.
14. Колешко О.И. Экология микроорганизмов почвы. Лабораторный практикум - Минск: Высшая школа, 1981. -175 с.
15. Методы почвенной микробиологии и биохимии / Под ред. Д.Г. Звягинцева. - М.: МГУ, 1991. - 304 с.
16. Кураков А.В., Прохоров И.С., Костина Н.В., Махова Е.Г., Садыкова В.С. Стимуляция грибами азотфиксации в дерново-подзолистых почвах // Почвоведение, 2006, № 9. - С. 1075-1081.
17. Дегтярева И.А. Эколого-физиологическая регуляция взаимодействия в агроценозе растений рода Amaranthus L. И диазотрофов: дисс. д.б.н. - М., 2005. - 265 с.
18. Кураков А.В., Прохоров И.С. Грибной гидролиз растительных полимеров и азотфиксация в почвах / материалы IV съезда Докучаевского общества почвоведов. Новосибирск, книга 2. - С. 639.
19. Сэги Й. Методы почвенной микробиологии - М.: Колос, 1983. - 284 с.
20. Головко Е.А., Кострюк Н.Н. Экспериментальная аллелопатия - Киев: Наукова думка, 1987. - 207 с.
21. ISO 11269-2. Soil quality - Determination of the effects of pollutants on soil flora - Part 2: Effects of chemicals on the emergence and growth of higher plants. - 1995.
22. Болормаа Ч., Сапармырадов К.А., Алимова Ф.К., Миндубаев А.З. Сравнение показателей фитотоксичности, фунгицидной и бактерицидной активности стрептомицетов из различных местообитаний // Бутлеровские сообщения, 2014, Т. 38, № 6. - С. 147-152.
23. Миндубаев А.З., Алимова Ф.К., Яхваров Д.Г., Болормаа Ч., Сапармырадов К.А. Сравнение фитотоксичности, фунгицидных и бактерицидных свойств Streptomyces из разных биотопов. Определение видовой принадлежности штамма а8 // Экологический вестник Северного Кавказа, 2015, Т. 11, № 1. - С. 51-58.
