CC BY
20
УДК 575.22:636.26618.19-002
ОЦЕНКА ГЕНОВ bLTF, bGH и bPRL У КОРОВ ТАТАРСТАНСКОГО ТИПА НА РЕЗИСТЕНТНОСТЬ К МАСТИТУ
Макарова Н.В. - аспирант. Хасртдинов Р.А. - д.б.н., профессор, Макаров А.С. - к.в.н., доцент ФГБОУ ВО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана»
Ключевые слова: ген, лактоферрин, нролактин, соматогропин полиморфизм, аллель, генотип, резистентность, мастит.
Key words: gene, lactoferrin, prolactin, somatotropin, polymorphism, allele, genotype, resistance, mastitis.
Во всех странах мира с интенсивным молочным скотоводством большую хозяйственно-экономическую проблему представляет собой воспаление молочной железы - мастит. Мастит, остается одним из наиболее распространенных болезней вымени, несмотря на широкое внедрение в машинное доение коров современных технологий, профилактирующих это заболевание [7]. она причиняет животноводству большие убытки за счет снижения молочной продуктивности, уменьшения срока хозяйственного использования коров и снижения санитарно-технологического качества молока и молочной продукции. [1; 2; 4]. Проблема качества молока стала особенно актуальной после вступления России в Таможенный союз, ВТО и принятия Технического регламента Таможенного союза "О безопасности молока и молочной продукции" ТР ТС 033/2013 [5; 8]. С целью получения безопасной, биологически ценной и конкурентоспособной молочной продукцией были ужесточены требования к молоку по таким показателям, как количество соматических клеток и бактерий, наличие ингибирующих веществ и патогенной микрофлоры. Для успешного введения селекционно - племенной работы в условиях интенсификации производства и возрастающей конкуренции на рынке молочной продукции путем повышения качественных и количественных показателей основного сырья - молока, возникает потребность в дополнении классической селекции методами молекулярно-генетиче-ского генотипирования. которые помогут более объективно выявить животных рези-
стентных болезням вымени и обладающих повышенными производственно-технологическими свойствами молока.
В настоящее время из известных генетических маркеров в качестве потенциальных маркеров резистентности к маститу могут рассматриваться гены лакто-феррина (ЫТР), пролактина (ЬРКЛ) и частично соматотронина (ЬОН).
Лактоферрин - принадлежит к семейству железосодержащих и является многофункциональным малым гликопро-геином молока. Существуют данные о том, что он опосредованно вовлечен в процессы клеточного иммунитета и его основная функция — защита молочной железы. В связи с этим вероятна ассоциация полиморфных вариантов гена ЬРЯР с резистентностью к маститам [10; 11].
Пролактин - выполняет очень важные регуляторные функции в процессах дифференцировки эпителиальных клеток молочной железы, лакгогенеза и лактации. Анализ отмеченных функций пролактина дает основание предполагать, что этот гормон может служить потенциальным генетическим маркером молочной продуктивности. а как следствие и дополнительным критерием оценки иммунной системы молочной железы [6; 9]. Соматогропин -гормон роста является многофункциональным регулирующим полипептидом, обладающий ростостимулирующей активностью. Безусловно, он необходим, для постнатального роста и для нормализации углеводного, липидного, азотного и минерального обмена.
Установлена связь различных полиморфных вариантов гена bGH с такими хозяйственно-полезными признаками крупного рогатого скота как рост и развитие, молочная продуктивность (удой, содержание жира и белка в молоке [3j.
Материалы и методы исследований. Исследования проводили в племенном заводе «Бирюли» Высокогорского района Республики Татарстан. Для определения полиморфизма генов bLTF, bGH и bPRL и установления резистентности к маститу, было отобрано 25 коров татарстаи-ского типа, из них 13 были больны маститом и 12 здоровы, при чем они при жизни не болели маститом.Кровь для выделения ДНК отбирали из подхвостовой вены в объёме 5 мл в вакуумные пробирки с сухим ЭДТА КЗ (ООО «ГЕМ», Россия). Геномную ДНК животных выделяли из 200 мкл дельной крови с использованием набора реагентов. ПЦР проводили на программируемом термодиклере «Терцик» (Россия) в объеме 20 мкл, содержащей буфер (60 мМ трис-HCl (pH 8,5), 1,5 мМ MgCJ2, 25 мМ KCl, 10 мМ меркаптоэталол; 0,1 мМ тритон Х-100). Визуализации фрагментов ДНК проводили путем горизонтального электрофореза при 15 В/см в течение 40 мин в 1 >ТВЕ буфере. После электрофореза гель просматривали в УФ-трансиллюминаторе при длине волны 310 нм. Идентификацию генотипов определяли по количественным и качественным признакам ПЦР-1ЩРФ. Анализ локуса гена лактоферрина проводили по праймерам LTF-F: 5-GCCTCATGACAACTCCCACAC-3' и LTF-R: 5;-С AGGTTGAC АС ATCGG П GAC-3' предложенных Seyfert U.M., Kühn С., (1994), путем амплификации фрагмента гена лактоферрина длиной 301 пары нуклеотидов.
Анализ гена пролактина проводили по праймерам PRL1: 5-CGA GTC СТГ ATG AGC TTC AIT СГТ-З' и PRL2: 5-GCC TTC CAG AAG TCG ТГГ GTT ТГС-3, сконструированных Л. Dybus (2002 ) путем амплификации фрагмента гена 1 гролактина длиной 156 пары нуклеотидов. Анализ гена соматогропина проводили по праймерам GH5F: 5 -GCT GCT ССТ GAG GGC CCI ТС-3 и праймерам GH5R: 5 -СAT GAC ССТ CAG GTA CGI СТС CG-37, сконструированных D.F. Gordon et al. (1983) для амплификации фрагмента гена соматогропина длиной 211 пары нуклеотидов. Частоту генотипов лактоферрина. пролактина и соматотропина определяли по формуле определяли по формуле: р = n / N, где n -число особей, имеющих определенный генотип. N - общее число особей в популяции. Частоту отдельных аллелей определяли по формулам: рА = (2пАА+пАВ) / 2N и qB г (2nBB+nAB) / 2N. где рА - частота аллеля -А. qB - частота аллеля - В, N - общее число аллелей. Ожидаемую частоту генотипов в исследуемой популяции вычисляли по закону Харди-Вайнберга. Оценку соответствия фактического (Ф) и теоретического распределения генотипов проводили по критерию согласия Пирсона - %.
Результаты исследований. У коров татарстан ского типа локус лактоферрина обладал средним уровнем полиморфизма со значительным преобладанием аллеля А - 0,7, частота другого аллеля В составила 0,3 (табл. 1). В исследованной группе коров из возможных трех генотипов выявлены лишь два: АА и АВ. генотип ВВ не обнаружен, что возможно объясняется небольшим числом исследованных животных - 25 голов. Тем не менее группа коров находилась в генетическом равновесии, не превышал значения 3.09 (Р > 0,05).
Таблица 1 - Частота генотипов и аллелей лактоферрина у коров
Группа здоровья Рас-пре- дел. Частота генотипов Частота аллелей Х2
АА ВВ AB А И
п % n % n %
Больные, п=13 ф. 6 46.2 0 0 7 53,8 0.731 0,269 1,64
т. 6,9 53,1 0,9 6,9 5,2 40,0
Здоровые, п=12 ф. 4 33,3 0 0 8 66,7 0,666 0,333 3,09
т. 5,3 44,2 1,4 11,6 5,3 44,2
Сравнительное изучение частоты генотипов локуса ЬР'ГР у здоровых и больных маститом коров показала, что достоверных различий между ними по этому показателю не наблюдается. Однако, сле-
Локус нролактина обладал аналогичным с лактоферрином уровнем полиморфизма, у этого гормона также преобладающим аллелем был А с частотой 0.78, а аллель В имел частоту значительно ниже -0,22 (табл. 2). У пролактина в отличии от лактоферрина обнаружены все три генотипа: А А. ВВ и АВ. Коровы по этим генотипам находились в генетическом равновесии, X" не превышал значение 4.29. По локусу ЬРКХ в отличии от лактоферрина, выявлены более значительные различия между здоровыми и больными маститом животными по частоте генотипов. В этом отношении преимуществом обладал гомозиготный генотип АА, его частота была в 1,8 разы выше, чем у больных коров (46,2%), а частота гетерозигот АВ снизилась в 5,5 раза. Также значительные
Заключение. Таким образом, у коров татарстанского типа все три исследованных локуса белков оказались полиморфными: из них локусы в РТР и в РЯР обладали средним уровнем полиморфизма, а в ОН - низким. О возможной связи этих
дует отметить наличие определенной тенденции повышения частоты В аллеля и гетерозигот АВ на 24 %. Возможно присутствие В - аллеля в генотипе животных способствует их устойчивости к маститу.
различия между данными группами коров свидетельствует о том, что генотип АА пролактина обуславливает устойчивость коров к маститу. Локус соматотропина в отличии от двух предыдущих локусов обладал наименьшей степенью полиморфизма. По данному локусу коровы имели преимущественно гомозиготных генотип РР (92%), лишь у 2-х коров обнаружен гетерозиготный генотип РУ (8%). а гомозиготный генотип УУ вовсе не выявлен (табл. 3). Поэтому очень трудно судить о наличии какой-либо связи генотипов соматотропина с устойчивостью коров к маститу. Кроме того, различия между здоровыми и больными животными по частоте преобладающего генотипа РР оказались мeнee^ значительными, соответственно 100 и 84,6 %.
локусов с устойчивостью к маститу можно говорить липсь в отношении одного локуса пролактина, по которому выявлены значительные различия между здоровыми и больными животными гго частоте генотипов АА и АВ.
Таблица 2 - Частота генотипов и аллелей пролактина у коров
Рруппа здоровья Рас-пре-дел. Частота генотипов Частота аллелей Х2
АА ВВ АВ А В
п % п % п %
Больные, п=13 Ф- 6 46,2 1 7,6 6 46.2 0,692 0,308 0,33
т. 6,24 47,7 1,2 9,2 5,6 43.1
Здоровые, п= 12 ф. 10 83,3 1 8,3 1 8,3 0,875 0,125 4,29
т. 9,2 76,7 0,2 1,7 2.6 21,6
Таблица 3 - Частота генотипов и аллелей соматотропина у коров
Группа здоровья Рас- Частота генотипов Частота аллелей У?
пре- РР УУ РУ Р
дел. п % п % п % V
Больные, п=13 ф. И 1 84,6 0 0 2 15,4 0,923 0.076 0,16
т. 11.1 85.4 0.1 0.8 1.8 13.8
Здоровые, пН 2 ф. 12 100 0 0 0 0 1,0 0 0
т. 12 100 0 0 0 0
ЛИТЕРАТУРА:
1. Буйволова. Л.А. Качество сырого коровьего молока как фактор конкурент оспособносш молочных продуктов / Л.А. Буйволова, В.А. Бильков, Е.А. Дубова // Зоотехния. - 2012. - № 5. - С. 20 - 21.
2. Данкверт, А. Пути улучшения качества молока / А. Данкверт. Л. Зернаева // Молочное и мясное скотоводство. - 2003. — № 8. - С. 2-7.
3. Зиновьева Н. А., Кленовицкий П. М., Гладырь Е. А., Никишов А. А. Современные методы генетического контроля селекционных процессов и сертификация племенною материала в животноводстве: Учеб. пособие. — М.: РУДН, 2008. — 120 с.
4. Климов, Н. Т. Эффективный комплекс мероприятий в борьбе с маститом коров / Н. Т. Климов, В. А. Париков, В. И. Зимников // Современные проблемы ветеринарного обеспечения репродуктивного здоровья животньгх: материалы Междупар. науч.-практ. конф., посвящ. 100-летию со дня рождения проф. В.А. Акатова, Воронеж, 27-29 мая 2009. - Воронеж: Истоки, 2009.-С. 212-214.
5. Крикун, Т.И. Требования Технического регламента к сырому молоку / Т.И. Крикун // Молочная промышленность. — 2008.-№ 10.-С. 21-23.
6. Михайлова, М.Е. Полиморфные варианты генов соматотропинового каскада ЬРП-1 и ЬРКТ для ДПК-типировапия признаков молочной продуктивности крупного рогатого скота голштинской по-
роды / М.Е. Михайлова, Е.В. Белая // Известия национальной академии наук Белоруссии. - 2011. -№ 2. - С. 49-53.
7. Свириденко Г.М. Маститы крупного рогатого скотаТ.М. Свириденко, Е.Г. Семенова//Молочная промышленность. -2003. -№ 10. -С. 18 -20.; Черепахина Л.А., Выявление основных инфекционных агентов скрытого мастита у лактирующих коров /Зоотехния. -2008. -№ 7. -С.23.
8. Смирнов, А.В. Сравнительный анализ требований, предъявляемых к сырому молоку ФЗ РФ No 88 «Технический регламент на молоко и молочную продукцию» от 13.06.2008 с поправками от 22.03.2014 и Техническим Регламентом Таможенного Союза 033/2013 «О безопасности молока и молочной продукции» от 09.05.2014 / А.В. Смирнов // Вопросы нормативно - правового регулирования в ветеринарии.-2014.-No 2. -С. 19-22
9. Chrenek, P. Simultaneous analysis of bovine growth hormone and prolactin alleles by multiplex PCR and RFLP / P. Chrenek, D. Vasicek, M. Bauerova, J. Bulla. J. Czech // Czech J. Anim. Sci. - 1998. - V. 43, №2.-P. 53-55.
10. Schwerin M„ Toldo S. S., Eggen A., Brunner R. M., Seyfert I-I. M., Fries R. The bovine lactoferrin gene (LTF) maps to chromosome 22 and syntenic groupU12. Mammalin Genome. 1994; 5, 486489.
11. Sharifzaden A., Doosti A. Study of Lactoferrin Gene Polymorphism in Iranian Hoi stein Cattle Using PCRRFLP Technique. Global Veterinaria. 2011; 6 (6): 530-6.
ОЦЕНКА ГЕПОВ ЫЛТ, bGH и bPRL У КОРОВ ТАТАРСТАНСКОГО ТИПА НА
РЕЗИСТЕНТНОСТЬ К МАСТИТУ
Макарова Н.В., Хаертдинов P.A., Макаров A.C.
Резюме
В племенном заводе «Бирюли» у коров татарстанского типа исследовали устойчивость к маститу в зависимости от их генотипа по локусам лактоферрина (bLTF). пролактина (bPRL) и соматотропина (bGH). В результате исследований установлено, что у коров татарстанского типа все три исследованных локуса белков оказались полиморфными: из них ло-кусы в LTF и в PRL обладали средним уровнем полиморфизма, а в GH - низким. О возможной связи этих локусов с устойчивостью к маститу можно говорить лишь в отношении одного локуса - пролактина, по которому выявлены значительные различия между здоровыми и больными животными по частоте генотипов А А и AB. При этом преимуществом обладал генотип АА.
EVALUATING THE GENES OF bl.TF. bGH, and bPRL IN COWS OF ТА TARS TAN TYPE ON RESISTANCE TO MASTITIS
MakarovaN.V., Khacrtdinov R.A., Makarov A.S.
Summary
In the «Biryuli» breeding factory of Tatarstan type cows, the resistance to mastitis depending on their genotypes at the loci of lactoferrin (bPTF). prolactin (bPRP) and somatotropin (bGH) was studied. As a result of the research it was established that in the cows of the Tatarstan type all three studied loci of proteins turned out to be polymorphic: along them, loci in PTF and in PRP had an average level of polymorphism, and in GH - low one. The possible association of these loci with the resistance to mastitis can only be said about one locus - prolactin, which revealed significant differences between healthy and sick animals according ю the frequency of AA and AB genotypes. The advantage of this was the AA genotype.
УДК 639.3.043.13
ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ РЫБ ПОСЛЕ ПРИМЕНЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ КОРМОВОЙ ДОЬАВКИ
Никитина А.П. - аспирант. Коснев Н.И. - д.в.н.
ФГЬОУ ВО «Чувашская государственная сельскохозяйственная академия»
Ключевые слова: кормовая добавка, ленский осетр, темпы роста, гематологические показатели, физиологическое состояние.
Key words: feed additive, Siberian sturgeon, growth rales, hematological parameters, physiological condition.
Обеспечение населения страны экологически чистыми и полезными для здоровья продуктами питания, в том числе рыбоводства, является актуальной проблемой. Эффективность современного промышленного рыбоводства во многом зависит от свойств применяемых комбикормов. Необходимо применять комбикорма, обеспечивающие реализацию генетического потенциала продуктивности рыб, получение от них качественной продукции, благополучной в ветеринарно-са-питарном отношении. В технологии выращивания рыб индустриальным методом особо актуален вопрос использования препаратов, стимулирующих неспецифический иммунитет, способствующих повышению выживаемости и развитию устойчивости к неблагоприятным факторам различной природы. В мире такие препараты популярны и используются практически во всех отраслях животноводства, в том числе рыбоводстве.
И одним из важных направлений интенсификации рыбоводства является поиск недорогих биологически активных кормовых добавок, стимулирующих жизнеспособность, скорость роста, а также продуктивность рыб [1-4]. Показатели физиолого-иммунологического состояния организма рыб позволяют оцепить эффективность использования биогенных препаратов для повышения песпецифической резистентности [5].
В связи с вышеизложенным изучение физиолого-иммунологического СОСТОЯНИЯ организма рыб на фоне применения биогенной кормовой добавки на основе полисах аридного комплекса дрожжевых клеток, разработанной учеными Чувашской государственной сельскохозяйственной академии, является весьма актуальной проблемой. Целью нашей работы явилось научно-практическое обоснование использования биологически активной кормовой добавки в технологии выращи-
