CC BY
50
ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ. БИОТЕХНОЛОГИИ
УДК: 577.21:579.834.114:616.98-07
B.C. Караваев, И.Д. Иванов, А.В. Рябченко
ОЦЕНКА ИММУНОРЕАКТИВНОСТИ
РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ OspC И ФРАГМЕНТА FlaB (f-FlaB) BORRELIA GARINIINT29 В ЭКСПЕРИМЕНТАХ С СЫВОРОТКАМИ БОЛЬНЫХ ЛАЙМ-БОРРЕЛИОЗОМ
ГУ НИИ биохимии СО РАМН, Новосибирск
Выявление специфических антител к возбудителю Лайм-боррелиоза в сыворотках крови пациентов крайне важно для подтверждения диагноза Лайм-боррелиоза (ЛБ). В настоящей работе представлены результаты оценки иммунореактивности рекомбинантных белков OspC и фрагмента FlaB (f-FlaB) западносибирских изолятов Borrelia garinii NT29 с сыворотками больных ЛБ. При использовании в ИФА антигена на основе комбинации рекомбинантных белков OspC и f-FlaB показатель выявляемое™ специфических суммарных антител (IgM и IgG) к этим белкам в образцах сывороток больных ЛБ составил 79.2%. Полученные результаты позволяют рассматривать рекомбинантные белки OspC и f-FlaB, как перспективные компоненты для конструирования на их основе и дальнейшего совершенствования иммуно-ферментных тест-систем серодиагностики ЛБ..
Ключевые слова: экспрессия гена, рекомбинантный антиген, FlaB, OspC, Borrelia burgdorferi s.L, Лайм-боррелиоз, иммуноферментный анализ, серодиагностика
Введение
Лайм-боррелиоз (болезнь Лайма, иксодовый клещевой боррелиоз) является самой распространенной зоонозной природноочаговой инфекцией. Возбудителями болезни являются спирохеты Borrelia burgdorferi sensu lato (s.L), которые передаются иксодовыми клещами. В настоящее время выделено 11 геномных групп, относящихся к комплексу В. burgdorferi s.L, которые неравномерно распределены по земному шару. В России обнаружены геновиды В. garinii, В. garinii (тип NT28), В. afzelii, В. burgdorferi sensu stricto и В. lusitaniae [1 — 3]. На территории Западной Сибири распространены преимущественно боррелии геновида В. garinii NT29 и 20047 и реже В. afzelii [4], которые являются патогенными для человека [5].
По данным Министерства здравоохранения РФ, средний показатель заболеваемости Лайм-боррелиозом (ЛБ) в России в 2004 году составил 4,4 случаев на 100000 тыс. жителей. Однако, по оценкам специалистов, фактическая заболеваемость выше, так как достоверно диагностируется лишь эритематозная форма ЛБ при наличие типичной мигрирующей эритемы в месте укуса клеща. Безэритематозные формы Л Б ввиду разнообразия проявлений симптомов сходных с другими заболеваниями, а также хронические стадии ЛБ практически не диагностируются. В первую оче-
редь это связано с отсутствием в стране доступных и надежных тест-систем для диагностики ЛБ.
По литературным данным, за рубежом для диагностики Л Б применяют иммуноферментные тест-системы на основе различных комбинаций высокоспецифичных иммунодоминантных белков В. burgdorferi s.L или их полипептидных фрагментов, не содержащих участков аминокислотной цепи, гомологичных антигенным детерминантам других микроорганизмов. В России лабораторная диагностика ЛБ с помощью иммуноферментного анализа пока не нашла широкого применения из-за отсутствия отечественных коммерческих им-муноферментных тест-систем на ЛБ. Импортные иммуноферментные тест-системы применительно к диагностики ЛБ в нашей стране имеют низкую чувствительность, так как не содержат в наборе антигены, характерные для боррелий, распространенных на территории России.
В задачу наших исследований входило изучение иммунореактивности рекомбинантных белков OspC и фрагмента FlaB (f-FlaB) западносибирских изолятов В. garinii и оценка возможности их использования при конструировании иммуно-ферментной тест-системы для диагностики ЛБ.
Материалы и методы
Материалы. В качестве антигена для постановки иммуноферментного анализа использова-
БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, №5 (127), 2007 г.
53
ли рекомбинантный белок OspC и f-FlaB В. garinii с кажущимися молекулярными массами 20 кДа и 27 кДа соответственно. Источником генов, кодирующих эти белки, служил западносибирский изолят В. garinii NT 29. Ранее нами был получен рекомбинантный клон F-7 Е. coli С-600, продуцирующий фрагмент флагеллярного белка (f-FlaB) Borrelia garinii NT29 [6], и клон С-12, продуцирующий полноразмерный полипептид-предшественник OspC. Нуклеотидная последовательность клонированного фрагмента гена fla В была идентична соответствующему участку с 292 по 801 нуклеотидный остаток гена Да В (GenBank, accession number Fla-X75203), кодирующему внутреннюю часть флагеллярного белка с 98 по 267 а.о., специфичную для спирохет В. burgdorferi s.l. Полноразмерный полипептид-предшественник FlaB состоит из 337 а.о. Структура клонированного нами гена OspC представлена в базе данных GenBank (accession number AY491409). Оба рекомбинантных белка получали из биомасс соответствующих штаммов Е. coli, наработанных в
0,8-1 л культуры. Белки из лизатов клеток очищали аффинной хроматографией на колонке с NTA-сефарозой 6В-С1 в соответствии с руководством фирмы-производителя сорбента. Количество белка определяли методом Лоури, используя для построения калибровочной кривой бычий сывороточный альбумин и IgG собаки.
Для оценки иммунореактивности рекомбинантных белков OspC и f-FlaB использовали 48 образцов сыворотки крови больных Л Б на разных стадиях заболевания, 30 образцов сыворотки крови здоровых доноров и 18 образцов сыворотки крови больных сифилисом. Забор сывороток проводился в период со 2-й по 6-ю неделю после начала заболевания. Диагноз ЛБ у всех больных был установлен на основе анамнеза (укус клеща), данных клинического обследования, а также лабораторно подтвержден в реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) с корпускулярным антигеном В. burgdorferi 1р21, производства НИИ эпидемиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. Контрольные отрицательные сыворотки (сыворотки доноров и больных сифилисом) были отрицательными при исследовании в реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) с корпускулярным антигеном В. burgdorferi 1р21).
В работе использовали коньюгат антител кролика против IgM и IgG человека с титром 1:1000.
Методы. Иммуноферментный анализ. Для оценки иммунореактивности рекомбинантных белков OspC и f-FlaB была использована схема твердофазного иммуноферментного анализа. Полученный, как описано выше, антиген разводили в карбонатно-бикарбонатном буфере (pH 9,6)
до рабочей концентрации, вносили в лунки план шета по 100 мкл и оставляли для сорбции пр! +4 °С на 15-18 часов. После завершения сорбцга планшет с иммобилизованным антигеном про мывали дважды карбонатно-бикарбонатным бу ферным раствором с 0,05% Твином-20, при этом I каждую лунку планшета вносили объем раствор; не менее 250 мкл. По окончании промывки остат ки жидкости удаляли, во все лунки планшета вносили по 90 мкл блокирующего раствора, а затем пс 10 мкл исследуемых сывороток. Планшет закрывали крышкой и инкубировали 30 мин при температуре 37 °С. В качестве блокирующего раствор; использовали глициновый буфер (ГСБ) с добавлением лизата клеток Е. соН. После окончания инкубации планшет промывали не менее 6 раз моющим раствором и в каждую лунку вносили 100 мкл конъюгата в рабочем разведении. Планшет инкубировали 30 мин при температуре 37 °С. По окончании инкубации планшет промывали моющим раствором не менее 6 раз, удаляли остатки влаги из планшета и в каждую лунку планшета вносили по 100 мкл субстрата для пероксидазы. Субстрат готовили непосредственно перед использованием. Таблетку ОФД растворяли в цитратно-фос-фатном буфере (1 мг о-фенилендиамина на 2 мл). После добавления субстрата планшет помещали в защищенное от света место и выдерживали 20 мин при температуре 20-25 °С. Реакцию останавливали внесением стоп-реагента (раствор 2М Н2Б04) по 50 мкл в каждую лунку планшета и определяли оптическую плотность окрашенного продукта ферментативной реакции (ОП) на вертикальном фотометре при длине волны 492 нм.
Для подсчета критической оптической плотности (ОП крит.) использовали 70 отрицательных образцов сывороток здоровых доноров. ОП крит. принимали равной сумме ОП для группы здоровых доноров и 2 стандартных отклонений, что соответствовало верхней границе 95% доверительного интервала для возможных значений показателя. Исходя из критических величин ОП с каждым из антигенов производили анализ результатов тестирования исследуемых сывороток. Образцы признавали позитивными при превышении ОП крит. и отрицательными при значении, меньшем или равном ОП крит.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием общеупотребительных методов параметрической и непараметрической статистики. Для оценки межгрупповых различий применялся ^критерий Стьюдента. Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы (об отсутствии значимых различий или факторных влияний) принимали равным 0,05.
Концентрацию рекомбинантных белков OspC и f-FlaB для сорбции на полистироловый носитель определяли по результатам тестирования сывороток крови больных Л Б (положительный контроль Р) (п=16) и сывороток здоровых доноров (отрицательный контроль N) (п=16). За оптимальную концентрацию для каждого антигена принимали такую, при которой наблюдалось наибольшее различие в показателях оптической плотности положительного и отрицательного контролей, что соответствовало наибольшему значению их отношения (P/N). Параметр Р определяли как среднее арифметическое для положительных сывороток, а значение N как среднее арифметическое для отрицательных сывороток.
Результаты и обсуждение
Одной из задач настоящего исследования было изучение иммунореактивности рекомбинантных белков OspC и фрагмента FlaB (f-FlaB) западносибирских изолятов В. garinii в экспериментах с сыворотками больных ЛБ. Белки именно этого геновида возбудителей Л Б были получены и взяты в исследование не случайно. По данным трехлетнего мониторинга зараженности клещей Ixodes persulcatus, проводившегося нами на территории лесопарковой зоны новосибирского Академгородка, преобладающая часть популяции клещей (70-75%) была инфицирована спирохетами В. garinii [7]. Это свидетельствует о наибольшей вероятности заражения людей возбудителем ЛБ данного геновида. Кроме того, известно, что белки OspC и FlaB вызывают появление специфичных антител в организме больных ЛБ в течение первого месяца с момента заражения [8] и присутствуют во всех без исключения патогенных штаммах В. burgdorferi s.L, являясь важными маркерами ранней стадии заболевания Л Б [9].
Fla первом этапом антигенные свойства рекомбинантных белков OspC и f-FlaB исследовали с помощью вестерн-блот анализа с сыворотками больных ЛБ, сифилисом и сыворотками здоровых доноров. В качестве отрицательного контроля использовали лизаты клеток Е. coli BL21, несущих вектор без вставки генов ospC и f-FlaB. Для снижения фона, создаваемого связыванием иммуног-
лобулинов сывороток с белками Е. соИ ВЬ21, перед внесением исследуемой сыворотки, ее инкубировали с экстрактом белков Е. соИ ВЬ21 в течение 10 минут. Вестерн-блот анализ продемонстрировал высокую специфичность связывания антител сывороток больных ЛБ с рекомбинантным белком ОэрС. В аналогичном эксперименте рекомбинантные белки №1аВ также специфически связывали антитела сывороток больных ЛБ, но не реагировали с антителами сывороток здоровых лиц.
Полученные результаты позволили приступить к решению основной задачи данного исследования — оценке иммунореактивности рекомбинантных белков ОврС и №1аВ в отношении сывороток больных Л Б методом твердофазного иммуноферментного анализа. На первом этапе работы при исследовании сывороток здоровых доноров на наличие специфических суммарных антител (^М и ^О) к возбудителю ЛБ для каждого исследуемого антигена была предварительно определена критическая оптическая плотность (ОП крит.). Кроме того, с использованием экспериментальной панели положительных и отрицательных сывороток определены средние значения оптической плотности и отношения средних арифметических ОП положительных и отрицательных сывороток. Показано, что антиген ОэрС имеет более высокий показатель отношения оптических плотностей положительного и отрицательного контролей, а значит и более большую чувствительность.
В таблице 1 приведены результаты, полученные при исследовании способности рекомбиран-тных белков ОэрС и ^Р1аВ специфически взаимодействовать с антителами сывороток крови больных Л Б, здоровых доноров, и больных сифилисом. При тестировании в ИФА 48 сывороток больных ЛБ на наличие специфических суммарных антител (^М и 1^0) к антигену ОзрС и ^Р1аВ 34 (70,8%) сывороток специфически взаимодействовали с антигеном ^Р1аВ. Причем, из 32 (66,7%) положительных сывороток с антигеном ОэрС, 26 (54.2%) сывороток также реагировали и с антигеном ^Р1аВ. При использовании в ИФА в
Таблица 1
Количество положительных результатов при исследовании рекомбинантных антигенов ОврС и/-Р1аВ с сыворотками человека в ИФА
Исследуемые группы Количество образцов сывороток Количество сывороток положительных к антигену:
OspC f-FlaB OspC и f-FlaB Комбинация OspC + f-FlaB
Больные ЛБ 48 32 (66.7) 34 (70.8) 26 (54.2) 38 (79.2)
Здоровые доноры 30 0 0 0 0
Больные сифилисом 18 0 2 0 3
Примечание. В скобках — проценты
качестве антигена комбинации рекомбинантных белков OspC и f-FlaB специфические суммарные антитела (IgM и IgG) к этим белкам выявлены в 38 (79.2%) образцах сывороток крови больных ЛБ.
Уровень специфичности антигенов OspC и f-FlaB оценивали по результатам тестирования контрольных отрицательных сывороток (30 образцов сывороток здоровых доноров и 18 сывороток больных сифилисом). По результатам тестирования в ИФА контрольных отрицательных сывороток наилучшие показатели специфичности получены с антигеном OspC. Все контрольные отрицательные сыворотки были отрицательными с антигеном OspC. Аналогичные исследования, проведенные с антигеном f-FlaB показали, что антитела двух (95,8%) сывороток крови больных сифилисом реагировали с антигеном f-FlaB. Следует отметить, что показатель специфичности с использованием в ИФА в качестве антигена композиции двух рекомбинантных белков OspC и f-FlaB был ниже и составил 93,8%. Некоторое снижение показателя специфичности по сравнению с вариантами ИФА, в которых используется каждый из этих антигенов в отдельности, объясняется суммированием неспецифических реакций.
Результаты изучения иммунореактивности рекомбинантных антигенов OspC и f-FlaB с образцам сывороток от больных ЛБ показали, что в ИФА обнаружена несколько меньшая антигенная активность, но более высокая специфичность у антигена OspC. Снижение антигенной активности в случае использования антигена OspC объясняется тем, что наряду с линейными эпитопами в белке имеются и конформационные антигенные детерминанты [10], пространственная структура которых нарушается в процессе иммобилизации белка антигена на полистироловый носитель. Кроме того, высоковариабельные белки антигены OspC некоторой части спирохет В. burgdorferi s.L, встречающихся на территории Сибири, могут иметь неполный антигенный перекрест с рекомбинантным белком OspC, используемым нами в анализе. Более низкую специфичность антигена f-FlaB можно объяснить наличием антигенного перекреста между флагеллярными белками у В. burgdorferi и Trepanema pallidum, что подтверждается данными по изучению генома этих спирохет [И].
Таким образом, относительно высокие показатели антигенной активности рекомбинантных белков OspC и f-FlaB западносибирских изолятов В. garinii в экспериментах с сыворотками больных Л Б позволяют рассматривать эти белки как перспективные компоненты при конструировании высокочувствительных иммуноферментных тест-систем для серодиагностики ЛБ.
ESTIMATION OF IMMUNOREACTIVITY OF RECOMBINANT PROTEINS OspC AND FRAGMENT OF FlaB (f-FlaB)
BORRELIA GARINII NT29 IN EXPERIMENTS WITH BLOOD SERUM OF PATIENTS WITH LYME DISEASE V.S. Karavaev, I.D. Ivanov, A.V. Rjabchenko
Revealing of specific antibodies to Lyme diseasi agent in blood serum of patients is extremely im portant for confirmation of Lyme-borreliosis (LB diagnosis. In the present study results of an estima tion of immunoreactivity of recombinant protein OspC and fragment of FlaB (f-FlaB) of Western Siberian Borrelia garinii NT29 isolates are submit ted. The index of detectability of specific total an tibodies (IgM and IgG) to a combination of OspC and f-FlaB recombinant proteins, used as an antigei in ELISA, in sera samples of patients with LB ha; made 79.2%. These results allow to consider recom binant proteins OspC and f-FlaB, as perspectivi components for designing on their basis and furthe: improving of immune-enzyme assays for serodiag nosis of Lyme disease.
Литература
1. Borrelia burgdorferi sensu lato in Russia and neigh bouring countries: high incidence of mixed isolates / D Postic, E.I. Korenberg, N.B. Gorelova, et al. // Res. Micro biol. - 1997. - Vol. 148. - P. 691-702.
2. The first isolation of Borrelia burgdorferi sensu stric to in Russia / N.B. Gorelova, E.I. Korenberg, D.Postic, e al.// Mikrobiol Epidemiol Immunobiol. — 2001. — №4
- P. 10-12.
3. Detection and typing of Borrelia burgdorferi sensi lato genospecies in Ixodes persulcatus ticks in West Si beria, Russia / A.B. Beklemishev, A.B. Dobrotvorsky A.V. Piterina et al. // FEMS Microbiol Lett. — 2003. -Vol. 227. — №2. — P. 157-161.
4. Рябченко, A.B. Мониторинг зараженности кле щей Ixodes persulcatus Schulze, населяющих рекреаци онную зону Новосибирского научного центра, возбу дителями Лайм-боррелиоза человека / А.В. РябченкО А.Б. Беклемишев // Вестник НГУ. — 2006. — Т. 12. -№3-4.-С. 109-110.
5. Коренберг, Э.И. Иксодовые клещевые боррелио зы как группа заболеваний человека и главные итоги е( изучения в России / Э.И. Коренберг // Журн. инфекц патол. - 1996. - Т. 3. - №4. - С. 22-24.
6. Иванов, И.Д., А.Б. Беклемишев. Клонирование г анализ экспрессии фрагмента гена fla b новосибирскогс изолята Borrelia garinii NT29 в клетках Е. coli и иссле дование антигенных свойств рекомбинантного белк; / И.Д. Иванов, А.Б. Беклемишев // Бюлл. СО РАМН
- 2002. -№. 1,- С. 97-102.
7. Livanova, N.N. Characterization of Borrelia burgdorferi sensu lato from Novosibirsk region (West Siberia Russia) based on direct PCR / N. N. Livanova, О. V. Morozova, I. V. Morozov et al. // Europ. J. Epidemiol. — 2003 -Vol. 18.-P. 1155-1158.
8. Humoral Immune Response Associated with Lyme Borreliosis in Nonhuman Primates: Analysis by Immunob-lotting and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay with Sonicates or Recombinant Proteins / A.R Pachner, D. Dail, L. Gurey, et al. //Clin. Diagn. Lab. Immunol. — 2002.
- Vol. 9. - №. 6. - C. 1348-1355.
9. Serologic diagnosis of Lyme borreliosis by using enzyme-linked immunosorbent assays with recombinant antigens / L.A. Magnarelli, J.W. Ijdo, SJ. Padula et al. // J. of Clin. Microbiol. — 2000. — Vol. 38. — №5. — P. 1735-1739.
10. The dominant epitope of Borrelia garinii outer surface protein C recognized by sera from patients with neuroborrelioses has surface-exposed conserved structural motif / M. J. Mathiesen, A.Holm, M. Christiansen, et al. // Infec. Immunity. — 1998. — Vol. 66. — № 9. — P. 4073-4079.
11. The Borrelia burgdorferi flagellum-associated 41-kilodalton antigen (flagellin): molecular cloning, expression, and amplification of the gene / R.Wallich, S. E. Moter, M. M.Simon et al. // Infec. — Immunity. — 1990. — Vol. 58. - № 6. - P. 1711-1719.
