CC BY
53
© Д. И. Соколов, М. В. лесничия, М. И. Мирашвили, т. Ю. львова, О. Н. Аржанова, И. М. Кветной, С. А. Сельков
ГУ НИИ акушерства и гинекологии
им. Д. О. Отта РАМН,
Санкт-Петербург
УДК: 618.3-008.6-07
■ Одним из факторов, ответственных за возникновение гестоза считают нарушение обмена и химическую модификацию липопротеинов низкой (ЛИНИ) и очень низкой (ЛПОНП) плотности, токсически действующих на клетки материнского организма. Целью настоящего исследования явилось изучение интенсивности поглощения липидов эндотелиальными клетками из сыворотки крови здоровых небеременных женщин (n=10), здоровых беременных (n=20) и беременных с гестозом (n=30). Для этого культивировали человеческие эндотелиальные клетки линии EA.Hy926 в присутствии сывороток в течение 24 часов. Затем проводили окрашивание эндотелиальных клеток на предмет выявления внутриклеточных липидов при помощи красителя OIL RED O (ICN, США). Оценку содержания внутриклеточных липидов проводили при помощи компьютерной системы визуализации и программы «Морфология 4.0» (Видеотест, Россия). Интенсивность поглощения липидов эндотелиальными клетками из сыворотки крови, полученной от беременных с гестозом (площадь экспрессии 6,35 ± 0,55 %) была достоверно выше, чем поглощение липидов эндотелиальными клетками из сыворотки крови, полученной от здоровых беременных (площадь экспрессии 2,43 ± 0,28 %, p < 0,01), и здоровых небеременных женщин (2,7 ± 0,49 %, p < 0,01). При изучении липидного спектра сывороток крови (значения атерогенного индекса, концентраций триглицеридов, липопротеинов высокой плотности, ЛПНП, ЛПОНП и холестерина) установлено, что указанные показатели не отличались друг от друга в исследуемых группах. Образование пенистых клеток из эндотелиальных клеток свидетельствует о нарастании эндотелиальной дисфункции при гестозе и вероятно связано с наличием в сыворотках крови модифицированных и окисленных ЛИНИ и ЛПОНП.
Работа поддержана грантами Президента РФ № НШ-1066.2008.7 и МК-1355.2007.7.
■ Ключевые слова: гестоз; эндотелиальные клетки; липопротеины низкой плотности; липопротеины очень низкой плотности.
оценка интенсивности поглощения липидов сыворотки крови беременных эндотелиальными клетками
Введение
Несмотря на снижение в последние годы материнской летальности, регистрируется устойчивая негативная тенденция к увеличению числа неблагоприятных исходов в результате двух осложнений гестации — гестозов и кровотечений при беременности и в родах. Гестоз также является ведущей причиной перинатальной заболеваемости и смертности новорожденных. Гестоз — одно из наиболее тяжелых осложнений беременности, который проявляется полиорганной функциональной недостаточностью, развитием гипертензии и протеинурии приблизительно после 20 недели беременности. Основным проявлением гестоза является нарушение функции эндотелиальных клеток как со стороны материнского организма, так и со стороны плода. В настоящее время существуют различные теории возникновения этого патологического состояния беременных. Среди них выделяют нарушение обмена липопротеинов низкой (ЛПНП) и очень низкой плотности (ЛПОНП) при гестозе, претерпевающих различные химические модификации и токсически действующих на клетки материнского организма.
Значение эндотелиальных клеток в цепи патогенетических событий гестоза трудно переоценить. Именно эндотелий способен на местном уровне секретировать вазоконстрикторы (эндотелин-1, тромбоксан) и вазодилататоры (простациклин и NO) [37], корректируя давление крови в сосудах; эндотелий играет значительную роль в процессах воспаления, активно взаимодействуя с им-мунокомпетентными клетками и обеспечивая их миграцию в очаг воспаления; функциональное состояние эндотелия влияет на проницаемость сосудов. Таким образом, клинические проявления гестоза: гипертензия, отеки, протеинурия, активация цитотоксических лимфоцитов, так или иначе связаны с эндотелиальными клетками.
Одним из факторов, нарушающих функции эндотелиальных клеток, являются химически модифицированные ЛПНП и ЛПОНП, в особенности их окисленные формы. Поглощение ЛПНП и ЛПОНП и их окисленных форм эндотелиальными клетками приводит к их активации, а затем к образованию «пенистых клеток» (foam cells) с последующей полной утратой функций и гибелью [8, 13, 16]. Указанные события происходят при
формировании атеросклеротической бляшки на стенках сосудов при атеросклерозе. Следует отметить, что при гестозе, так же как и при атеросклерозе, в сыворотке крови отмечено увеличение концентраций ЛПНП и ЛПОНП и их окисленных форм [14, 43, 45].
Исходя из вышеизложенных обстоятельств, целью настоящего исследования явилось изучение интенсивности поглощения липидов эндо-телиальными клетками из сыворотки крови, полученных от беременных при физиологически протекающей беременности и при гестозе.
Материалы и методы
Обследовано 60 женщин во время и вне беременности. В первую группу вошли 30 беременных с гестозом различной степени тяжести в III триместре беременности без признаков угрожающего прерывания беременности на момент исследования. Вторую группу составили 20 беременных при сроке 32-39 недель с физиологическим течением беременности. В третью группу включено 10 здоровых небеременных женщин без гиперлипиде-мии и признаков атеросклероза. Диагноз гестоза у женщин первой группы установлен на основании ведущих клинических симптомов различной степени выраженности — наличие протеинурии, отеков, гипертензии (повышение систолического давления от 135 мм рт. ст. и выше, диастолическо-го давления от 85 мм рт. ст. и выше).
Культура клеток. Использовали человеческие эндотелиальные клетки линии EA.Hy926. Культура получена путем гибридизации первичной эндотелиальной линии HUVEC с клетками карциномы легкого A-549 и воспроизводит основные морфологические, фенотипические и функциональные характеристики, присущие эндотелию [7]. Для культивирования использовали среду следующего состава: среда DMEM с добавлением 10 % инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (ICN, США), 50 мкг/мл сульфата гентамицина, 2 мМ L-глютамина, HAT (ICN, США). Клетки линии EA.Hy926 являются монослойной культурой, требующей пересева 1 раз в 3-4 дня. Дезинтеграцию монослоя для пересева вызывали 5-минутной экспозицией в растворе Версена. Накануне опыта производили пересев клеток линии EA.Hy926. Часть полученной клеточной суспензии тщательно ресуспен-дировали в культуральной среде и помещали на стерильное предметное стекло, снабженное 4-луночной камерой с крышкой (BD, США) в концентрации 8 х 105 клеток на лунку в 500 мкл культуральной среды и культивировали во влажной атмосфере с 5 % СО2 при 37 ° С для получения однородного монослоя. На следующий день
в лунки с эндотелиальными клетками вносили 500 мкл сыворотки здоровых небеременных, здоровых беременных или беременных женщин с гестозом. В контрольные лунки вносили 500 мкл эмбриональной телячьей сыворотки. Затем продолжали инкубацию во влажной атмосфере с 5 % СО2 при 37 ° С в течение 24 часов. После инкубации все лунки отмывали трижды нагретым до 37 ° С раствором Хенкса.
Окраска на внутриклеточные липиды. По окончании культивирования клетки фиксировали 10 % раствором формалина при комнатной температуре 10 минут и отмывали дистиллированной водой в течение 15 минут. После этого клетки промывали 70 % изопропанолом («Вектон», Россия) в течение 10 минут. Затем проводили окрашивание клеток 0,25 % раствором OIL RED O (ICN, США) в 70 % изопропаноле в течение 10 минут. По окончании окрашивания проводили промывание клеточных культур дистиллированной водой в течение 10 минут. Затем проводили окрашивание клеточных культур гематоксилином («Вектон», Россия) в течение 5 минут с последующим промыванием дистилированой водой. Полученные таким образом препараты клеточных культур эн-дотелиальных клеток на предметных стеклах фиксировали в глицерин-желатине. Анализ площади экспрессии липидных включений проводили по пяти полям зрения (х 630) при помощи микроскопа Nikon Eclipse-400, компьютерной системы анализа микроскопических изображений и программы «Морфология 4.0». Полученные данные по площади экспрессии липидов в каждом поле зрения делили на количество ядер и умножали на 100. Из полученных значений площади экспрессии липидов в клетках, проинкубированных в присутствии сывороток крови вычитали базовое значение площади экспрессии липидов, полученное для клеток, проинкубированных в обычной среде с добавлением 500 мкл эмбриональной телячьей сыворотки, что в среднем составило 0,68 % от общей площади поля зрения (рис. 1).
Определение липидов в сыворотке крови. С использованием стандартного набора фирмы Dia Sys (Германия) и автоматического биохимического анализатора Alcyon-300 (Abbot , США) в тех же сыворотках определяли концентрацию тригли-церидов, липопротеинов высокой плотности, ли-попротеинов низкой плотности, липопротеинов очень низкой плотности, холестерина, оценивали индекс атерогенности.
Статистический анализ полученных данных проводили при помощи компьютерной программы STATISTICA 6.0. Для анализа данных использовали непараметрический критерий Манна-Уитни.
Рис. 1. Эндотелиальные клетки линии EA.Hy926, проинкубированные в 500 мкл культуральной среды с добавлением 500 мкл эмбриональной телячьей сыворотки. Проведена окраска гематоксилином, а также окраска на внутриклеточные липиды при помощи красителя OIL RED O (ICN, США). Увеличение х 400
Рис. 3. Эндотелиальные клетки линии EA.Hy926, проинкубированные в 500 мкл культуральной среды с добавлением 500 мкл сыворотки крови беременных с гестозом. Проведена окраска гематоксилином, а также окраска на внутриклеточные липиды при помощи красителя OIL RED O (ICN, США). Увеличение х 400
Результаты и обсуждение
Интенсивность поглощения липидов эндо-телиальными клетками из сыворотки крови, полученной от беременных с гестозом (площадь экспрессии 6,35 ± 0,55 %) была достоверно выше (рис. 3), чем поглощение липидов эндотелиальны-ми клетками из сыворотки крови, полученной от беременных с физиологически протекающей беременностью (площадь экспрессии 2,43 ± 0,28 %, p < 0,01) (рис. 2), и здоровых небеременных женщин (2,7 ± 0,49 %, p < 0,01).
Рис. 2. Эндотелиальные клетки линии EA.Hy926, проинкубированные в 500 мкл культуральной среды с добавлением 500 мкл сыворотки крови здоровых беременных без гестоза. Проведена окраска гематоксилином, а также окраска на внутриклеточные липиды при помощи красителя OIL RED O (ICN, США). Увеличение х 400
Многие исследователи отмечают увеличение концентраций ЛПНП и ЛПОНП в сыворотке крови беременных с гестозом [14, 43, 45]. Мы также проводили изучение липидного спектра сывороток беременных. При этом значения атерогенно-го индекса, концентраций триглицеридов, липо-протеинов высокой плотности, липопротеинов низкой плотности, липопротеинов очень низкой плотности, холестерина в сыворотках, полученных от беременных с гестозом, не отличались от таковых в сыворотках, полученных от беременных при физиологически протекающей беременности и здоровых небеременных женщин. Вероятно, такие различия в данных связаны с разной степенью вовлеченности печени в патологический процесс при таком многокомпонентном патологическом процессе как гестоз.
Вместе с тем следует отметить, что мы не определяли содержание модифицированных и окисленных ЛПНП и ЛПОНП в составе липидной фракции сыворотки крови, имеющих патогенетическое значение в индукции эндотелиальной дисфункции [15, 42]. Возможно, что патогенетически наиболее важным является как раз повышенное содержание таких модифицированных липопротеи-нов. В зависимости от степени окисления выделяют минимально окисленные ЛПНП (мокЛПНП) и окЛПНП [28]. При гестозе появление окЛПНП связывают с повышением ЛПНП и ЛПОНП в плазме крови. Однако первоначально окисление ЛП происходит вследствие нарушения антиокислительных механизмов защиты в ткани плаценты при гестозе. При физиологической беременности обнаружена чрезмерная продукция свободных
радикалов кислорода тканью плаценты. Так, в конце первого триместра беременности обнаруживаются высокие локальные концентрации молекулярного кислорода в маточно-плацентарной циркулирующей крови, что связано с низкой активностью антиоксидантных ферментов клеток трофобласта. Повышенное кровоснабжение плаценты на протяжении всей беременности также создает высокие локальные концентрации свободного кислорода в межворсинчатом пространстве [39], что при физиологической беременности сопровождается активацией антиоксидантных механизмов. При этом контролируемый оксида-тивный стресс может играть роль в ремоделиро-вании ткани плаценты и являться необходимым для выполнения функций плаценты. При гестозе наблюдается нарушение инвазии трофобласта и трансформации спиральных артерий [1], приводящее к изменению маточно-плацентарного кровообращения [17] и нарушению адаптивных антиоксидантных механизмов защиты. Плацента при гестозе синтезирует и секретирует провоспа-лительные цитокины, в ней образуются активные формы кислорода. Указанные продукты могут активировать материнские лейкоциты, проходящие вместе с кровотоком через матку [11]. В результате активации лейкоциты также выделяют активные формы кислорода [26], способствующие образованию пероксидов липидов, которые повреждают клеточные мембраны, увеличивая поглощение холестерола, окисленных свободных жирных кислот и ЛПНП [26]. Накопление в сыворотке крови ЛПНП и ЛПОНП в условиях окислительного стресса способствует их окислению.
Окисленные ЛПНП и ЛПОНП поглощаются клетками при помощи скэвенджер-рецепторов (scavenger), при этом мокЛПНП сохраняют способность к интернализации в клетки через липопротеиновые рецепторы (LDLR) [23]. Скэвенджер-рецепторы экспрессированы на макрофагах, тромбоцитах, гладкомышечных клетках [6, 27], эндотелиальных клетках [24, 46].
На эндотелиальных клетках экспрессирова-ны CD36 [46] и LOX-1 [24]. При поглощении окЛПНП увеличивается активность аденилатци-клазы, в результате чего накапливается внутриклеточный мессенджер cAMP [30]. Связывание LOX-1 с окЛПНП индуцирует nuclear factor-кВ (NF-kB) [36]. Эндотелиальные клетки в ходе атерогенеза утрачивают свои антикоагулянтные свойства, приобретая, так называемый, секреторный фенотип: кубовидную форму, большое овальное ядро и повышенное число органелл, участвующих в биосинтезе. Такие клетки активно секретируют простациклин, IL-1, ингибитор-1 активатора плазминогена, но ответ на специфи-
ческие стимулы, приводившие к релаксации (се-ротонин, ацетилхолин), продукция NO и тканевого активатора плазминогена у них снижены [42]. Нерегулируемое поступление атерогенных ЛП на фоне измененной биосинтетической активности ведет к нарушению осмотического состояния эндотелиальных клеток, исчезновению гликокалик-са, повреждению плазматической мембраны [15], гиперплазии базальной полоски и ее отслоению от эндотелия, реорганизации экстрацеллюляр-ного матрикса [42]. При поглощении ЭК минимально модифицированных ЛПНП (ммЛПНП) происходит активация внутриклеточной проте-инкиназы C [4], 12-липоксигеназы, высвобождается внутриклеточный кальций [19]. Окисленные ЛПНП индуцируют экспрессию P-селектина [33] и повышают секрецию эндотелием тромбоксана А2 [35]. Действуя через LOX-1 ммЛПНП подавляют секрецию TGFP эндотелиальными клетками. Необходимо отметить, что TGFP способен подавлять индуцированную окЛПНП адгезию моноцитов [20]. Окисленные ЛПНП стимулируют экспрессию vascular cell adhesion molecule (VCAM)-1 и intercellular adhesion molecule (ICAM-1 [12]. Показано также, что окЛПНП увеличивают индуцированную TNFa экспрессию VCAM-1. При этом максимальная экспрессия VCAM-1 наступает уже через 6 часов, а индукции экспрессии E-селектина не происходит [32]. Следовательно, ЭК, активированные одновременно окЛПНП и TNFa обладают большими адгезивными свойствами для моноцитов, чем при активации указанными агентами по отдельности. Указанные данные, полученные в экспериментах in vitro подтверждаются экспериментами in vivo: атерогенная диета усиливает экспрессию ICAM-1 и VCAM-1 на эндотелии [2, 3]. Показано также, что ммЛПНП могут способствовать адгезии моноцитов альтернативным VCAM-1 способом, а именно за счет connecting segment-1 (CS-1) и а4р1-интегрина, экспрессируемых на поверхности ЭК [31]. Окисленные ЛПНП также опосредуют трансэндотелиальную миграцию моноцитов за счет усиления экспрессии junctional cell adhesion molecule-C (JAM-C) — молекула экспрессирует-ся эндотелиальными клетками в местах стыков клетка-клетка; лигандами для нее на моноцитах служат Mac-1 (CD11b/CD18) and ICAM-1 [47]. С другой стороны, ммЛПНП индуцируют экспрессию эндотелием heme oxygenase-1 (HO-1) [18], которая за счет увеличения концентрации биливердина способна ингибировать трансмиграцию моноцитов, обладает множеством антиатерогенных эффектов и, возможно, обеспечивает защиту эндотелиальных клеток [44]. Помимо индукции адгезионных молекул
Рис. 4. Электронная микрофотография, показывающая пенистые клетки, произошедшие из эндотелиальных клеток на поздней стадии экспериментальной гипер-липидемии (х 11000). На рисунке отмечены эндоте-лиальные клетки (EC), в которых находятся многочисленные липидные включения (ld), некоторые из которых ориентированы в сторону просвета сосуда; мембранные псевдоподии; гипертрофированные ба-зальная пластинка (bl) и внеклеточный матрикс; I — просвет сосуда. Микрофотография перепечатана из статьи Simionescu M., 2004 [40]
мЛПНП индуцируют секрецию эндотелием хе-мокинов и ростовых факторов: CCL2 (MCP-1), M-CSF [29], CXCL8 (IL-8) [38].
Установлено, что эндотелиальные клетки на определенной стадии развития атеросклеро-тического повреждения сосудов, так же как и макрофаги, способны образовывать пенистые клетки (рис. 4), буквально нафаршированные липидными включениями [5, 31, 34]. Более того, произошедшие из эндотелиальных клеток пенистые клетки были получены в системе in vitro при культивировании эндотелия в присутствии сывороток крови больных с гиперхолестерине-мией. В этих условиях в эндотелии быстро накапливались липидные включения, изменялось расположение внутриклеточных актина и вин-кулина, клетки теряли способность к экспрессии ICAM-1 и VCAM-1 [9, 10]. Некоторые исследователи свидетельствуют об индукции апоптоза пенистых клеток, произошедших из эндотели-альных клеток, на поздних стадиях формирования атеросклеротической бляшки [22, 25, 41]. Апоптоз таких пенистых клеток вызывают либо цитокины, локализованные в атероме, либо активированные Т-лимфоциты-киллеры, а также окЛПНП [21, 40].
Необходимо еще раз отметить, что в проведенных нами экспериментах использовались сыворотки беременных с физиологической беременностью или с гестозом, в которых не было обнаружено изменений липидного спектра. Однако при этом сыворотка больных с гестозом приводила к образованию пенистых клеток из эндотелиальных клеток. Вероятно, образование пенистых клеток из эндотелиальных клеток, прокультивированных в присутствии сывороток
беременных с гестозом, можно объяснить повышенным содержанием в этих сыворотках модифицированных и окисленных ЛПНП и ЛПОНП. Модифицированные липопротеины могут образовываться в результате окислительного стресса при гестозе. Поскольку уровень липидных пероксидов увеличивается при нормальной беременности по сравнению с небеременными, очевидно, что даже нормальная беременность индуцирует некоторую степень оксидативного стресса. Увеличение количества окисленных и модифицированных липопротеинов при гесто-зе коррелирует с повышением артериального давления. Повреждения децидуальных сосудов при гестозе напоминают атеросклеротические поражения, так как в обоих случаях отмечается фибриноидный некроз сосудистой стенки и накопления загруженных липидами пенистых клеток. Кроме того, окЛПНП способствуют повышенному тромбообразованию, увеличивая содержание тромбина и секрецию эндоте-лиальными клетками ингибитора активатора плазминогена 1 (РА1-1), уменьшая содержание антитромбина и секрецию эндотелиальными клетками тканевого активатора плазминогена ^РА). Избыток модифицированных и окисленных ЛПНП в конечном итоге приводит к апоптозу эндотелиальных клеток. С другой стороны, образование пенистых клеток из эн-дотелиальных клеток, прокультивированных в присутствии сывороток беременных с гестозом, можно объяснить также наличием в этих сыворотках факторов, инициирующих поглощение не только модифицированных липопротеинов, но также и нативных липопротеинов. К таким факторам, возможно, относятся провоспалительные цитокины, которые могут секретироваться активированными лейкоцитами, обнаруженными в кровотоке при гестозе. Кроме того, дисфункция эндотелия сопровождается продукцией таких цитокинов, как ^-6, ^-1, ^-8, способных ауто-кринно усиливать активацию клеток. При этом возможно усиление экспрессии эндотелием не только скэвенджер-рецепторов, но и экспрессии LDL-рецепторов, ответственных за связывание нативных липопротеинов, что также может усилить поглощение клетками липидов.
Полученные нами данные свидетельствуют о незначительной информативности оценки только лишь липидного спектра сыворотки крови у беременных женщин. Даже при отсутствии изменений липидного спектра сыворотка крови способна инициировать дисфункцию эндотелиальных клеток и накопление этими клетками липидов. Предложенный нами функциональный тест оценки способности эндотелиальных клеток образо-
вывать пенистые клетки в присутствии сыворотки крови, наряду с оценкой липидного спектра сыворотки крови, может использоваться в акушерской практике с целью раннего прогнозирования развития гестоза у беременных женщин. Кроме того, предложенный нами функциональный тест также может быть использован для мониторинга течения таких заболеваний, как атеросклероз, сердечно-сосудистая недостаточность, ишемиче-ская болезнь сердца. В мире для экспериментов на эндотелиальных клетках используется в основном эндотелий вены пупочного канатика, который достаточно трудно выделить собственными силами. Поэтому разработанный нами тест является наиболее доступным для его проведения в клинических лабораториях, оснащенных оборудованием для культивирования клеток, что связано с использованием нами стандартной перевиваемой линии EA.Hy926 человеческих эндотелиальных клеток.
Работа поддержана грантами Президента РФ № НШ-1066.2008.7 и МК-1355.2007.7.
литература
1. A study of placental bed spiral arteries and trophoblast invasion in normal and severe pre-eclamptic pregnancies / Meekins J. W. [et al.] // Br. J. Obstet. Gynaecol. — 1994. — Vol. 101. — P. 669-674.
2. An animal model to study local oxidation of LDL and its biological effects in the arterial wall / Calara F. [et al.] // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. — 1998. — Vol. 18. — P. 884-893.
3. An atherogenic diet rapidly induces VCAM-1, a cytokine-regulatable mononuclear leukocyte adhesion molecule, in rabbit aortic endothelium / Li H. [et al.] // Arterioscler. Thromb. — 1993. — Vol. 13. — P. 197-204.
4. Apolipoprotein CIII induces expression of vascular cell adhesion molecule-1 in vascular endothelial cells and increases adhesion of monocytic cells / Kawakami A. [et al.] // Circulation. — 2006. — Vol. 114. — P. 681-687.
5. Cellular events in the development of the valvular atherosclerotic lesions induced by experimental atherosclerosis / Filip D. A. [et al.] // Atherosclerosis. — 1987. — Vol. 67. — P. 199-214.
6. Chylomicron metabolism. Chylomicron uptake by bone marrow in different animal species / Hussian M. M. [et al.] // J. Biol. Chem. — 1989. — Vol. 264. — P. 9571-9582.
7. Edgell C. J., McDonald C. C., Graham J. B. Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1983. — Vol. 80, N 12. — P. 3734-3737.
8. Endothelial cell response to hyperlipemia: Activation-dysfunction-injury, the protective role of simvastatin / Simionescu M. [et al.] // Vasc. Pharm. — 2002. — Vol. 38, N 5. — P. 275-282.
9. Endothelial cell-derived foam cells fail to express adhesion molecules (ICAM-1 and VCAM-1) for monocytes /
Constantinescu E. [et al.] // J. Submicrosc. Cytol. Pathol. — 2000. — Vol. 32. — P. 195-201.
10. Exposure to hypercholesterolemic serum modifies the expression of cytoskeletal proteins in cultured endothelia / Constantinescu E. [et al.] // J Submicrosc Cytol. Pathol. — 1997. — Vol. 29. — P. 543-551.
11. Expression of intercellular adhesion molecule-1 on the surface of peripheral blood and decidual lymphocytes of women with pregnancy-induced hypertension / Wilczynski J. R. [et al.] // Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. — 2002. — Vol. 102. — P. 15-20.
12. Fluid flow inhibits endothelial adhesiveness. Nitric oxide and transcriptional regulation of VCAM-1 / Tsao P. S.[et al.] // Circulation. — 1996. — Vol. 94. — P. 1682-1689.
13. Goligorsky M. S. Endothelial cell dysfunction: can't live with it, how to live without it // Am. J. Physiol. Renal. Physiol. — 2005. — Vol. 288. — P. F871-F880.
14. Goode G. K., Miller J. P., Heagerty A. M. Hyperlipidaemia, hypertension, and coronary heart disease // Lancet. — 1995. — Vol. 345. — P. 362-364.
15. Gorog P., Pearson J. D., Kakkar V. V. Generation of reactive oxygen metabolites by phagocytosing endothelial cells // Atherosclerosis. — 1988. — Vol. 72. — P. 19-27.
16. HajjarD. P., HaberlandM. E. Lipoprotein Trafficking in Vascular Cells. Molecular trojan horses and cellular saboteurs // J. Biol. Chem. — 1997. — Vol. 272. — P. 22975-22978.
17. Hung T. H., Skepper J. N., Burton G. In vitro ischemia-reperfusion injury in term human placenta as a model for oxidative stress in pathological pregnancies // Am. J. Pathol. — 2001. — Vol. 159. — P. 1031-1043.
18. Induction of heme oxygenase-1 inhibits the monocyte transmigration induced by mildly oxidized LDL / Ishikawa K. [et al.] // J. Clin. Invest. — 1997. — Vol. 100. — P. 1209-1216.
19. Induction of monocyte binding to endothelial cells by mm-LDL: role of lipoxygenase metabolites / Honda H. M. [et al.] // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. — 1999. — Vol. 19. — P. 680-686.
20. Induction of P-selectin by oxidized lipoproteins. Separate effects on synthesis and surface expression / Vora D. K. [et al.] // Circ. Res. — 1997. — Vol. 80. — P. 810-818.
21. Inflammatory cytokines and oxidized low density lipoproteins increase endothelial cell expression of membrane type 1-matrix metalloproteinase / Rajavashisth T. B. [et al.] // J. Biol. Chem. — 1999. — Vol. 274. — P. 11924-11929.
22. Kockx M. M., Herman A. G. Apoptosis in atherosclerosis: beneficial or detrimental? // Cardiovasc. Res. — 2000. — Vol.45. — P. 736-746.
23. LDL size, total antioxidant status and oxidised LDL in normal human pregnancy: a longitudinal study / Belo L. [et al.] // Atherosclerosis. — 2004. — Vol. 177, N 2. — P. 391-399.
24. Li D, Mehta J. L. Antisense to LOX-1 inhibits oxidized LDL-mediated upregulation of monocyte chemoattractant protein-1 and monocyte adhesion to human coronary artery endothelial cells // Circulation. — 2000. — Vol. 101. — P. 2889-2895.
25. Libby P. The molecular bases of the acute coronary syndromes // Circulation. — 1995. — Vol. 91. — P. 2844-2850.
26. Lipid peroxidation in pregnancy: New perspectives on preeclampsia / Hubel C. A. [et al.] // Am. J. Obstet. Gynecol. — 1989. — Vol. 161. — P. 1025-1034.
27. Lipoprotein subfraction concentrations in preeclampsia: pathogenic parallels to atherosclerosis / Sattar N. [et al.] / Obstet. Gynecol. — 1997. — Vol. 89, N 3. — P. 403-408.
28. Low-density lipoprotein particle size decreases during normal pregnancy in association with triglyceride increases / Hubel C. A. [et al.] // J. Soc. Gynecol. Investig. — 1998. — Vol. 5, N 5. — P.244-250.
29. Minimally modified low density lipoprotein induces monocyte chemotactic protein 1 in human endothelial cells and smooth muscle cells / Cushing S. D. [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. — 1990. — Vol. 87. — P. 5134-5138.
30. Minimally modified low density lipoprotein-induced inflammatory responses in endothelial cells are mediated by cyclic adenosine monophosphate / Parhami F. [et al.] // J. Clin. Invest. — 1993. — Vol. 92. — P. 471-478.
31. Minimally modified low-density lipoprotein induces monocyte adhesion to endothelial connecting segment-1 by activating-1 integrin / Shih P. T. [et al.] // J. Clin. Invest. — 1999. — Vol. 103. — P. 613-625.
32. Modified low density lipoprotein and its constituents augment cytokine-activated vascular cell adhesion molecule-1 gene expression in human vascular endothelial cells / Khan B. V. [et al.] // J. Clin. Invest. — 1995. — Vol. 95. — P. 1262-1270.
33. Oxidized low-density lipoprotein induces the expression of P-selectin (GMP140 / PADGEM / CD62) on human endothelial cells / Gebuhrer V. [et al.] // Biochem. J. — 1995. — Vol. 306, pt. 1. — P. 293-298.
34. Pathobiochemistry of combined diabetes and atherosclerosis studiedonanovelanimalmodel.Thehyperlipemichyperglicemic hamster / Simionescu M. [et al.] // Am. J. Pathol. — 1996. — Vol. 148. — P. 997-1014.
35. Preeclampsia and antioxidant nutrients: decreased plasma levels of reduced ascorbic acid, alpha-tocopherol, and beta-carotene in women with preeclampsia / Mikhail M. S. [et al.] // Am. J. Obstet. Gynecol. — 1994. — Vol. 171. — P. 150-157.
36. Rajavashisth T. B., Yamada H., Mishra N. K. Transcriptional activation of the macrophage-colony stimulating factor gene by minimally modified LDL: Involvement of nuclear factor-kB // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. — 1995. — Vol. 15. — P. 1591-1598.
37. Roberts J. M., Redman C. W. Pre-eclampsia: More than pregnancy induced hypertension // Lancet. — 1993. — Vol. 341. — P. 1447-1451.
38. Role for peroxisome proliferator-activated receptor in oxidized phospholipidinduced synthesis of monocyte chemotactic protein-1 and interleukin-8 by endothelial cells / Lee H. [et al.] // Circ. Res. — 2000. — Vol. 87. — P. 516-521.
39. Secretion of tumor necrosis factor-alpha from human placental tissues induced by hypoxia-reoxygenation causes endothelial activation in vitro: a potential mediator of the inflammatory response in preeclampsia / Hung T. H. [et al.] //
Am. J. Pathol. — 2004. — Vol. 164. — P. 1049-1061.
40. Severity of oxidative stress generates different mechanisms of endothelial cell death / Burlacu A. [et al.] // Cell Tissue Res. — 2001. — Vol. 306. — P. 409-416.
41. Simionescu M. Endothelial cell — a key player in all stages of atherosclerosis // Cellular Dysfunction in Atherosclerosis and Diabetes — Reports from Bench to Bedside / eds. Simionescu M., Sima A., Popov D. — Bucharest: Romanian Academy Publishing House,2004. — P. 73-96.
42. Simionescu M., Simionescu N. Proatherosclerotic events: pathobiochemical changes occurring in the arterial wall before monocyte migration // FASEB J. — 1993. — Vol. 7. — P. 1359-1366.
43. Small low-density lipoproteins and vascular cell adhesion molecule-1 are increased in association with hyperlipidemia in preeclampsia / Hubel C.A. [et al.] // Metabolism. — 1998. — Vol. 47, N 10. — P. 1281-1288.
44. Stocker R., Perrella M. A. Heme oxygenase-1: a novel drug target for atherosclerotic diseases? // Circulation. — 2006. — Vol. 114. — P.2178-2189.
45. The imbalance between thromboxane and prostacyclin in preeclampsia is associated with an imbalance between lipid peroxides and vitamin E in maternal blood / Wang Y. P. [et al.] // Am. J. Obstet. Gynecol. — 1991. — Vol.165. — P.1695-1700.
46. The pivotal role of scavenger receptor CD36 and phagocyte-derived oxidants in oxidized low density lipoprotein-induced adhesion to endothelial cells / Kopprasch S. [et al.] // Int. J. Biochem. Cell Biol. — 2004. — Vol. 36. — P. 460-471.
47. The role of junctional adhesion molecule-c (JAM-C) in oxidized LDL-mediated leukocyte recruitment / Keiper T. [et al.] // Faseb J. — 2005. — Vol. 19. — P. 2078-2080.
Статья представлена А. В. Арутюняном, ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта,
Санкт-Петербург
EVALUATION OF LIPIDS ABSORPTION BY ENDOTHELIAL CELLS FROM BLOOD SERUM OF PREGNANT WOMEN
Sokolov D. I., Lesnichija M. V., Mirashvili M. I., Lvova T.J., Arzhanova O. N., Kvetnoj I. M., Selkov S. A.
■ Summary: the purpose of the present research was to study intensity of absorption of lipids by endothelial cells from blood serum of healthy nonpregnant women (n = 10), healthy pregnant women (n=20) and pregnant women with an eclampsia (n = 30). We cultivated human endothelial cell line EA.Hy926 in the presence of serums in flow of 24 hours. Then endothelial cells dyed OIL RED O (ICN, the USA) for revealing of intracellular lipids. An evaluation of the maintenance of intracellular lipids lead by means of computer system of visualisation and the program Morphology 4.0 (the Video test, Russia). Intensity of lipids absorption by endothelial cells from the blood serum received from pregnant women with an eclampsia (the expression area 6,35 ± 0,55 %) was above, than lipids absorption
by endothelial cells from the blood serum received from healthy pregnant women (the expression area 2,43 ± 0,28 %, p < 0,01), and healthy nonpregnant women (2,7 ± 0,49 %, p < 0,01). At studying of a lipide spectrum of blood sera (value of an atherogenous index, concentrations of triglycerides, HDL, LDL, VLDL and cholesterol) it is established that the specified indicators did not differ from each other in investigated bunches. Formation of foam cells from endothelial cells testifies to increase of endothelial dysfunction at an eclampsia and is possibly bound to presence in blood sera modified and oxidised LDL and VLDL.
Work is sustained by grants of the President of the Russian Federation № Hm-1066.2008.7 and MK-1355.2007.7.
■ Key words: eclampsia; endothelial cells; LDL; VLDL.
■ Адреса авторов для переписки -
Соколов Дмитрий Игоревич — к. б. н., с. н. с.
ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта РАМН,
199034, Россия, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3.
E-mail: corbie@hotmail.ru
Лесничия Марианна Валерьевна — аспирант.
ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта РАМН,
199034, Россия, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3.
E-mail: corbie@hotmail.ru
Мирашвили Марина Ивановна — студент.
ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта РАМН,
199034, Россия, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3.
E-mail: corbie@hotmail.ru
Львова Т. Ю. —
ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта РАМН, 199034, Россия, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3. E-mail: corbie@hotmail.ru
Аржанова Ольга Николаевна — д. м. н., профессор. ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта РАМН, 199034, Россия, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3. E-mail: corbie@hotmail.ru
Кветной Игорь Моисеевич — д. м. н., зав. лаборатории патоморфоло-гии, профессор.
ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта РАМН, 199034, Россия, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3. E-mail: kvetnoy48@mail.ru
Сельков Сергей Алексеевич — д. м. н., зав. лаборатории иммунологии, профессор.
ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта РАМН, 199034, Россия, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3. E-mail: corbie@hotmail.ru
Sokolov Dmitriy Igorevich — PhD, scientific resecher. D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology. 199034 Russia, St. Petersburg, Mendeleyevskaya Line, 3. E-mail: corbie@hotmail.ru
Lesnichiya Marianna Valerievna — post-graduate student. D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology. 199034 Russia, St. Petersburg, Mendeleyevskaya Line, 3. E-mail: corbie@hotmail.ru Mirashvili Marina Ivanovna — student. D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology. 199034 Russia, St. Petersburg, Mendeleyevskaya Line, 3. E-mail: corbie@hotmail.ru Lvova T. Yu. —
D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology.
199034 Russia, St. Petersburg, Mendeleyevskaya Line, 3.
E-mail: corbie@hotmail.ru
Arzhanova Olga Nikolaevna — MD, professor.
D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology.
199034 Russia, St. Petersburg, Mendeleyevskaya Line, 3.
E-mail: corbie@hotmail.ru
Kvetnoy Igor Moiseevich — MD, professor, laboratory of pathomorphology.
D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology. 199034 Russia, St. Petersburg, Mendeleyevskaya Line, 3. E-mail: corbie@hotmail.ru
Selkov Sergey Alekseevich — MD, professor, laboratory of immunology.
D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology. 199034 Russia, St. Petersburg, Mendeleyevskaya Line, 3. E-mail: corbie@hotmail.ru
